后置分光瞳激光共焦质谱显微成像方法与装置与流程

本发明属于共焦显微成像技术成像技术和质谱成像技术领域，将后置分光瞳激光共焦显微成像技术与质谱成像技术相结合，涉及一种后置分光瞳激光共焦质谱显微成像方法与装置，在生物医学、材料科学、物理化学、矿产、微纳制造等领域有广泛的应用前景。

背景技术：

质谱仪(massspectrometry)是将样品中的组分发生电离，使生成的不同荷质比的带电原子、分子或分子碎片在电场和磁场的作用下分别聚焦而得到按质荷比大小顺序排列的图谱仪器。质谱成像是对样品二维区域内多个微小区域分别进行质谱分析来检测特定质荷比(m/z)物质的分布。

自上世纪80年代中期基质辅助激光解吸电离这种高灵敏度和高质量检测范围生物质谱成像技术的出现，开拓了质谱学一个崭新的领域-生物质谱，促使质谱技术应用范围扩展到生命科学研究的众多领域，特别是质谱在蛋白质、核酸、糖蛋白分析等方面的应用，不仅为生命科学研究提供了新手段，而且也促进了质谱技术自身的发展。

但现有基质辅助激光解吸电离质谱仪存在以下突出问题：

1)由于利用简单的激光聚焦来解吸电离样品，因而其仍存在激光聚焦光斑大、质谱探测空间分辨力不高等问题；

2)质谱成像所需时间长，激光质谱仪聚焦光斑轴向位置相对被测样品常发生漂移问题。

而矿产、空间物质以及生物样品的“微区”形貌和完整组分信息的准确获取对于科学研究和生产检测都具有极其重要的意义。事实上，如何高灵敏地探测微区成分信息是目前矿产分析、生化检测等领域亟待研究的重要技术问题。

后置分光瞳激光共焦技术利用照明与探测光路非共路结构进行探测，不仅显著提高了光路的轴向分辨力和定焦精度，而且可以实现样品形貌的高分辨成像探测。

基于此，本发明提出一种后置分光瞳激光共焦质谱显微成像方法与装置，其创新在于：首次将具有高空间分辨能力的后置分光瞳激光共焦显微技术与质谱探测技术相融合，可实现被测样品微区高空间分辨和高灵敏形貌、组分的成像与探测。

本发明一种后置分光瞳激光共焦质谱显微成像方法与装置可为生物医学、材料科学、物理化学、矿产、微纳制造等领域的形貌、组分成像探测提供一个全新的有效技术途径。

技术实现要素：

本发明的目的是为了提高质谱成像的空间分辨能力、抑制成像过程中聚焦光斑相对样品的漂移，提出一种后置分光瞳激光共焦质谱显微成像方法与装置，以期同时获得被测对象微区形貌信息和组分信息。本发明的目的是通过下述技术方案实现的。

本发明的后置分光瞳激光共焦质谱显微成像方法，利用高空间分辨共焦显微系统的聚焦光斑对样品进行轴向定焦与成像，利用质谱探测系统对后置分光瞳激光共焦显微系统聚焦光斑解吸电离样品而产生的带电分子、原子等进行微区质谱成像，然后再通过探测数据信息的融合与比对分析继而实现被测样品微区高空间分辨和高灵敏形貌、组分的成像与探测，包括以下步骤：

步骤一、光源系统经过准直透镜准直为平行光束，平行光束通过压缩聚焦光斑系统、经分光棱镜透射、二向色镜a反射并由测量物镜聚焦到被测样品上；

步骤二、使计算机控制精密三维工作台带动被测样品沿测量面法线方向在测量物镜焦点附近上下移动，经被测样品反射光线经过二向色镜a反射形成返回光束、返回光束经过分光棱镜反射后，经后置光瞳中的收集光瞳、探测物镜、中继放大透镜，汇聚透过针孔后被光强探测器接收，经过光强信号处理器得到后置分光瞳激光共焦轴向强度曲线；

步骤三、利用后置分光瞳激光共焦轴向强度曲线能够精确定位被测样品该点轴向高度信息；

步骤四、计算机依据后置分光瞳激光共焦轴向强度曲线的“极值点”位置控制精密三维工作台带动被测样品沿测量面法线方向运动，使测量物镜的聚焦光斑聚焦到被测样品上；

步骤五、改变平行光束照明模式，激发被测样品的微区解吸电离产生等离子体羽；

步骤六、利用离子吸管将聚焦光斑解吸电离被测样品产生的等离子体羽中的分子、原子和离子吸入形成探测离子，探测离子进入质谱探测系统中进行质谱成像，测得对应聚焦光斑区域的质谱信息；

步骤七、计算机将后置分光瞳分光瞳激光共焦探测系统测得的激光聚焦光斑位置样品高度信息和质谱探测系统测得的激光聚焦微区的质谱信息进行融合处理，继而得到聚焦光斑微区的高度质谱信息；

步骤九、计算机控制精密三维工作台使测量物镜焦点对准被测样品的下一个待测区域，然后按步骤二～步骤八进行操作，得到下一个待测聚焦区域的高度质谱信息；

步骤十、重复步骤九直到被测样品上的所有待测点均被测到，然后利用计算机进行处理即得到被测样品形貌信息和完整组分信息。

本发明的后置分光瞳激光共焦质谱显微成像方法，使步骤一所述的平行光束整形为环形光束，该环形光束再经分光棱镜透射、二向色镜a反射、测量物镜聚焦到被测样品上解吸电离产生等离子体羽。

本发明的后置分光瞳激光共焦质谱显微成像方法，所述光瞳为d型后置光瞳或圆形后置光瞳；收集光瞳为d型收集光瞳或圆形收集光瞳；d型后置光瞳和d型收集光瞳共同使用；圆形后置光瞳和圆形收集光瞳共同使用。

本发明的后置分光瞳激光共焦质谱显微成像方法，压缩聚焦光斑系统用产生矢量光束的矢量光发生器和光瞳滤波器替代。

本发明的后置分光瞳激光共焦质谱显微成像装置：包括产生激发光束的光源系统、沿着光源出射方向依次放置的分光棱镜、二向色镜a，与二向色镜a反射方向相同的测量物镜、精密三维工作台，分光棱镜反射方向的后置分光瞳激光共焦测量系统，质谱仪和计算机处理系统。

本发明的后置分光瞳激光共焦质谱显微成像装置，其中后置分光瞳激光共焦探测模块，任选以下两种方式实现：

方式一，后置分光瞳激光共焦探测模块由中继放大透镜、针孔和光强探测器构成，其中针孔位于中继放大透镜的像面上。

方式二：后置分光瞳激光共焦探测模块由中继放大透镜和ccd探测器构成，其中探测区域位于ccd探测器的像面中心。

本发明的后置分光瞳激光共焦质谱显微成像装置，光源系统由脉冲激光器、聚光透镜、聚光透镜焦点处的传光光纤替代同时，在激光聚焦系统中引入出射光束衰减器，在后置分光瞳激光共焦探测系统中引入探测光束衰减器。由出射光束衰减器和探测光束衰减器构成光强调节系统，用于衰减聚焦光斑和光强探测器探测的光斑强度，以适应样品表面定位时的光强强度需求。

有益效果:

1)通过后置分光瞳激光共焦轴向强度曲线的“极值点”与高精度测量物镜的焦点精确对应这一特性，对被测样品实现精确定焦，能够抑制现有质谱仪因长时间质谱成像中聚焦光斑相对被测样品的漂移问题；

2)利用后置分光瞳激光共焦轴向强度曲线的“极值点”进行样品预先定焦，使最小聚焦光斑聚焦到样品表面，能够实现样品微区高空间分辨质谱探测和微区显微成像，有效地发挥后置分光瞳激光共焦系统高空间分辨的潜能；

3)利用压缩聚焦光斑技术，能够提高激光质谱仪的空间分辨能力；

4)由于采用分割焦斑的方法来获取信号，能够通过改变在图像探测系统探测焦面上所设置的微小区域的参数以匹配不同的样品的反射率，从而能够扩展其应用领域；还能够仅通过计算机系统软件处理即可实现对不同na值的测量物镜的匹配，而无需重新对系统进行任何硬件装调，有利于实现仪器的通用性。

附图说明

图1为本发明后置分光瞳激光共焦质谱显微成像方法示意图；

图2为本发明的实施例2的后置分光瞳激光共焦质谱显微成像方法与装置示意图；

图3为本发明的实施例3的后置分光瞳激光共焦质谱显微成像方法与装置示意图；

图4为后置分光瞳激光共焦轴向强度曲线；

其中：1-光源系统、2-准直透镜、3-平行光束、4-压缩聚焦光斑系统、5-分光棱镜、6-二向色镜a、7-测量物镜、8-样品、9-等离子体羽、10-精密三维工作台、11-d型后置光瞳、12-d型收集光瞳、13-探测物镜、14-后置分光瞳激光共焦探测系统、15-中继放大透镜、16-针孔、17-光强探测器、18-放大艾里斑、19-探测区域、20-后置分光瞳激光共焦轴向强度曲线、21-调制光束、22-探测离子、23-返回光束、24-后置分光瞳测量光束、25-衰减光束、26-光纤入射端、27-光纤出射端、28-离子吸管、29-质谱仪、30-计算机、31-矢量光发生器、32-光瞳滤波器、33-圆形后置光瞳、34-圆形收集光瞳、35-ccd探测器、36-脉冲激光器、37-聚光透镜、38-传光光纤、39-出射光束衰减器、40-探测光束衰减器。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

如图1所示，在探测物镜13光瞳面上放置d型后置收集光瞳11，光源系统1选用点光源，点光源出射的激发光束经过准直透镜2、压缩聚焦光斑系统4、分光棱镜5、二向色镜a6与测量物镜7后，会聚在被测样品8上，计算机30控制精密三维工作台10带动被测样品8在测量物镜7焦点附近上下移动，经样品反射的光线经过二向色镜a6反射、分光棱镜5反射经过d型后置光瞳11中的d型收集光瞳、探测物镜13和中继放大透镜14，汇聚透过针孔16后被光强探测器17接收，经过光强信号处理器得到后置分光瞳激光共焦轴向强度曲线20；

利用后置分光瞳激光共焦轴向强度曲线20能够精确定位被测样品8该点轴向高度信息；

改变点光源工作模式，提高照明强度，激发被测样品8的微区解吸电离产生等离子体羽9；

利用离子吸管28将聚焦光斑解吸电离被测样品8产生的等离子体羽9中的分子、原子和离子吸入形成探测粒子22，探测粒子22进入质谱探测系统29中进行质谱成像，测得对应聚焦光斑区域的质谱信息；

计算机30将后置分光瞳激光共焦探测系统测得的激光聚焦微区形貌信息、质谱探测系统29测得的激光聚焦微区的质谱信息进行融合处理，得到聚焦光斑微区的高度和质谱信息；

计算机30控制精密三维工作台10使测量物镜7对准被测样品8的下一个待测区域，然后得到下一个待测聚焦区域的高度和质谱信息；

直到被测样品8上的所有待测点均被测到，然后利用计算机30进行数据融合和图像重构处理，即可得到被测样品形貌信息和完整组分信息。

实施例2

如图2所示，后置分光瞳激光共焦质谱显微成像装置中，压缩聚焦光斑系统4由矢量光束发生系统31、光瞳滤波器32替代，d型后置光瞳11中的d型收集光瞳12可由圆形后置光瞳33中的圆形收集光瞳34替代，后置分光瞳激光共焦探测模块中的针孔16和光强探测器17可由ccd探测器35替换，其中探测区域位于ccd探测器的像面中心。

其余成像方法与过程与实施例1相同。

实施例3

如图3所示，后置分光瞳激光共焦质谱显微成像装置中，点光源由脉冲激光器36、聚光透镜37、聚光透镜37焦点处的传光光纤38替代，激光器36出射的光束经过聚光透镜37会聚，由位于聚光透镜37焦点处的光纤入射端26接收，经过传光光纤38传输后由光纤出射端27发出形成点光源；同时，在激光聚焦系统中引入出射光束衰减器39，在后置分光瞳激光共焦探测系统中引入探测光束衰减器40。由出射光束衰减器39和探测光束衰减器40构成光强调节系统，射光束衰减器43将照明光束调制为衰减光束25用于照明，用于衰减聚焦光斑和光强探测器17探测的光斑强度，以适应样品表面定位时的光强强度需求。

其余成像方法与过程与实施例1相同。

以上结合附图对本发明的具体实施方式作了说明，但这些说明不能被理解为限制了本发明的范围。本发明的保护范围由随附的权利要求书限定，任何在本发明权利要求基础上的改动都是本发明的保护范围。