一种化妆品的检测方法与流程

本发明涉及一种化妆品的检测方法。
背景技术：
：n-酰氨基酸是由α-氨基酸的氨基酰化后制得，酰基部分可以由单一的脂肪酸或天然脂肪酸引入，它属于阴离子表面活性剂。与传统的表面活性剂相比，n-酰氨基酸类表面活性剂不仅具有良好的水溶性、起泡性、去污性、乳化性及增稠性，而且具有低刺激性、无毒性、多功能性、良好的生物降解性和环境友好性等优点。因此，在人们更加追求安全、有效和无污染的今天，n-酰氨基酸类表面活性剂在食品、医药、护理品及化妆品等领域中的应用越来越广泛。n-酰氨基酸表面活性剂可以分为以下四类：n-酰谷氨酸、n-酰多肽、n-酰肌氨酸、n-酰牛磺酸，其中n-酰多肽由于产品颜色深、有气味、保存期限短等问题，在化妆品中的应用受到限制。其他三类在化妆品，特别是洗护产品中的应用非常广泛。还有一些n-酰氨基酸具有化妆品功效性，如十一碳烯酰苯丙氨酸，具有良好的亲肤性，它能通过竞争性结合黑色素细胞上的黑色素刺激素受体，阻断酪氨酸酶的产生，从而抑制黑色素细胞活性减少黑色素的生成，达到美白效果。二棕榈酰羟脯氨酸是化妆品中的抗衰老抗皱活性成分，它能收缩胶原纤维，保护弹性蛋白，有效清除自由基。虽然n-酰氨基酸的应用很广泛，但是对这类化合物的检测却很少见。国标gb/t5173-1995通过直接两相滴定法测定阴离子表面活性剂，滴定结果必然包括酰基氨基酸和游离羧酸杂质的总量，因此不准确。高效液相色谱技术检测月桂酰谷氨酸钠有两篇报道，其中一篇用蒸发光散射检测器(elsd)，但这种检测器并不普及。另外一篇测定原料中的月桂酰谷氨酸钠，流动相用到硫酸水溶液，浓硫酸属于易制毒试剂，管控和储存要求非常严格，使用不便。并且以上两种方法都是对化妆品原料进行检测，而针对成品检测方法未见报道。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中针对化妆品成品中酰基氨基酸的检测技术过少的缺陷，提供了一种化妆品的检测方法。本发明的检测方法主要检测化妆品中的酰基氨基酸，其流动相配制简单，避免使用管控的化学试剂；使用通用仪器设备，便于推广；检测效率高；精密度和准确性高；能够同时监控一种或多种酰基氨基酸。本发明的检测方法适用于检测各类样品包括原料和成品等，具有较强的实用性。本发明提供了一种化妆品的检测方法，其包含以下步骤：将所述的化妆品在高效液相色谱中进行梯度渐变洗脱，即可；所述高效液相色谱的固定相为c8或c18；所述的梯度渐变洗脱为一段式梯度渐变洗脱或二段式梯度渐变洗脱；当所述的梯度渐变洗脱为一段式梯度渐变洗脱时，所述高效液相色谱的流动相由流动相a渐变为0.1％磷酸甲醇溶液；当所述的梯度渐变洗脱为二段式梯度渐变洗脱时，其第一梯度中，所述高效液相色谱的流动相为流动相a；其第二梯度中，所述高效液相色谱的流动相由流动相a渐变为0.1％磷酸甲醇溶液；其中，所述的流动相a为由0.1％磷酸甲醇溶液和0.1％磷酸水溶液组成的溶液，其中，0.1％磷酸甲醇溶液的体积比例为75-85％。较佳地，所述的流动相a中，0.1％磷酸甲醇溶液的体积比例为80％。较佳地，当所述的梯度洗脱为一段式梯度渐变洗脱时，其洗脱时间为14～16min，优选15min。较佳地，当所述的梯度洗脱为二段式梯度渐变洗脱时，第一梯度的洗脱时间为6～7min，优选6.5min，第二梯度的洗脱时间为8～9min，优选8.5min。较佳地，当所述的梯度渐变洗脱为一段式梯度渐变洗脱时，其后进一步包括其它梯度渐变洗脱的步骤；更佳地，所述“其它梯度渐变洗脱”的流动相为0.1％磷酸甲醇溶液，和/或，所述其它梯度渐变洗脱的洗脱时间为4～6min，优选5min。较佳地，所述检测方法还包括化妆品的预处理过程，所述预处理为用0.1％磷酸甲醇溶液溶解所述化妆品后，过滤即可；更佳地，所述化妆品与0.1％磷酸甲醇溶液的质量体积比(g/ml)为1:500；和/或，所述过滤的方式可为本领域常规，例如经滤膜过滤，所述滤膜可为本领域常规，例如为疏水聚四氟乙烯(ptfe)滤膜，所述滤膜的孔径优选0.45μm。本发明中所述磷酸甲醇溶液的百分比是指磷酸体积占甲醇体积的百分比，所述磷酸水溶液的百分比是指磷酸体积占水体积的百分比。本发明中所述的化妆品可为以涂抹、喷洒或者其他类似方法，散布于人体表面的任何部位，如皮肤、毛发、指趾甲、唇齿等，以达到清洁、保养、美容、修饰和改变外观，或者修正人体气味，保持良好状态为目的的化学工业品或精细化工产品，例如护肤品、防晒剂、洗面奶、沐浴露、洁面乳或洁面啫喱。较佳地，所述的化妆品可包含酰基氨基酸类化合物。所述的酰基氨基酸类化合物为本领域常规，优选月桂酰谷氨酸、月桂酰谷氨酸盐、十一碳烯苯丙氨酸、十一碳烯苯丙氨酸盐、月桂酰肌氨酸、月桂酰肌氨酸盐、硬脂酰谷氨酸和硬脂酰谷氨酸盐中的一种或多种。本发明中所述月桂酰谷氨酸盐、十一碳烯苯丙氨酸盐、月桂酰肌氨酸盐和硬脂酰谷氨酸盐中的“盐”可为本领域常规的盐，例如为有机或无机盐；较佳地，所述的“盐”为钙盐、钠盐、钾盐和镁盐中的一种或多种。较佳地，所述的检测方法可用于检测酰基氨基酸类化合物。所述的酰基氨基酸类化合物可如上所述。较佳地，所述高效液相色谱的色谱柱为agilentzorbaxeclipseplusc18，4.6*150mm*5μm、athenac18-wp，4.6*250mm*5μm或athenac8，4.6*250mm*5μm，优选agilentzorbaxeclipseplusc18，4.6*150mm*5μm。本发明中，对于色谱柱的参数限定的含义为本领域常规。较佳地，所述高效液相色谱的柱温可以为本领域常规柱温，优选为30-35℃，更优选30℃。较佳地，所述高效液相色谱的检测波长本领域常规的检测波长，优选为200nm-210nm，更优选204nm。较佳地，所述高效液相色谱的流速可以为本领域常规流速，优选为0.8ml/min-1.0ml/min，更优选1ml/min。较佳地，所述高效液相色谱的进样体积为5-50μl，优选20μl。在某一方法中，上述的化妆品可替换为含有酰基氨基酸类化合物的物质，其余技术特征均如上所述。所述的酰基氨基酸类化合物可如上所述。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于：本发明所述的一种化妆品的检测方法，其流动相配制简单，避免使用管控的化学试剂；使用通用仪器设备，便于推广；检测效率高；精密度和准确性高；能够同时监控一种或多种酰基氨基酸。在本发明的某一较佳实施例中单次测定只需要20min，能够同时监控4种酰基氨基酸；4种酰基氨基酸的峰面积与质量浓度呈良好的线性关系，方法定量限为5.0～50mg/l，回收率为99.3％～106.7％，rsd≤0.5％。本发明的检测方法适用于检测各类样品包括原料和成品等，具有较强的实用性。附图说明图1为使用athenac18-wp，4.6*250mm*5um色谱柱分离混标std-3。图2为使用athenac8，4.6*250mm*5um色谱柱分离混标std-3。图3为使用agilentzorbaxeclipseplusc18，4.6*150mm*5um色谱柱分离混标std-3。图4为渐变模式1下4种酰基氨基酸混标色谱图。图5为渐变模式2下4种酰基氨基酸混标色谱图。图6为有机相同表3时的c12、c14、c16、c18羧酸混标色谱图图7为对比例1中流动相无缓冲盐分离混标std-3的色谱图。图8为对比例2中流动相缓冲盐选用醋酸铵分离混标std-3的色谱图。图9为对比例3中恒度洗脱时4种酰基氨基酸混标色谱图。图10为对比例4中突变模式下4种酰基氨基酸混标色谱图。图11为对比例5中有机相使用乙腈时的std-3色谱图。图12为对比例5中有机相使用乙腈时的c12、c14、c16、c18羧酸混标色谱图。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例1样品配制标准溶液：准确称量月桂酰谷氨酸钠1.0g，十一碳烯酰苯丙氨酸0.1g，月桂酰肌氨酸钠0.2g和硬脂酰谷氨酸钠各1.0g于500ml容量瓶中，用0.1％磷酸甲醇水溶液(％为磷酸体积占甲醇和水两者体积的百分比，其中甲醇与水的体积比为80:20)作溶剂溶解稀释至刻度摇匀作为混合标准母液。然后，分别准确移取0.5、1.0和5.0ml混合标准母液至10ml容量瓶，用0.1％磷酸甲醇(％为磷酸体积占甲醇体积的百分比)稀释至刻度并摇匀。系列标准溶液(std)浓度(mg/l)见表1。表1系列标准溶液浓度(mg/l)待测溶液的配制方法：准确称量待测样品0.2g至100ml容量瓶，用0.1％磷酸甲醇溶液(％为磷酸体积占甲醇体积的百分比)溶解稀释至刻度并摇匀，溶液经0.45μm疏水ptfe滤膜过滤后进液相色谱检测。实施例2色谱条件优化：(1)色谱柱的选择为了同时测定4种酰基氨基酸，本发明曾经对实验室里的athenac18-wp(柱长250mm)，购自上海安谱实验科技股份有限公司、athenac8(柱长250mm)，购自上海安谱实验科技股份有限公司、agilentzorbaxeclipseplusc18(柱长150mm)，购自安捷伦科技(中国)有限公司进行系统考察。使用实施例1中配制的std-3上样，使用的色谱条件如下：流动相包括a相和b相，a相为0.1％磷酸甲醇溶液(％为磷酸体积占甲醇体积的百分比)，b相为0.1％磷酸水溶液(％为磷酸体积占水体积的百分比)；采用梯度洗脱，从0到15min，a相由80％变为100％，15到20min，a相保持100％；流速为1ml/min；柱温30℃；检测波长204nm；进样量20μl。结果如图1～3所示，结果显示，三根柱子上4种酰基氨基酸的出峰顺序一致，图中标出了出峰时间的4个特征峰从左向右依次是月桂酰谷氨酸钠、十一碳烯酰苯丙氨酸、月桂酰肌氨酸钠和硬脂酰谷氨酸钠，且分离度均比较好。其中，agilentzorbaxeclipseplusc18柱的分离度最好，分析时间最短。(2)洗脱模式的选择当梯度洗脱为渐变模式时，使用按照实施例1所述配制方法配制的4种酰基氨基酸混标色谱图进行上样，使用的色谱柱为agilentzorbaxeclipseplusc18(柱长150mm)，流速为1ml/min，柱温30℃，检测波长204nm，进样量20μl，梯度洗脱程序分别如表2和3所示，所得结果如图4和5所示。图中显示，两种渐变模式所得结果均比较好，其中渐变模式2时(结果如图5所示)峰形最佳，4种酰基氨基酸月桂酰谷氨酸钠、十一碳烯酰苯丙氨酸、月桂酰肌氨酸钠和硬脂酰谷氨酸钠保留时间依次为4.3、4.9、5.5和11.6min，分离仅需12min，一个完整循环约25min。表2梯度渐变模式1(结果如图4所示)时间(min)0.1％磷酸甲醇溶液(％)0.1％磷酸水溶液(％)080206.58020151000表3梯度渐变模式2(结果如图5所示)时间(min)0.1％磷酸甲醇溶液(％)0.1％磷酸水溶液(％)08020151000故最终选用0.1％磷酸甲醇溶液(％为磷酸体积占甲醇体积的百分比)：0.1％磷酸水溶液(％为磷酸体积占水体积的百分比)-梯度渐变模式2同时检测4种酰基氨基酸。(3)考察原料中存在的羧酸是否干扰检测使用c12,c14,c16,c18羧酸混标溶液(其中羧酸混标配制方法为：准确称取月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸4种羧酸各20mg于20ml容量瓶，用乙腈溶解稀释至刻度并摇匀，作为羧酸混标溶液)和实施例1中配制的std-3进行上样，使用的色谱柱为zorbaxeclipseplusc18(柱长150mm)，流速为1ml/min，柱温30℃，检测波长204nm，进样量20μl。当流动相同表3时，原料中的月桂酸(c12羧酸)、肉豆蔻酸(c14羧酸)、棕榈酸(c16羧酸)、硬脂酸(c18羧酸)均无干扰(结果如图6所示)。(4)最终确定的色谱检测条件如下表4和5中所示：表4优化的色谱条件表5优化的梯度渐变洗脱程序时间(min)0.1％磷酸甲醇溶液(％)0.1％磷酸水溶液(％)0802015100020100020.018020实施例3检测结果(1)线性范围和定量限分别对实施例1中的系列混合标准溶液进行色谱检测(检测条件如表4和5所示)，测定结果以峰面积a对质量浓度ρ(mg/l)进行线性回归，4种酰基氨基酸在各自的线性范围内线性关系好。定量限是指逐渐稀释标准溶液至信号为周围基线10倍的浓度，结果见表6。表6回归方程、线性范围及定量限(2)回收率和精密度空白基础配方是指未添加四种酰基氨基酸的化妆品乳霜基质。准确称取12份空白基础配方0.2g(精确至0.1mg)至100ml容量瓶中，按照实施例1中所述待测溶液的配制方法配制待测溶液。其中6瓶加入10ml实施例1中所述的混合标准溶液母液，作为基质低浓度精密度待测液；另外6瓶加入50ml混合标准溶液母液，作为基质高浓度精密度待测液。稀释定容后各取20μl分别进样检测(检测条件如表4和5所示)，用标准曲线定量，进行高低两种加标浓度的回收率和精密度考察，实验结果见表7。4种酰基氨基酸的回收率均在99.3％～106.7％，rsd(相对标准偏差)≤0.5％。表7方法的回收率及精密度结果(n＝6)(3)实际样品检测选取5个洗护产品配方按照实施例1中所述待测溶液的配制方法配制待测溶液，用表4和5所述条件和方法检测，以标准溶液保留时间定性，以样品峰面积定量，具体结果见表8。表8样品测定结果表中nd表示未检出。本方法选用填料为c18或c8的色谱柱，以0.1％磷酸甲醇溶液-0.1％磷酸水溶液流动相结合梯度洗脱方式，能够较好地分离而且同时测定4种酰基氨基酸。在一定的质量浓度范围内，4种酰基氨基酸的峰面积与质量浓度呈良好的线性关系，方法定量限为5.0～50mg/l，回收率为99.3％～106.7％，rsd≤0.5％。该方法具有诸多优点：流动相配制简单，避免使用管控的化学试剂；使用通用仪器设备，便于推广；检测效率高，单次测定只需要20min；精密度和准确性高；定量限低5-50mg/l；同时监控4种酰基氨基酸；适用各类样品包括原料和成品等等。因此该方法具有较强实用性，优于目前的定氮法和滴定法，对于政府加强市场监控，以及提高企业原料和产品质控方面有很大帮助。对比例对比例1流动相1当流动相无缓冲盐，并且为乙腈和水时(流动相梯度洗脱程序见表9)，使用实施例1中配制的std-3上样，使用的色谱柱为zorbaxeclipseplusc18(柱长150mm)，流速为1ml/min，柱温30℃，检测波长204nm，进样量20μl。所得结果如图7所示。图7中标出了出峰时间的4个较高的特征峰从左向右依次为月桂酰谷氨酸钠、十一碳烯酰苯丙氨酸、月桂酰肌氨酸钠和硬脂酰谷氨酸钠，图中峰形拖尾，分离度差(结果如图7所示)。表9流动相梯度洗脱程序时间(min)乙腈(％)纯水(％)07030101000151000对比例2流动相2当流动相成盐化，用醋酸铵水时(流动相梯度洗脱程序见表10)，使用实施例1中配制的std-3上样，使用的色谱柱为zorbaxeclipseplusc18(柱长150mm)，流速为1ml/min，柱温30℃，检测波长204nm，进样量20μl。所得结果如图8所示。图8中峰形拖尾，保留时间前移，十一碳烯酰苯丙氨酸和月桂酰肌氨酸未分开(即图8中出峰时间为3.07min处的特征峰)。表10流动相梯度洗脱程序时间(min)甲醇(％)10mm醋酸铵水(％)08020151000201000对比例3恒度洗脱曾经尝试恒度洗脱，流动相为0.1％磷酸甲醇：0.1％磷酸水＝85:15，上样的样品为4种酰基氨基酸混标，使用的色谱柱为zorbaxeclipseplusc18(4.6*150mm,5um)，流速为1.0ml/min，柱温30℃，检测波长204nm，进样量20μl。结果如图9所示，图中显示，前3种分子较难分离，硬脂酰谷氨酸保留时间太久，峰形变宽不易积分，同时分析效率低。对比例4梯度洗脱时的突变模式当梯度洗脱为突变模式时，使用按照实施例1所述配制方法配制的4种酰基氨基酸混标色谱图进行上样，使用的色谱柱为zorbaxeclipseplusc18(柱长150mm)，流速为1ml/min，柱温30℃，检测波长204nm，进样量20μl，梯度洗脱程序分别如表11所示，所得结果如图10所示。比较该实施例的突变和实施例2中的渐变两种方式，可知渐变时峰形最佳。表11梯度突变模式(结果如图10所示)时间(min)0.1％磷酸甲醇溶液(％)0.1％磷酸水溶液(％)080206.580206.6100017.5100017.68020对比例5考察原料中存在的羧酸是否干扰检测使用按照实施例1所述配制方法配制的c12,c14,c16,c18羧酸混标色谱图(其中羧酸混标配制方法为：准确称取月桂酸，肉豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸4种羧酸各20mg于20ml容量瓶，用乙腈溶解稀释至刻度并摇匀，作为羧酸混标溶液)和实施例1中配制的std-3进行上样，使用的色谱柱为zorbaxeclipseplusc18(柱长150mm)，流速为1ml/min，柱温30℃，检测波长204nm，进样量20μl。当有机相用乙腈时(流动相见表12)，按表7的梯度洗脱程序，原料中的月桂酸(c12羧酸)、肉豆蔻酸(c14羧酸)、棕榈酸(c16羧酸)、硬脂酸(c18羧酸)中，仅c14羧酸与硬脂酰谷氨酸有部分干扰(详见图11和图12)。表12有机相为乙腈的洗脱程序时间(min)乙腈(％)0.1％磷酸水溶液(％)0703010100015100015.017030207030当前第1页1 2 3