一种水体环境DNA智能采集装置及采集方法与流程

本发明属于环境dna检测技术领域，更具体地说，涉及一种水体环境dna智能采集装置及采集方法。

背景技术：

物种分布，物种丰富度情况都是淡水生态系统物种多样性研究的主要问题，这些对于实施生物多样性保护措施起到至关重要的作用。从物种生存环境中获取dna反映物种分布，丰度等信息，是一种非侵入，快速的物种检测手段。随着高通量测序技术的快速发展，基于环境dna和分子生物学技术(edna宏条形码技术)的物种多样性研究方法开始越来越多的应用到水生态健康评价中，显著提高了我们对生态系统物种多样性的认识水平。比如ficetda等研究者(speciesdetectionusingenvironmentaldnafromwatersamples[j]biollett,2008,4(4):432-435)就曾成功利用环境dna检测方法，检测了天然池塘中入侵物种美国牛蛙的存在情况。

众所周知，分析过程的误差可以通过技术进步逐渐降低，但采样技术在很长一段时期内长进不足，因此分析测定最终结果的总误差常常是来自采样过程。与传统生物多样性调查的获取生物个体样本的取样方式不同，dna宏条形码技术需要快速获取受纳水体中的总环境dna，因此，要获得正确的、可靠的分析结果，所采样品的代表性、准确性以及完整性成为了水环境dna监测的首要问题。正确选择采样方法和装置，改进采样技术，对于提高分析监测质量是极其重要的。反之，如果采样失误，后续的分析过程将丧失意义，甚至造成巨大浪费。

传统的样品采集方法以人工采集为主，后续在实验室中进行脱水处理以获得环境dna采集样品，比如中国实用新型专利，授权公告号：cn203811429u，授权公告日：2014.09.3，公开了一种用于急流水体中浮游生物定性样品采集的网具，包括袋状的网体，网体的前端敞口末端设有阀门，网体的中部设有中空的管箍，管箍将网体分为漏斗状的网身和位于网身后方且与网身导通的网肚，可广泛用于浮游生物样品采集领域。但是，该方法具有以下明显缺陷：(1)人工操作，效率低下：受水体沿岸、船只等约束大，采样范围有限，样品代表性差；且花费太多人力、物力，工作效率低；(2)采样位置难以准确控制：受水流影响，浮游生物网取样时极易漂离取样点，以及船只等众多因素影响，对于某些水域无法进行船只采样；(3)滤水量的计算误差较大：由于浮游生物网采样深度的变化，根据钢丝绳释放长度、采样角度以及采样时间估算出的滤水量存在较大误差，而以该滤水量计算出的浮游植物生物密度与实际情况不符；(4)水环境样品极易发生变化，从采集到分析测定这段时间内，由于环境条件的改变，生物在水体中的新陈代谢活动、化学作用以及物理作用的影响，会引起所采集样品的变化，引起环境dna的变化甚至是降解，进而影响物种的检测率，同时，也会影响物种分布等检测结果。并且这些变化是很快的，因此，必须采取必要的保护措施对样品进行保存。虽然edna宏条形码技术作为新兴的环境监测手段极大的提高了环境监测的效率和准确性，但是传统的生物采样方法并不满足这种新型监测技术的需求，也限制了该方法在环保系统的大规模推广应用。因此，进行水体环境采样时，进行采样质量的保证与控制是非常必要的。比如中国实用新型专利，申请日：2016.05.25，申请号：201620486713.8，公开了一种水体环境dna采样装置，包括防护罩、抽拉杆、抽水机及与之连接的抽水管道，抽水管道的另一端安装有滤纸，滤纸通过固定环固定，固定环还包括多个用于罩住滤纸的扇叶，多个扇叶配合形成圆形，扇叶的其中的一个角与固定圈轴连接，扇叶的边缘还通过连接管连接到防护罩；所述防护罩包括底部的项圈和活动支杆，项圈安装在抽水管道上，活动支杆与撑杆连接，该实用新型可完成水体环境dna的现场采集工作，无需后续繁重的过滤操作，省时省力，但是仍然存在，无法进行定量采集，滤水量误差大，尤其是设备在使用过程中，容易发生阻塞，轻则影响正常使用，重则损坏管路

另外，值得指出的是，物种丰富度的考察基于环境dna浓度，环境dna浓度受dna的释放和降解过程的影响，同时环境dna提取方法和水样本体积也会影响环境dna浓度。edna宏条形码技术主要是通过获取受纳水体中的浮游生物(包括植物体、动物体、微生物体以及不同尺寸的生物体)、水样中的悬浮颗粒物等为基础，来检测环境dna，因此，若想最真实的反应相应水体环境中的dna，必须要保证所采集样品的真实有效性。

为将上述变化降低到最低程度，一般会对样品采取一定的保护措施，比如采取冷藏、冷冻的措施或者添加稳定剂等；然后，尽可能地缩短运输时间、尽快分析测定。比如中国发明专利，授权公告日2018.07.17，授权公告号cn105636937b，公开了一种用于保存生物样品的稳定剂，使用时，将稳定剂与生物样品按一定配比混合，利用该稳定剂可以在非冷冻条件下长时间保持生物样品的完整性和稳定性；但是仍然存在所加入的稳定剂干扰监测项目测的风险。

因此，开发环境dna样品采集设备，改进现有采样技术，提高采样效率，减少采样过程中的影响干扰因素，降低环境dna提取方法和水样本体积对环境dna的影响因素，对于提高水体环境物种丰富度的分析监测质量就显得及其重要。

技术实现要素：

1.要解决的问题

针对现有水体环境生物样品采样过程效率低下，滤水量计算误差大，采集过后，生物样品易发生变化，以及现有采样设备易因阻塞，造成管路损坏的问题，本发明提供一种水体环境dna智能采集装置及采集方法，该装置可作便携式定量富集和取样使用，也可配合无人船或者无人机等载体设备使用，能够极大的降低人工强度，提高样品准确性与代表性。

2.技术方案

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种水体环境dna智能采集装置，包括智能控制机构以及采样主体机构，所述的采样主体机构包括样品采集单元、泄压单元以及水排空单元；

所述的样品采集单元包括水泵、收集器以及流量计，所述的水泵一端与外部水体连接，另一端与收集器的进水口相连接；所述的流量计与收集器的出水口相连接；

所述的水排空单元包括进气管道以及真空泵，所述的进气管道一端与收集器的进水口相连接，另一端与外部大气相通；所述的真空泵一端与流量计相连接，另一端与外部环境相连接；

所述的泄压单元包括泄压阀，所述的泄压阀设置在水泵与收集器之间，并与外部大气连通；

所述的智能控制机构包括主控板以及与主控板相连接的gps定位块，所述的主控板用以控制采集单元以及水排空单元的开启或关闭，并接收gps定位块的定位信息。

优选地，所述的采样主体机构还包括三通阀，所述的三通阀的第一进口与外部水体连接；所述的三通阀的出口与水泵相连接；所述的三通阀的第二进口与水排空单元的进气管道相连接。

优选地所述的样品采集单元还包括粗过滤器、电磁阀ⅱ以及单向阀；所述的粗过滤器设置在三通阀的第一进口管道上，且粗过滤器与三通阀第一进口之间的管道上设有电磁阀ⅱ；所述的单向阀与真空泵呈并联状，连接于管路中。

优选地，所述的水排空单元还包括电磁阀ⅰ所述的电磁阀ⅰ位于进气管道上。

优选地，所述的收集器为富集收集器用于水样生物富集，所述的富集收集器内设置有过滤膜；所述的收集器也可以为收集瓶，用于采集水样。

优选地，所述的富集收集器包括上座体、中座体以及下座体；所述的上座体与中座体卡合连接形成上腔室；所述的中座体与下座体卡合连接形成下腔室，上下腔室之间安装有过滤膜。

所述的中座体数量可以为一个及以上，相邻中座体之间卡合连接，并安装有不同孔径的过滤膜；所述过滤膜的过滤孔径为0.2～200微米。

当有多个过滤膜时，所述的过滤膜的孔径在进水方向上从大到小依次递减。

优选地，所述的智能控制机构还包括分别与主控板相连接的供电系统、显示屏以及手控板；所述的显示屏显示装置的实时运行参数；所述的手控板用于向主控板进行参数预设；

所述的智能控制机构还包括无线控制板以及与无线控制板无线连接的遥控器，所述的无线控制板同时与主控板以及gps定位块相连接，所述的遥控器通过无线控制板对主控板输入控制指令。

所述主控板与供电系统、显示屏以及手控板连接；能实时读取手控板设定参数，计算转换成分别控制系统如泵和阀等动作及运行状态；同时将运行状态反向通过显示单元显示。

优选地，所述的水体环境dna智能采集装置，可通过多个电磁管路切换，实施多管路水样生物富集或水样采集。.

一种水体环境dna智能采集方法，包括如下步骤：

a.搭建上述的一种水体环境dna采集装置；

b.参数预设：利用手控板对主控板进行装置运行时的采样参数预设；

c.样品采集：将采集装置放置到采集地点后，启动系统，主控板根据指令参数，发出指令，控制采样单元工作，电磁阀ⅱ与水泵开启，在水泵的驱动下，水样进入收集器，进行样品采样；此时水排空单元与泄压单元处于非工作状态；水样中的水体生物样品富集到富集收集器内；多余水体流经流量计，通过单向阀排出装置，流量计实时累计读取装置内部过水量，并将信号输送至主控板，当过水量与预设流量参数一致时，采集单元工作结束；主控板控制水排空单元工作，对富集样品的水排空，水排空完成后，水体生物样品采集完成；

d.水排空：采集单元工作结束后，主控板控制水排空单元工作，真空泵开启，用以排空富集收集器内的残余液体，水排空完成后，一个工作过程结束，通过更换收集器即可进行下一次取样；

e.泄压：若在样品采集过程中发生堵塞现象，则会造成管路压力过大，此时，如管路压力大于泄压阀的临界压力值，泄压阀将自动打开，形成液体流通管路，调节管路压力，有效的保护装置。

本发明装置的工作原理如下：

参数预设：利用手控板对水体总流量参数v1、水排空运行时间等参数进行设置并传输到主控模块上；

样品采集：采集装置到达采集地点后，利用遥控装置输出启动命令，由无线信号收发器发出，无线控制板上的无线通信模块接收信号并反馈给主控板，主控板控制电磁阀ⅱ与水泵开启，在水泵的驱动下，水体通过粗过滤器进入管道，经过电磁阀ⅱ、三通阀以及水泵进入收集器，水体中的生物样品富集到过滤膜上，多余残夜流经流量计，通过单向阀排出装置；此过程中，流量计实时累计读取装置装置内部过水量t2，并将信号输送至主控板，当过水量v2与总流量参数v1一致时，主控板输出信号，控制关闭电磁阀ⅱ以及水泵；

水排空：随后，主控板输出信号，控制打开电磁阀ⅰ，并启动真空泵，进行延时运行排空，在真空泵的负压吸附作用下，外部大气经由进气管被吸入，依次经过电磁阀ⅰ、水泵、收集器、流量计以及真空泵，最后排出装置，使收集器内的残余液体排空，水排空运行时间到达后，系统自动停止；此时，一个样品采集工作过程结束，通过更换收集器进行下一次取样即可；

泄压：若在样品采集过程中发生堵塞现象，管路不畅，则会造成管路压力过大，此时，(如管路压力大于泄压阀)的临界压力值，泄压阀将自动打开，形成液体外排的流通管路，调节管路压力，有效的保护装置；

装置运行过程中，主控板读取设定参数转换成信号，实时控制管路各部件的动作及运行状态，同时将读取到的参数与设定值比较计算，反向通过显示装置显示出来，是智能控制的核心处理单元；供电系统用以提供电能，手控板用以对主控板进行参数预设，无线控制板用于主控板与遥控器之间的信号传递作用，显示屏上显示设备的实时运行参数；gps定位板用来实时定位，并反馈给主控板与遥控器，在显示屏以及遥控器显示屏上进行显示。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明所提供的水体环境dna智能采集装置及采集方法，集智能控制、样品采集、残夜排空以及管路堵塞泄压保护功能于一体，具有如下效果：

①通过单片机智能程序控制，能够根据预设参数自动运行，实现精确采样，装有gps系统，可以实现精准定位采样自动化程度高，避免人员依靠机动船前往采样区域，采样效率快，且节省人力、物力成本；

②样品采集过程中，流量计置于收集器之后，能够实时累计读取过水量，达到预设水量参数后，自动停止采样，实现对取样水量的精确控制，克服了现有技术滤水量误差较大的问题，真正的实现了水环境dna的精确定量富集和采样功能样，提高了浮游生物密度的计算精度，使所取样品更加贴近实际情况，有利于提高样品的准确性以及代表性；

③样品采集完成后，通过水排空单元能够最大限度地排空富集收集器内的残余液体，避免从采集到分析测定这段时间内，在残余水液存在情况下，由于环境条件的改变，生物在水体中的新陈代谢活动、化学作用以及物理作用的影响，所引起的环境dna的变化甚至是降解，进而影响物种的检测率，最大限度的保证了样品的时效性，使得检测水样的环境更接近自然环境；

④发明所提供的水体环境dna采集装置，通过正压过滤与负压吸附的结合，真正的实现了现场原位富集；

⑤在水体生物样品采集的现有技术中，因收集过滤装置多设有过滤孔径的限制，很容易发生装置堵塞现象，此时，如不能得到及时的处理，将会损坏甚至损毁设备；本发明所提供的水体环境dna采集装置，设有泄压功能，若在样品采集过程中发生堵塞现象，造成管路压力大于泄压阀的临界压力值，泄压阀将自动打开，形成液体流通管路，调节管路压力，有效的保护装置。

(2)本发明所提供的水体环境dna智能采集装置及采集方法，富集收集器设有多层级过滤膜，将生物水体样品直接固定在过滤膜上，工作段完全处于真空状态，无需采集大量水样带回实验室，进行后期水体生物样品分离，避免了后期水体样品分离操作过程可能带来的污染，使水体生物样品尽可能处于采集的原始状态中，样品处理的可信度得到大大增加；

富集收集器同时增设多组多层级过滤膜，过滤膜按照从进水到出水的方向，孔径从大到小依次递减，可以实现不同规格粒度等级的过滤，并能使水样最大限度地通过收集器，提高工作效率、避免堵塞。

(3)本发明所提供的水体环境dna智能采集装置及采集方法，配有无线遥控设备，可用于固定或者远距离遥控取样，自动化程度高，简单易用，采样效率高，可靠性好。

附图说明

图1为本发明装置的整体结构主视图；

图2为本发明装置的遥控器结构示意图；

图3为富集收集器的整体结构示意图；

图4为富集收集器的中座体结构示意图；

图5为采样收集器的收集瓶示意图；

图中：1、箱体；2、电磁阀ⅰ；3、电磁阀ⅱ；4、收集器；410、上座体；420、中座体；421、凸台；422、过水孔；423、凹槽；430、下座体；440、过滤膜；450、进水口；460、出水口；5、流量计；6、真空泵；7、进水管；8、粗过滤器；9、单向阀；10、主控板；11、手控板；111、手控按钮；12、gps定位块；13、无线控制板；14、天线；15、供电系统；16、显示屏；17、遥控装置；171、无线信号收发器；172、遥控显示屏；173、操控按钮；18、水泵；19、泄压阀；20、三通阀。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

需要说明的是，当元件被称为“固设于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件；当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件；本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明；本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1

如图1所示，一种水体环境dna智能采集装置，包括箱体1以及位于箱体1内部的智能控制机构以和采样主体机构；所述的采样主体机构包括样品采集单元、泄压单元、水排空单元以及三通阀20；

本实施例中智能控制机构包括主控板10以及与主控板10相连接的gps定位块12，与主控板10相连接的供电系统15、显示屏16以及手控板11，与无线控制板13无线连接的遥控器17；所述的主控板10用以控制采集单元以及水排空单元的开启或关闭，并接收gps定位块12的定位信息。所述的手控板11通过手控按钮111用以对主控板10进行参数预设，所述的显示屏16显示主控板10的运行参数；所述的手控板11用于向主控板10进行参数预设，所述的遥控器17通过无线控制板13对主控板10输入控制指令过遥控器17实现远距离实时遥控设备的启动与停止。

进一步的，本实施例中的遥控装置，设有无线信号收发器171、遥控显示屏172以及操控按钮173，通过操控按钮173输入指令，指令由无线信号收发器171传送给无线控制板13，遥控显示屏172与显示屏16同步，显示装置当前的运行参数。

本实施例中的样品采集单元包括水泵18、收集器4、流量计5、粗过滤器8、电磁阀ⅱ3(本实施例中的电磁阀ⅱ3为常闭电磁阀：型号：德力西2w系列电压：24伏)以及单向阀9，所述的粗过滤器8设置在三通阀20的第一进口管道上，且粗过滤器8与三通阀20第一进口之间的连接管道上设有电磁阀ⅱ3；所述的三通阀20的出口与水泵18的一端相连接；水泵18的另一端与收集器4的进水口450相连接，所述的流量计5一端与收集器4的出水口460相连接；所述的主控板10与水泵18以及电磁阀ⅱ3连接，用以控制二者的开启与关闭；当遥控器17通过无线控制板13对主控板10输入启动指令后，主控板10控制水泵18以及电磁阀ⅱ3开启，在水泵18的驱动下，水体通过粗过滤器8进入管道，经过电磁阀ⅱ3、三通阀20以及水泵18进入收集器4，水体中的生物样品富集到过滤膜440上，多余残夜流经流量计，通过单向阀9排出装置；此过程中，流量计5实时累计读取装置内部过水量t2，并将信号输送至主控板10，当过水量v2与总流量参数v1一致时，主控板输出信号，控制关闭电磁阀ⅱ3以及水泵18。

本实施例中的水排空单元包括进气管道、位于进气管道上的电磁阀ⅰ2(本实施例中的电磁阀ⅰ2为常闭电磁阀：型号：德力西2w系列电压：24伏)以及真空泵6，所述的进气管道一端与外部大气相通，另一端通过三通阀20的第二进口与收集器4的进水口450相连接；所述的真空泵6一端与流量计5相连接，另一端与外部环境相连接；所述的真空泵6与单向阀9呈并联状，连接于管路中；主控板10与真空泵6以及电磁阀ⅰ2相连接，用以控制二者的开启与关闭；当采样结束后，主控板10输出信号，控制打开电磁阀ⅰ2，并启动真空泵6，进行延时运行排空，在真空泵6的负压吸附作用下，外部大气经由进气管被吸入，依次经过电磁阀ⅰ2、水泵18、收集器4、流量计5以及真空泵6，最后排出装置，使收集器4内的残余液体排空，水排空运行时间到达后，系统自动停止；此时，一个样品采集工作过程结束，通过更换收集器4进行下一次取样即可；

本实施例中的泄压单元包括泄压阀19，泄压阀19设置在水泵18与收集器4之间，并与外部大气连通；平时泄压阀19处于常闭状态，若在样品采集过程中发生堵塞现象，管路不畅，则会造成管路压力过大，此时，如管路压力大于泄压阀19)的临界压力值，泄压阀19将自动打开，形成液体外排的流通管路，调节管路压力，有效的保护装置；

本实施例中收集器可以为富集收集器，用于水样生物样品富集，主要收集浮游生物、水样中的悬浮颗粒物等；所述的富集收集器包括上座体410、中座体420以及下座体430；进水口450位于上座体410顶端，上座体410的下部为腔体，腔体外侧壁设有凸台；所述的中座体420分为上腔体与下腔体，上腔体内壁设有凹槽423，下腔体外侧壁设有凸台421，上下腔体中间设有过水孔422；所述的下座体底部设有出水口460，腔体内侧壁设有凸台；上座体410通过其腔体外侧壁凸台与中座体420上腔体内壁凹槽423卡合连接形成上腔室，所述的中座体420通过其下腔体外侧壁凸台421与下座体430腔体内壁的凹槽卡合连接形成下腔室；所述的中座体420与上座体410之间，中座体420与下座体430之间，均安装有密封圈以及过滤膜440；中座体420数量可以按需求增减，设置为一个及以上，相邻中座体420之间卡合连接，中并安装有密封圈以及不同孔径的过滤膜440；所述过滤膜440的过滤孔径为0.2～200微米；所述的过滤膜440在进水口450到出水口460的排布方向上，孔径从大到小依次递减。

水体流经富集收集器后，水体中的生物样品富集在过滤膜440上，富集完成后，打开收集器4，用无菌镊子夹出过滤膜440，装入事先准备好的无菌离心管中(离心管体积2-10毫升均可)，存储(可选择冷冻储存和室温储存)。值得说明的是，本实施例中的收集器4也可以选用收集瓶，进行水样收集，用于核酸的提取，包括dna、rna以及环境污染物的分析。

此发明装置配合遥控装置如无人船、无人机使用时，其功能发挥尤为突出，尤其通过gps定位块12可实时定位设备。在一些特定环境通过载体(无人船无人机)将装置遥控到采集点后，因为远距离人为难以查看到其运行状态和具体位置。该装置通过设定的gps定位功能，能实时确认位置，同时通过无线模块能实时控制装置的运行和显示状态)，且通过遥控器17实现远距离实时遥控设备的启动与停止。

当然，上述说明并非对本发明的限制，在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。

实施例2

本实施例中的一种水体环境dna智能采样方法具体的步骤如下：

a.搭建一种如权利要求1～8所述的一种水体环境dna采集装置；

b.参数预设：利用手控板11对主控板10进行装置运行时的采样参数预设；

c.样品采集：将采集装置放置到采集地点后，启动系统，主控板10根据指令参数，发出指令，控制采样单元工作，电磁阀ⅱ3与水泵18开启，在水泵18的驱动下，水样进入收集器4，进行样品采样；此时水排空单元与泄压单元处于非工作状态；水样中的水体生物样品富集到富集收集器内；多余水体流经流量计5，通过单向阀9排出装置，流量计5实时累计读取装置内部过水量，并将信号输送至主控板10，当过水量与预设流量参数一致时，采集单元工作结束；主控板10控制水排空单元工作，对富集样品的水排空，水排空完成后，水体生物样品采集完成；

d.水排空：采集单元工作结束后，主控板10控制水排空单元工作，真空泵6开启，用以排空富集收集器内的残余液体，水排空完成后，一个工作过程结束，通过更换收集器4即可进行下一次取样；

e.泄压：若在样品采集过程中发生堵塞现象，则会造成管路压力过大，此时，如管路压力大于泄压阀19的临界压力值，泄压阀19将自动打开，形成液体流通管路，调节管路压力，有效的保护装置。

本实施例中的采样方法，采样精确，自动化程度高，采样效率快，节省人力、物力成本。采集过程中，能够实时累计读取过水量，达到预设水量参数后，自动停止采样，实现对取样水量的精确控制，克服了现有技术滤水量误差较大的问题，真正的实现了水环境dna的精确定量富集和采样功能样，提高了浮游生物密度的计算精度，使所取样品更加贴近实际情况，有利于提高样品的准确性以及代表性；

样品采集完成后，通过水排空功能，能够最大限度地排空残余液体，避免从采集到分析测定这段时间内，在残余水液存在情况下，由于环境条件的改变，生物在水体中的新陈代谢活动、化学作用以及物理作用的影响，所引起的环境dna的变化甚至是降解，进而影响物种的检测率，最大限度的保证了样品的时效性，使得检测水样的环境更接近自然环境。

以上所述实施例仅表达了本发明的某种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制；应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围；因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。