一种L-2-氨基-5-胍基戊酸对映异构体的检测方法与流程

本发明属于食品和药物分析
技术领域：
，具体涉及一种l-2-氨基-5-胍基戊酸对映异构体的检测方法。
背景技术：
：l-2-氨基-5-胍基戊酸(cas登录号为74-79-3)属于氨基酸类化合物，具有重要的生理功能，常作为营养补充剂，也是氨基酸胶囊和输液的重要成分。l-2-氨基-5-胍基戊酸可有效提高免疫力、促进免疫系统分泌内生性物质，有利于对抗癌细胞及预防病毒感染；有利于严重外伤、烧伤等需要大量组织修护患者的康护。临床上，l-2-氨基-5-胍基戊酸适用于血氨增高的肝昏迷，特别是伴有碱中毒的患者；用于辅助测定脑垂体功能；用于精液分泌不足和精子缺乏引起的男性不育症；用于婴幼儿补充l-2-氨基-5-胍基戊酸缺乏等，具有广泛的应用。目前，l-2-氨基-5-胍基戊酸主要采用微生物发酵法生产，微生物代谢过程中会产生少量的l-2-氨基-5-胍基戊酸对映异构体(图1)，即d-2-氨基-5-胍基戊酸。由于l-2-氨基-5-胍基戊酸与其对映异构体的性质及其接近，在l-2-氨基-5-胍基戊酸的分离纯化过程中，其对映异构体难于清除(图2)，易于残留于l-2-氨基-5-胍基戊酸原料中，影响产品质量。现行各国药典均没有收载l-2-氨基-5-胍基戊酸的对映异构体查项。因此，如何分析及制备l-2-氨基-5-胍基戊酸及其对映异构体，控制d-2-氨基-5-胍基戊酸杂质含量，进而确保l-2-氨基-5-胍基戊酸质量显得尤为重要。然而，对于2-氨基-5-胍基戊酸两种对映异构体分析分离方法未见相关报道。其中可能主要涉及l-2-氨基-5-胍基戊酸与其对映异构体衍生物的分离度、作为杂质的对映异构体的检测灵敏度、l-2-氨基-5-胍基戊酸对对映异构体检测的干扰等诸多问题。因此，如何建立一种能够简单、快速、高效的分析分离2-氨基-5-胍基戊酸两种对映异构体的方法，进而实现对l-2-氨基-5-胍基戊酸原料药的质量进行全面检测和控制，是目前需要解决的技术问题。技术实现要素：针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种l-2-氨基-5-胍基戊酸对映异构体的高效液相色谱检测方法，为l-2-氨基-5-胍基戊酸的质量标准制定提供依据，以便更好控制产品质量，确保食用和药用安全。实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种l-2-氨基-5-胍基戊酸对映异构体的检测方法，采用柱前衍生高效液相色谱法：1)柱前衍生：分别取系统适用性溶液、对映异构体对照品溶液和供试品溶液适量，并各加入等体积的衍生化试液得到柱前衍生体系，混匀，室温放置衍生40～180min，即得到各溶液的衍生化溶液；所述系统适用性溶液为l-2-氨基-5-胍基戊酸与对映异构体对照品加稀释液溶解制成的混合溶液，其中l-2-氨基-5-胍基戊酸的浓度范围为0.2～1.0mg/ml，对映异构体的浓度范围为10～30μg/ml；所述对映异构体对照品溶液为l-2-氨基-5-胍基戊酸对映异构体对照品加稀释液溶解制成的溶液，其浓度范围为0.5～5μg/ml；所述供试品溶液为l-2-氨基-5-胍基戊酸原料加稀释液溶解制成的溶液，其浓度范围为0.1～3.0mg/ml；所述衍生化试液为溶有2,3,4,6-四-o-乙酰基-β-d-吡喃葡萄糖基异硫氰酸酯的乙腈溶液，其浓度范围为1～5mg/ml；2)系统适用性试验：取步骤1)制备的系统适用性溶液的衍生化溶液进行高效液相色谱分析，l-2-氨基-5-胍基戊酸对映异构体衍生物峰与相邻峰的分离度应符合要求，理论板数按l-2-氨基-5-胍基戊酸对映异构体峰计算不低于3000；3)l-2-氨基-5-胍基戊酸对映异构体的测定：分别取步骤1)制备的供试品溶液的衍生化溶液和对映异构体对照品溶液的衍生化溶液进行高效液相色谱分析，记录色谱图，按外标法以峰面积计算对映异构体的含量。优选的，所述高效液相色谱分析条件为：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以浓度为5～20mmol/lph值2.5～3.2的磷酸盐溶液为流动相a，以甲醇为流动相b；流速为0.8～1.2ml/min；洗脱方式为梯度洗脱；检测波长为245～255nm；柱温为20～35℃；进样量为2～20μl。优选的，所述稀释液是体积比为50:50:0.2～0.6的乙腈、水和二乙胺的混合溶液，所述二乙胺还可以是三乙胺。优选的，所述供试品溶液的柱前衍生体系中l-2-氨基-5-胍基戊酸与2,3,4,6-四-o-乙酰基-β-d-吡喃葡萄糖基异硫氰酸酯的质量比为0.05～0.85：1。优选的，所述按外标法以峰面积计算对映异构体的含量，对映异构体对照品峰面积需乘以校正因子1.25～1.35。优选的，所述磷酸盐为磷酸二氢钾。优选的，l-2-氨基-5-胍基戊酸对映异构体的检测方法，具体步骤包括：1)系统适用性溶液的制备：以稀释液为溶剂，将l-2-氨基-5-胍基戊酸及其对映异构体对照品分别配制成浓度为0.5mg/ml和15μg/ml的溶液，作为系统适用性溶液；2)对映异构体对照品溶液的制备：以稀释液为溶剂，将l-2-氨基-5-胍基戊酸对映异构体对照品配制成浓度约为1.5μg/ml的溶液，作为对映异构体对照品溶液；3)供试品溶液的制备：精密称取l-2-氨基-5-胍基戊酸待测样品，以稀释液为溶剂配制成浓度为0.1～2.0mg/ml的溶液，作为供试品溶液；4)衍生化试液的制备：称取衍生试剂2,3,4,6-四-o-乙酰基-β-d-吡喃葡萄糖基异硫氰酸酯加乙腈溶解配制浓度为2.4mg/ml的溶液，作为衍生化试液；5)分别取系统适用性溶液、对映异构体对照品溶液和供试品溶液各100μl，再各加入等体积衍生化试液，混匀，室温放置衍生40～180min，即得到各溶液的衍生化溶液；6)色谱条件与系统适用性试验：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以0.01mol/l磷酸二氢钾溶液(ph值2.5～3.2)为流动相a，以甲醇为流动相b；流速为每分钟0.8～1.2ml；洗脱方式为梯度洗脱；检测波长为245～255nm；柱温为20～35℃；进样量为2～20μl；取步骤5)制备的系统适用性溶液的衍生化溶液进行系统适用性试验，l-2-氨基-5-胍基戊酸对映异构体衍生物峰与相邻峰的分离度应符合要求，理论板数按l-2-氨基-5-胍基戊酸对映异构体峰计算不低于3000；7)l-2-氨基-5-胍基戊酸对映异构体的测定：取步骤5)所制备的对映异构体对照品溶液的衍生化溶液及供试品溶液的衍生化溶液各2～20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算对映异构体的含量，对映异构体对照品峰面积需乘以校正因子1.25～1.35。进一步，l-2-氨基-5-胍基戊酸对映异构体的检测方法，其优化的步骤包括：1)系统适用性溶液的制备：以稀释液为溶剂，将l-2-氨基-5-胍基戊酸及其对映异构体对照品分别配制成浓度为0.5mg/ml和15μg/ml的溶液，作为系统适用性溶液；2)对映异构体对照品溶液的制备：以稀释液为溶剂，将l-2-氨基-5-胍基戊酸对映异构体对照品配制成浓度为1.5μg/ml的溶液，作为对映异构体对照品溶液；3)供试品溶液的制备：精密称取l-2-氨基-5-胍基戊酸待测样品，以稀释液为溶剂配制成浓度为1.5mg/ml的溶液，作为供试品溶液；4)衍生化试液的制备：称取衍生试剂2,3,4,6-四-o-乙酰基-β-d-吡喃葡萄糖基异硫氰酸酯(gitc)适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml约含7.2mg的溶液作为衍生化试液储备液，取衍生化试液储备液用乙腈稀释成每1ml中含2.4mg的溶液，作为衍生化试液；5)分别取系统适用性溶液、对映异构体对照品溶液和供试品溶液100μl，各加入等体积衍生化试液，混匀，室温放置衍生60min，即得到各溶液的衍生化溶液；6)色谱条件与系统适用性试验：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以0.01mol/l磷酸二氢钾溶液(ph值2.8)为流动相a，以甲醇为流动相b；流速为每分钟1.0ml；洗脱方式为梯度洗脱；检测波长为250nm；柱温为25℃；进样量为5μl；取步骤5)制备的系统适用性溶液的衍生化溶液进行系统适用性试验，l-2-氨基-5-胍基戊酸对映异构体衍生物峰与相邻峰的分离度应符合要求，理论板数按l-2-氨基-5-胍基戊酸对映异构体峰计算不低于3000；7)l-2-氨基-5-胍基戊酸对映异构体的测定：取步骤5)所制备的对映异构体对照品溶液的衍生化溶液及步骤5)所制备的供试品溶液的衍生化溶液各5μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算对映异构体的含量，对映异构体对照品峰面积需乘以校正因子1.29。进一步，l-2-氨基-5-胍基戊酸对映异构体的检测方法，所述的梯度洗脱为下表所示梯度进行洗脱：相比现有技术，本发明具有如下有益效果：1、本发明利用柱前衍生高效液相色谱技术建立了一种能定量检测l-2-氨基-5-胍基戊酸对映异构体的检测方法，该方法分离度好、灵敏度高、干扰少，能有效控制产品质量。具有较高的灵敏度、准确度、精密度，耐用性强，可准确反映l-2-氨基-5-胍基戊酸原料药中对映异构体的含量，适合工业上用于l-2-氨基-5-胍基戊酸对映异构体的检测及质量控制，从而为合理的质量标准制定提供依据，以便更好控制和掌握产品质量，确保食用和药用的安全性。2、本发明能有效检测出l-2-氨基-5-胍基戊酸原料的对映异构体杂质，有利于l-2-氨基-5-胍基戊酸生产的过程控制，也有利于更好地进行产品质量控制，确保食用和药用安全。系统适用性试验的d-2-氨基-5-胍基戊酸的衍生物峰与相邻峰的分离度应符合要求，理论板数按d-2-氨基-5-胍基戊酸峰计算不低于3000；所述高效液相色谱法检测l-2-氨基-5-胍基戊酸对映异构体的灵敏度为0.1％。3、本发明最突出的特点之一是解决了d-2-氨基-5-胍基戊酸衍生物峰与相邻峰的分离度问题。研究发现，采用gitc衍生后色谱图会出现很多干扰峰，对于检测方法的目标峰定位以及重复性、系统适用性等试验结果的影响很大，难以达到方法学验证的要求。为此，本发明通过衍生体系优化、缓冲盐浓度选择、流动相比例选择、洗脱方式优化等研究，解决了d-2-氨基-5-胍基戊酸衍生峰与相邻峰的分离度问题，满足了方法学验证的系统适用性试验、重复性、回收率、耐用性等指标的要求。4、本发明最突出的特点之二是解决了d-2-氨基-5-胍基戊酸杂质检测的灵敏度问题。研究发现，当供试品溶液的l-2-氨基-5-胍基戊酸浓度超过0.5mg/ml时，d-2-氨基-5-胍基戊酸衍生物峰存在非常显著的溶剂效应(图3)，严重影响d-2-氨基-5-胍基戊酸的检测，致使本方法灵敏度无法达到0.1％的要求。本发明通过多种技术手段，成功地将供试品浓度提升至2.0mg/ml，使本方法检测d-2-氨基-5-胍基戊酸的灵敏度达到0.1％。5、本发明最突出的特点之三是解决了d-2-氨基-5-胍基戊酸杂质检测的干扰问题。研究发现，在高浓度l-2-氨基-5-胍基戊酸背景下d-2-氨基-5-胍基戊酸衍生物峰峰面积与相同浓度单一d-2-氨基-5-胍基戊酸存在时的衍生物峰峰面积存在较大差异，也就是用d-2-氨基-5-胍基戊酸对照品的峰面积来计算供试品溶液中的对映异构体的含量存在较大误差，不能准确检测对映异构体的含量，为此，本发明找到其间的换算关系，通过校正因子1.29可准确检测样品中的对映异构体含量。附图说明图1：l-2-氨基-5-胍基戊酸发酵液衍生物的色谱图；图2：l-2-氨基-5-胍基戊酸部分纯化液衍生物的色谱图；图3：d-2-氨基-5-胍基戊酸检测的溶剂效应色谱图；图4：三批l-2-氨基-5-胍基戊酸原料中对映异构体检测的色谱图；图5：l-2-氨基-5-胍基戊酸及其对映异构体的分离色谱图；图6：l-2-氨基-5-胍基戊酸未破坏+d-型异构体的色谱图；图7：l-2-氨基-5-胍基戊酸强酸破坏+d-型异构体的色谱图；图8：l-2-氨基-5-胍基戊酸高温破坏+d-型异构体的色谱图；图9：l-2-氨基-5-胍基戊酸强光破坏+d-型异构体的色谱图。具体实施方案下面通过具体优选实施方式对本发明作进一步描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。实施例1：三批l-2-氨基-5-胍基戊酸原料药的对映异构体检测仪器及色谱条件：采用安捷伦1260高效液相色谱仪，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6×250mm，5μm)，柱温为25℃；流速为1.0ml/min；检测波长为250nm；进样量为5μl；取磷酸二氢钾1.36克，加水溶解并稀释至1000ml，用20％磷酸调节ph值至2.8作为流动相a，以甲醇为流动相b，按下表进行洗脱，其比例如表1所示：表1精密量取供试品溶液和对映异构体对照品溶液各100μl，各加入等体积衍生化试液1(取2,3,4,6-四-o-乙酰基-β-d-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯(gitc)适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml约含7.2mg的溶液)，混匀，室温放置60min，分别取5μl注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法，以峰面积计算l-2-氨基-5-胍基戊酸对映异构体的含量；实验步骤：精密称取l-2-氨基-5-胍基戊酸原料药适量，加稀释液[水-三乙胺-乙腈(体积比50:0.4:50)]溶解并稀释制成每1ml中约含1.5mg的溶液，作为供试品溶液；精密称取d-2-氨基-5-胍基戊酸对照品适量，加稀释液溶解并定量稀释制成每1ml中约含1.5μg的溶液，作为对照品溶液，然后进行柱前衍生。取l-2-氨基-5-胍基戊酸原料药和d-2-氨基-5-胍基戊酸对照品各适量，加稀释液溶解并稀释制成每1ml中约含l-2-氨基-5-胍基戊酸0.5mg与l-2-氨基-5-胍基戊酸15μg的溶液，作为系统适用性溶液。系统适用性试验l-2-氨基-5-胍基戊酸及其对映异构体保留时间及分离度结果见表2：表2在测定条件下，系统适用性溶液中l-2-氨基-5-胍基戊酸衍生物峰与相邻峰的分离度均大于2.0，对映异构体衍生物峰与相邻峰的分离度均大于1.5，系统适用性良好。三批l-2-氨基-5-胍基戊酸原料药对映异构体检测结果见表3，色谱图见图4：表3样品批号l-2-氨基-5-胍基戊酸对映异构体含量(％)20180501未检出20180502未检出20180503未检出实施例2：对映异构体定位试验仪器及色谱条件同实施例1。实验步骤：分别称取l-2-氨基-5-胍基戊酸及其对映异构体对照品适量，分别用稀释液溶解并定量稀释制成每1ml约含0.5mg的溶液作为定位溶液；混合溶液的配制方法同实施例1的系统适用性溶液，然后进行柱前衍生，取各衍生溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图。l-2-氨基-5-胍基戊酸对映异构体的衍生物峰与相邻峰的分离度结果见表4，色谱图见图5：表4结果显示：l-2-氨基-5-胍基戊酸对映异构体衍生物峰与相邻峰之间能达到良好分离。实施例3：专属性破坏试验仪器及色谱条件同实施例1。实验步骤：精密称取l-2-氨基-5-胍基戊酸适量，在0.5mol/l盐酸溶液、180℃高温和4500lx强光条件下分别对其进行强制破坏试验，各破坏样品配制方法见表5，色谱图见图6～图9：分别按下表配制各专属性破坏样品溶液：表5取上述衍生溶液分别进样并记录色谱图，破坏结果见表6：表6结果表明：在强酸、高温和强光破坏样品中均未检出d-2-氨基-5-胍基戊酸，说明强酸、高温和强光均不会使l-2-氨基-5-胍基戊酸转化生成d-2-氨基-5-胍基戊酸；各种破坏条件下，d-2-氨基-5-胍基戊酸衍生物峰与前后峰的分离度均超过1.5，不影响其定量检测，l-2-氨基-5-胍基戊酸衍生物的峰纯度均大于999。可见，本方法对d-2-氨基-5-胍基戊酸检测具有良好的专属性。实施例4：定量限、检测限试验仪器及色谱条件同实施例1。实验步骤：采用信噪比法测定d-2-氨基-5-胍基戊酸的检测限和定量限。分别配制l-2-氨基-5-胍基戊酸和对映异构体的贮备液，稀释至一定浓度并取样进行柱前衍生，计算对映异构体衍生物峰的峰高和噪音的比值(信噪比)，当信噪比(s/n)约为10的样品检测量即为定量限，信噪比(s/n)约为3的样品检测量即为检测限，具体配制方法如下：当供试品溶液的d-2-氨基-5-胍基戊酸溶液浓度为0.38μg/ml时，进样量5μl，d-2-氨基-5-胍基戊酸的绝对进样量为0.94ng，d-2-氨基-5-胍基戊酸衍生物的信噪比为5.6，此为d-2-氨基-5-胍基戊酸的检测限。当供试品溶液的d-2-氨基-5-胍基戊酸溶液浓度为0.76μg/ml时，进样量5μl，d-2-氨基-5-胍基戊酸的绝对进样量为1.89ng，d-2-氨基-5-胍基戊酸衍生物的信噪比分别为12.5，此为d-2-氨基-5-胍基戊酸的定量限。l-2-氨基-5-胍基戊酸对映异构体的定量限、检测限具体结果见表7：表7结果显示：d-2-氨基-5-胍基戊酸的定量限浓度均小于供试品浓度的0.05％，能够准确控制对应异构体的含量。实施例5：线性试验仪器及色谱条件同实施例1。实验步骤：精密称取d-2-氨基-5-胍基戊酸适量，加水溶解并稀释至15μg/ml，分别用移液管吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml，用稀释液定容至10ml，即浓度为0.76、1.51、2.27、3.02、3.78、4.53μg/ml的溶液；相同方法配制1.5mg/mll-2-氨基-5-胍基戊酸背景下的各种浓度的d-2-氨基-5-胍基戊酸溶液。取各种d-2-氨基-5-胍基戊酸溶液200μl，加入衍生试液200μl，衍生1小时，过滤，进样5μl进行色谱分析。以d-2-氨基-5-胍基戊酸浓度作为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。按表8配制各线性测试溶液，用于对映异构体线性试验：表8取上述溶液分别进样并记录色谱图，以d-2-氨基-5-胍基戊酸浓度为横坐标，衍生物峰面积为纵坐标，得到d-2-氨基-5-胍基戊酸的线性回归方程。可见，无论单一d-2-氨基-5-胍基戊酸还是高浓度l-2-氨基-5-胍基戊酸背景下，在一定浓度范围内，d-2-氨基-5-胍基戊酸浓度与衍生物峰面积均呈现出良好线性关系，校正因子为1.29。实施例6：准确度试验仪器及色谱条件同实施例1。实验步骤：称取l-2-氨基-5-胍基戊酸15mg，分别加入0.5、1.0、1.5ml浓度为15μg/ml的d-2-氨基-5-胍基戊酸溶液，用稀释液配制成含有l-2-氨基-5-胍基戊酸浓度为1.5mg/ml及对映异构体浓度分别为0.76μg/ml、1.51μg/ml和2.27μg/ml的低中高l-+d-2-氨基-5-胍基戊酸混合溶液；取各混合溶液取200μl，加入衍生试液200μl，衍生1h，取各衍生溶液用于对映异构体的准确度试验，每个浓度三份；分别进样并记录色谱图，计算回收率，结果见表9：表9浓度类型低浓度中浓度高浓度回收率(％)120.18114.26104.15结果表明：各有关物质在低中高浓度范围内，平均回收率均在70％～130％之间，说明本方法的准确度良好。实施例7：耐用性试验仪器及色谱条件同实施例1。实验步骤：取系统适用性溶液，分别改变色谱条件，如流速变化±0.1ml/min、温度变化±5℃、波长变化±5nm、流动相比例±2％、不同型号色谱柱等，按照本方法进行色谱分析。根据对映异构体衍生物峰的拖尾因子、分离度、含量等的变化，评价本方法耐用性。本方法的耐用性试验设计见表10：表10本方法的耐用性试验结果见表11：表11结果表明：在不同条件下，d-2-氨基-5-胍基戊酸含量的绝对值变化均在±0.0013％以内，满足不大于±0.1％的可接受要求；与前后峰达到完全分离(分离度>1.5)，拖尾因子均小于2；但本方法对流动相比例、柱温、色谱柱等的变化均较为敏感，尤其是对流速和色谱柱最敏感，rsd较高。本方法用于本品d-2-氨基-5-胍基戊酸的检测耐用性较好，色谱条件微小变化对系统适应性和d-2-氨基-5-胍基戊酸含量测定无显著影响。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12