基于ICP-MS的汞、砷混合暴露检测作为低出生体重辅助诊断标志物及其应用的制作方法

本发明属于分析化学及临床医学领域，涉及一种与低出生体重相关的暴露生物标志物及其检测方法和应用，该暴露生物标志物为汞、砷混合暴露，其检测方法为基于icp-ms的检测方法。

背景技术：

低出生体重是当今世界面临的一个重要的公共卫生问题。who2010年的统计数据显示：全球低体重新生儿所占比例平均为15％，最高的地区是巴基斯坦和也门，高达32％。据调查，我国新生儿低出生体重发生比例平均约4.6％，最高达到6.3％。虽然比例较低，但我国人口基数大，低出生体重儿人数不容小觑，低出生体重问题依然是制约人群健康的突出问题。出生体重是反映胎儿在宫内生长发育、营养及生存状况的一项重要指标。在发育期间，胎儿若遇到不利因素，细胞分裂速度则可能放慢，从而影响出生体重。作为一种不良妊娠结局，低出生体重提高了个体生命后期疾病发生的风险。低出生体重的新生儿往往伴随着组织器官的功能不全和身体机能的低下，不仅导致新生儿死亡率的升高，在婴幼儿时期也是造成听力、视力等感官损害、以及肺部疾病、神经系统损伤等并发症的主要因素，甚至还会引起严重的后遗症，对个体的影响贯穿了整个生命历程。同时，许多研究表明低出生体重是成年后心脑血管疾病与代谢性疾病的独立危险因素，还会增加肥胖的发生概率，以及可能增加产妇产后抑郁的风险。

汞是一种广泛存在于自然界的人体非必需元素。元素汞主要通过呼吸道被吸收,生物利用率接近100％，很难经消化道吸收，但汞盐及有机汞易被消化道吸收。汞是一种无阈值的污染物，任何浓度的汞均会造成人类或生态系统不利的损害。各种形态的汞及其化合物主要对机体造成以神经毒性和肾脏毒性为主的多系统损害，近年来，人们对汞的生殖和发育毒性日益关注。胎儿及婴幼儿各系统处于快速生长发育之中，更易受到汞的损害。胎儿期汞暴露除对子代神经发育存在毒性外，还具有心血管毒性、肾脏毒性、生殖毒性等。砷是常见的环境毒物和人类致癌物。长期以来，含砷防腐剂、杀虫剂等的大量使用，各种工业活动，如煤矿开采、化工制造等,导致人群广泛暴露于砷。研究发现，妊娠期砷暴露与低出生体重有关。高水平砷暴露对全身多系统都存在损害，研究表明砷可以通过胎盘屏障，对胎儿产生不良影响，如自然流产、死产等，即使是低水平暴露，对胎儿的生长发育也会产生一定影响。

在微量元素的检测技术中，目前可用的检测方法有原子吸收光谱(aas)法、电感耦合等离子体原子发射光谱(icp—aes)法、电感耦合等离子体质谱(icp.ms)法、同位素稀释质谱法(id-ms)、中子活化分析(1naa)法、x射线荧光分析法(xrf)、分子光谱法、生化法、电化学分析法等。电感耦合等离子体质谱(icp-ms)是用于痕量及超痕量多元素分析的质谱仪，具有灵敏度高、检出限低、选择性好、分析速度快、动态范围宽等优点，由于其多元素高通量检测的特点，因而被广泛应用于混合暴露特别是多种重金属混合暴露的检测当中。电感耦合等离子体质谱(icp-ms)具有极低检出限、动态线性范围宽、干扰少、精度高和分析速度快等优点，比其他分析技术更具优越。

现有研究表明：汞、砷的单独暴露都会对胎儿发育产生不同程度的不良影响，但汞砷混合暴露对胎儿生长发育的研究几乎没有开展。汞、砷混合暴露是否会出现协同或相加作用，使混合暴露毒性强于单独暴露，对胎儿产生更加不利的影响，目前还不得而知。因此，开发一种基于icp-ms的检测方法用于检测汞、砷混合暴露对低出生体重的影响，对提高我国儿童健康水平有着重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种与低出生体重相关的暴露生物标志物；

本发明的另一目的是该暴露生物标志物在制备检测低出生体重的辅助诊断试剂盒中的应用。

本发明的目的通过下列技术措施实现的：

与低出生体重相关的暴露生物标志物，该暴露生物标志物为汞、砷的混合物。

所述的暴露生物标志物在制备检测低出生体重的辅助诊断试剂盒中的应用。

一种用于检测低出生体重的辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有采用icp-ms检测男性全血中的汞和砷的浓度的试剂。

所述的辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有试剂a：10ml稀释剂(含0.1％v/v曲拉通+1％v/v硝酸+10ug/l锗、铋)，试剂b：铅标准曲线：浓度分别为0、0.1、0.5、1、5、10、50ug/l，试剂c：镉标准曲线：浓度分别为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5ug/l，试剂d：清洗液：2％v/v硝酸。

采用icp-ms方法检测男性全血中的汞和砷的浓度进行低出生体重的辅助诊断。

具体步骤及参数包括以下步骤：

a.icp-ms点火启动后，稳定25min-35min，泵入1ppb调谐液，根据li、in和u的灵敏度，氧化物(ceo)以及双电荷(ba²⁺)的水平，对全部质量范围(4～290amu)进行调谐并达到最佳状态。调谐要求达到以下标准：标准模式灵敏度7li≥4000cps/ppb、115in≥15000cps/ppb；238u≥20000cps/ppb；标准模式双电荷ba²⁺/ba<3.0％；标准模式氧化物156ceo/140ce<2.0％。

优化的操作参数见表1.1。

表1.1icp-ms优化的操作参数

b.仪器采集参数见表1.2。

仪器在检测样本时在动能歧视(kineticenergydiscrimination，ked)的单一碰撞池模式下运行，采用纯氦气作为碰撞气体。使用清洗液冲洗系统。

表1.2icp-ms采集参数

本发明详细描述如下：

本发明人以标准操作程序(sop)采集符合标准的男性全血样本，系统收集完整的人群基础信息和临床资料，并采用了基于icp-ms检测方法进行分析。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

一、研究对象选择和分组依据

纳入低出生体重组111人，根据母亲年龄、bmi匹配对照111人，共222人。

a组：健康对照组(111人，出生体重正常)：

1.母亲年龄在22到35岁间；

2.无高血压、糖尿病等慢性疾病；

3.无吸烟、饮酒史；

4.无女性生殖障碍有关的疾病史。

b组：低出生体重组(111人)：

1.母亲年龄在22到35岁间；

2.无高血压、糖尿病等慢性疾病；

3.无吸烟、饮酒史；

4.无女性生殖障碍有关的疾病史。

二、icp-ms检测汞、砷混合暴露与低出生体重风险的分析

1.样本前处理

取100μl全血，加入4.9ml试剂a(即稀释50倍)，充分混匀。

2.仪器检测

1)分析仪器：icaprqicp-ms(thermo)

icp-ms点火启动后，稳定约半小时。泵入1ppb调谐液，根据li、in和u的灵敏度，氧化物(ceo)以及双电荷(ba2+)的水平，对全部质量范围(4～290amu)进行调谐并达到最佳状态。调谐要求达到以下标准：标准模式灵敏度7li≥4000cps/ppb、115in≥15000cps/ppb；238u≥20000cps/ppb；标准模式双电荷ba2+/ba<3.0％；标准模式氧化物156ceo/140ce<2.0％。

icp-ms推荐参数

2)进样方式：自动进样，进样及稳定时间30s，清洗时间为30s。

3)数据处理：使用qtegra(isds)软件(赛默飞世尔科技，美国)在线对数据进行定量评估，以内标ge、bi分别用于校正汞和砷的浓度。将样品名称、待测元素名称、浓度或信号强度(countspersecond，cps)值等导出至excel表格中。

4.数据分析：

暴露水平在总样本75％分位数以上时被认为是高暴露(+)，否则为低暴露(-)。健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比采用卡方检验进行比较。

5.健康对照组、病例组全血样本中汞、砷混合暴露的差异和诊断意义。

经welch'st-test发现病例组汞和砷的暴露水平均高于对照组。卡方检验发现健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比具有显著差异，病例组的高暴露人数多于对照组，汞、砷高暴露显著提高了低出生体重的发病风险。

三、诊断试剂盒制备方法

根据上述一系列实验结果，本发明人还制备了一种能用于低出生体重的辅助诊断试剂盒，所述辅助诊断试剂盒包含测定受试者全血中稳定存在且可检测的锗和铋的标准品，诊断试剂盒还包括一套全血汞、砷检测的试剂及耗材。

基于以上，发明人将汞、砷混合暴露作为低出生体重辅助诊断标志物进行应用；建立基于icp-ms的男性全血中汞、砷混合暴露的检测方法；开发用于低出生体重辅助诊断的汞、砷混合暴露检测和辅助诊断试剂盒。

与现有技术比较本发明的有益效果：

通过采用icp-ms比较正常对照和低出生体重病例全血中的汞、砷混合暴露水平，发现了男性全血中存在可用于评估低出生体重发病风险，具有辅助诊断价值的标志物组合，以及该标志物检测的icp-ms的应用，研制出可便于临床应用的和低出生体重辅助诊断试剂盒。

本发明采用男性全血中汞、砷混合暴露水平作为低出生体重评价的标志物的优越性在于：

(1)汞、砷混合暴露是一组新型生物标志物，其与疾病结局关联强，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高低出生体重辅助诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发将为男性不育的防治开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。

(2)本发明提供的汞、砷混合暴露检测可用于低出生体重的辅助诊断，可在早期通过微创方式预测低出生体重的患病风险，从而为临床医生进一步深入检查提供依据，为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、及时采取更具个性化的防治方案提供支持，延缓和阻止疾病进展。

(3)本发明采用低出生体重病例和健康对照人群的全血样本进行验证，证明了低出生体重病例具有较高的汞、砷暴露水平，可作为标志物使用。

(4)icp-ms技术样本处理简单，仪器分析迅速准确，取样后，30分钟内可出具结果，具有较高的临床诊断实用价值。

(5)本发明样本操作步骤简单，且能防止样品污染，提高灵敏度，100ul全血样本加入配备好的稀释剂中即可上机进行分析，对环境及操作人员的要求降低。

附图说明

图1健康对照组和病例组的汞暴露水平图。

其中，箱式图的顶部和底部分别代表第七十五和第二十五百分位，箱式图的上端到下端代表第九十和第十百分位。

图2健康对照组和病例组的砷暴露水平图。

其中，箱式图的顶部和底部分别代表第七十五和第二十五百分位，箱式图的上端到下端代表第九十和第十百分位。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1研究对象选择和分组依据

本发明人从南京医科大学附属南京妇幼保健院采集符合要求的低出生体重病例及正常对照组的全血样本。出生体重正常的为对照，低出生体重的为病例。随机纳入111例病例，根据母亲年龄、bmi匹配健康对照组111人，共222人作为低出生体重汞、砷混合暴露评估的实验对象。具体的样本归类标准如下：

第一阶段关联探索阶段

纳入病例婴儿111人，根据母亲年龄、bmi匹配对照111人，共222人。

a组：健康对照组(111人，出生体重正常)：

1.年龄在22到35岁间；

2.无高血压、糖尿病等慢性疾病；

3.无吸烟、饮酒史；

4.无女性生殖障碍有关的疾病史。

b组：低出生体重组(111人)：

1.年龄在22到35岁间；

2.无高血压、糖尿病等慢性疾病；

3.无吸烟、饮酒史；

4.无女性生殖障碍有关的疾病史。

实施例2icp-ms检测汞、砷混合暴露与低出生体重风险的分析

1.样本前处理

取100μl全血，加入4.9ml试剂a(即稀释50倍)，充分混匀。

2.仪器检测

1)分析仪器：icaprqicp-ms(thermo)

2)仪器条件：icp-ms点火启动后，稳定约半小时。泵入1ppb调谐液，根据li、in和u的灵敏度，氧化物(ceo)以及双电荷(ba²⁺)的水平，对全部质量范围(4～290amu)进行调谐并达到最佳状态。调谐要求达到以下标准：标准模式灵敏度7li≥4000cps/ppb、115in≥15000cps/ppb；238u≥20000cps/ppb；标准模式双电荷ba²⁺/ba<3.0％；标准模式氧化物156ceo/140ce<2.0％。

3)icp-ms推荐参数

4)进样方式：自动进样，进样及稳定时间30s，清洗时间为30s。

5)数据处理：使用qtegra(isds)软件(赛默飞世尔科技，美国)在线对数据进行定量评估，以内标铑、铋分别用于校正汞、砷的浓度。将样品名称、待测元素名称、浓度或信号强度(countspersecond，cps)值等导出至excel表格中。

4.数据分析：

暴露水平在总样本75％分位数以上时被认为是高暴露(+)，否则为低暴露(-)。健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比采用卡方检验进行比较。卡方检验发现健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比具有显著差异，病例组的高暴露人数多于对照组，汞、砷高暴露显著提高了低出生体重的发病风险。

5.健康对照组、病例组全血样本中汞、砷混合暴露的差异和诊断意义。

经welch'st-test发现病例组汞和砷暴露水平均高于对照组。卡方检验发现健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比具有显著差异，病例组高暴露人数与对照组高暴露人数具体比例为铅高暴露2.27:1，镉高暴露：2.00:1，汞、砷均高暴露3.67:1，病例组的高暴露人数显著多于对照组，显著提高了低出生体重发病风险。

实施例3用于检测男性全血汞、砷混合暴露辅助诊断低出生体重的试剂盒制作

首先通过icp-ms的方法确定病例组全血中具有较高水平的汞、砷浓度(暴露水平在总样本75％分位数以上)，然后通过卡方检验发现健康对照组与病例组中不同暴露水平个体的构成比具有显著差异，病例组的高暴露人数多于对照组，汞、砷高暴露显著提高了低出生体重发病风险。检测汞、砷混合暴露可以用于低出生体重的辅助诊断。此试剂盒包括一批全血中汞、砷检测用试剂和耗材，其中稀释剂用于样品稀释，其中含有稳定且可检测的内标用于实验质量控制，汞和砷标准曲线浓度梯度各一条用于绘制标准曲线进行定量分析，清洗液(5％硝酸)用于容器清晰和空白对照，以及调谐液b用于仪器校准。此试剂盒的价值在于只需要80μl男性全血，即可同时检测全血中的汞、砷含量，再通过分析结果与参考值的比较评估低出生体重发生的风险或辅助诊断低出生体重，并易于进行动态监测和观察治疗效果。

具体试剂盒组成如下：

试剂a：稀释剂10ml(含0.1％v/v曲拉通+1％v/v硝酸+10ug/l铑、铋)

试剂b：铅标准曲线：浓度分别为0、0.1、0.5、1、5、10、50ug/l

试剂c：镉标准曲线：浓度分别为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5ug/l

试剂d：清洗液：2％v/v硝酸。