稳定高效表达丙型肝炎病毒核心抗原抗体的工程细胞株及其应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，尤其涉及一对稳定高效表达丙型肝炎病毒核心抗原抗体的工程细胞株及其应用。
背景技术：
：丙型病毒性肝炎，是一种由丙型肝炎病毒(hcv)感染引起的病毒性肝炎，主要经输血、针刺、吸毒等传播，据世界卫生组织统计，全球hcv的感染率约为3％，估计约1.8亿人感染了hcv，每年新发丙型肝炎病例约3.5万例。丙型肝炎呈全球性流行，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(hcc)。未来20年内与hcv感染相关的死亡率将继续增加，因此应该采取一切有效措施来避免感染。目前，尚不存在可用于预防hcv感染的疫苗，提早发现是及时治疗、隔离丙型肝炎感染者的主要方法。丙型肝炎的诊断主要依赖于丙型肝炎抗原和核酸的检测。但是，由于病毒rna在感染者血清样品中易降解、较不稳定，因此，hcvrna的检测无法适用于大规模人群筛查。开发hcv相关抗原检测试剂盒对提早发现、治疗携带者和控制病毒传播具有重要价值，对保证人民健康和维护公共安全具有深远意义。hcvrna大约有9500－10000bp组成，在5′非编码区下游紧接一开放的阅读框(orf)，其中基因组排列顺序为5'-c-e1-e2-p7-ns2-ns3-ns4-ns5-3'，能编码一个长度大约为3014个氨基酸的多聚蛋白前体，后者可经宿主细胞和病毒自身蛋白酶作用后，裂解成10种病毒蛋白，包括三种结构蛋白，即分子量19kd的核衣壳蛋白(或称核心蛋白，core)和两种糖蛋白(分子量为33kd的e1蛋白，分子量72kd的e2蛋白)，p7编码一种膜内在蛋白，其功能可能是一种离子通道。非结构蛋白部分则包括ns2，ns3，ns4a，ns5a和ns5b，非结构蛋白对丙肝病毒的生活周期非常重要。在hcv现症感染者中，rna检测能够准确筛查出hcv感染者，而hcvcag作为hcvrna的相关性物质，因患者血清中hcv抗原含量极低，不易被检出。hcvcag检测和hcvrna检测的阳性符合率一般不高于60％，极易漏检。但是rna作为分子检测手段，检测周期长、对检测人员的技术要求非常高、且费用较高，不适合所有医院的推广使用，基于此，寻找能够与hcvcag具有高亲和力和特异性结合的抗体，有助于提高对于hcv感染者血清中hcvcag检测的灵敏度和准确性，实现hcvcag检测和hcvrna检测的阳性符合率的提高和吻合，这对丙肝的临床检测应用具有重要意义。利用杂交瘤细胞制备单克隆抗体对的技术已经成熟，目前也有利用杂交瘤细胞制备有关hcvcag具有高亲和力和特异性结合的单克隆抗体或利用其开发hcv抗原检测试剂或试剂盒的报道，但该方法制备的检测hcv-cag的单克隆抗体量少，无法满足临床检验或相关检测试剂或试剂盒制备的需要。中国仓鼠卵巢细胞(cho)是较为成熟的表达外源蛋白的哺乳动物细胞系，具有多年的实践运用经验。cho细胞易于大规模培养，外源基因易于稳定整合入细胞的基因组，在表达外源蛋白中具有较大优势，利用它有望实现基因工程抗体的量产。但检索发现：目前，尚无以中华仓鼠卵巢细胞(cho)作为宿主细胞，转染含有hcv-cag单克隆抗体基因的表达质粒筛选获得能够稳定高效表达丙型肝炎病毒核心抗原抗体的工程细胞株的报道，也没有将cho工程细胞用于丙型肝炎病毒核心抗原抗体制备的应用报道。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一对稳定高效表达丙型肝炎病毒核心抗原抗体的工程细胞株及其应用。本发明所述的一对稳定高效表达丙型肝炎病毒核心抗原抗体的工程细胞株，该工程细胞株是以中华仓鼠卵巢细胞(cho)作为宿主细胞，转染含有hcv-cag单克隆抗体基因的表达质粒后经筛选获得；其特征在于：所述第一工程细胞株命名为中国仓鼠卵巢细胞株cho/3a2，其能分泌产生丙型肝炎病毒核心抗原抗体3a2，该细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为：cctccno.c2018188；所述第二工程细胞株命名为中国仓鼠卵巢细胞株cho/5h7，其能分泌产生丙型肝炎病毒核心抗原抗体5h7，该细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为：cctccno.c2018226。用于构建上述工程细胞株的真核细胞外源基因表达系统，其特征在于：所述表达系统包括真核表达载体和hcv-cag抗体基因或编码该hcv-cag氨基酸序列或其抗原结合片段的核酸分子，其中所述真核表达载体选pbudce4.1或pcdna3.1，且该质粒带有zeocin抗性作为筛选标签，该筛选标签能够通过转染dna的方法导入细胞。其中，优选的实施方式是：上述表达系统先选择表达载体pbudce4.1-h1-l1(命名为pbudce4.1-3a2)和表达载体pbudce4.1-h2-l2(命名为pbudce4.1-5h7)；其中pbudce4.1-3a2的核苷酸序列如seqno.9所示，pbudce4.1-5h7的核苷酸序列如seqno.10所示。所述hcv-cag抗体基因分别是编码命名为单克隆抗体2g7的核酸分子，同时也是编码基因工程抗体丙型肝炎病毒核心抗原抗体3a2的核酸分子，其轻链的核苷酸序列如seqidno.5所示，其重链的核苷酸序列如seqidno.6所示，其中所述单克隆抗体2g7产生于cctccno.c2018229的杂交瘤细胞株；或是编码命名为单克隆抗体6a2的核酸分子，同时也是编码基因工程抗体丙型肝炎病毒核心抗原抗体5h7的核酸分子，其轻链的核苷酸序列如seqidno.7所示，其重链的核苷酸序列如seqidno.8所示，其中所述单克隆抗体6a2产生于cctccno.c2018230的杂交瘤细胞株；所述两株杂交瘤细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心。中国典型培养物保藏中心地址：中国，武汉，武汉大学。本发明所述的一对稳定高效表达丙型肝炎病毒核心抗原抗体的工程细胞株在制备丙型肝炎病毒核心抗原抗体中的应用。其中：培养工程细胞时能够显著提高抗体产量的专用培养基配方是：cho-s-sfmii干粉培养基10g/l，nahco32.40～2.45g/l，7～8mm谷氨酰胺，2±0.2mm柠檬酸铁，最终ph为7.0～7.2；该培养基命名为cho-med-01；培养工程细胞时采用的补料方式是：于第1、3、5、7、9或11天分别依次补加终浓度为7ml/l、8ml/l、9ml/l、10ml/l、9ml/l、8ml/l的feeda。进一步的，培养工程细胞时能够显著提高抗体产量的专用培养基配方优选是：cho-s-sfmii干粉培养基10g/l，nahco32.45g/l，8mm谷氨酰胺，2mm柠檬酸铁，最终ph为7.1。本发明所述的一对工程细胞株分泌产生的丙型肝炎病毒核心抗原抗体对，该基因工程抗体对包括独立存放的第一基因工程抗体和第二基因工程抗体；其特征在于：所述第一基因工程抗体命名为丙型肝炎病毒核心抗原抗体3a2，由中国仓鼠卵巢细胞株cho/3a2细胞分泌产生，其轻链的氨基酸序列如seqidno.1所示，其重链的氨基酸序列如seqidno.2所示；所述第二基因工程抗体命名为丙型肝炎病毒核心抗原抗体5h7，由中国仓鼠卵巢细胞株cho/5h7细胞分泌产生，其轻链的氨基酸序列如seqidno.3所示，其重链的氨基酸序列如seqidno.4所示。本发明所述的cho工程细胞株对cho/3a2和cho/5h7能够分别稳定表达丙型肝炎病毒核心抗原抗体，具体为该细胞株对能够分泌表达抗体到细胞培养上清液中，所分泌的抗体能够通过酶联免疫吸附法(elisa)检测。该细胞株在细胞数倍增1-40次后，抗体的表达水平稳定，即在相同的培养条件下，细胞数倍增1-40次后，通过酶联免疫吸附法(elisa)检测，细胞培养上清液中抗体浓度保持在2g/l左右。使用亲和纯化的方式，能够从细胞培养上清液中纯化丙型肝炎病毒核心抗原抗体。上述的丙型肝炎病毒核心抗原抗体对作为包被抗体和检测抗体配对使用在制备hcv-cag的elisa检测试剂或试剂盒中的应用。本发明所述的cho工程细胞株对cho/3a2和cho/5h7制备的丙型肝炎病毒核心抗原抗体能够组成抗体对通过elisa方法检测hcv-cag。其中：所述包被抗体选第一基因工程抗体3a2，所述检测抗体选第二基因工程抗体5h7；应用时elisa检测板上包被有第一基因工程抗体3a2，酶稀样品中含有hrp标记的第二基因工程抗体5h7，所述第一基因工程抗体和所述第二基因工程抗体配对使用。本发明的优点和突出效果在于：1)本发明涉及的cho工程细胞株对cho/3a2和cho/5h7能够分别稳定表达丙型肝炎病毒核心抗原抗体，该细胞株在细胞数倍增1-40次后，抗体的表达水平稳定，即在相同的培养条件下，细胞数倍增1-40次后，通过酶联免疫吸附法(elisa)检测，细胞培养上清液中抗体浓度保持在2g/l。实现了利用工程细胞株丙型肝炎病毒核心抗原抗体的量产。2)本发明利用cho工程细胞株对制备的丙型肝炎病毒核心抗原抗体对hcv-cag具有极高的灵敏度和特异性。实验证实：本发明制备的抗体对能够通过elisa方法对hcv-cag的检测达到5pg/ml的灵敏度，并实现hcv患者的检出符合率达98％，能够有效减少漏检现象，显著提高hcv-cag的检出率。该抗体为应用于丙肝病毒抗原检测试剂盒的研制提供了良好的抗体来源，对丙肝的临床检测应用具有重要的意义和价值。附图说明图1配对基因工程抗体3a2-5h7的sds-page电泳图。其中：3a2泳道为3a2单克隆抗体电泳图，5h7泳道为5h7单克隆抗体电泳图。图2cho工程细胞株cho/3a2的长时间培养时不同时间点的细胞密度与活率曲线。图3cho工程细胞株cho/5h7的长时间培养时不同时间点的细胞密度与活率曲线。图4cho工程细胞株cho/3a2的长时间培养时不同时间点的抗体产量曲线。图5cho工程细胞株cho/5h7的长时间培养时不同时间点的抗体产量曲线。具体实施方式下面结合具体实施例对本
发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。本发明实施例中使用的方法为常规方法；使用的载体：pbudce4.1购自生物风公司；限制性内切酶bamhⅰ、handⅲ、notⅰ、kpnⅰ、t4连接酶、感受态细胞top10购自takara公司；cho细胞购于上海纪宁jn-b1955；lipo2000购自thermo公司；feeda补料购自gibco公司、cho-s-sfmii干粉培养基购自invitrogen公司。实施例1：制备表达质粒pbudce4.1-h1-l1、pbudce4.1-h2-l2对实验筛选获得两株杂交瘤细胞cctccno.c2018229和cctccno.c2018230分泌产生的1对单克隆抗体2g7和6a2委托测序公司(上海博尚生物技术有限公司)进行抗体的核苷酸测序。确定产生于cctccno.c2018229杂交瘤细胞株的单克隆抗体2g7的轻链的核苷酸序列如seqidno.5所示，其重链的核苷酸序列如seqidno.6所示，同时也设定是编码基因工程抗体丙型肝炎病毒核心抗原抗体3a2的核酸分子，其轻链的核苷酸序列也如seqidno.5所示，其重链的核苷酸序列也如seqidno.6所示。委托测序公司制作提供了含有该抗体的基因序列的克隆载体，分别为：puc19-h1、puc19-l1。确定产生于cctccno.c2018230杂交瘤细胞株的单克隆抗体6a2的轻链的核苷酸序列如seqidno.7所示，其重链的核苷酸序列如seqidno.8所示，同时也设定是编码基因工程抗体丙型肝炎病毒核心抗原抗体5h7的核酸分子，其轻链的核苷酸序列也如seqidno.7所示，其重链的核苷酸序列也如seqidno.8所示。委托测序公司制作提供了含有该抗体的基因序列的克隆载体，分别为：puc19-h2、puc19-l2。上述两株杂交瘤细胞株cctccno.c2018229和cctccno.c2018230已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心。中国典型培养物保藏中心地址：中国，武汉，武汉大学。构建载体和质粒大提：1.1、pbudce4.1-h1-l1和pbudce4.1-h2-l2真核表达载体的构建1)分别使用3a2重链引物和轻链引物(3a2l1f和3a2l1r、3a2h1f和3a2h1r)并通过pcr的方法在3a2轻链基因l1两端添加bamhi、handⅲ，在3a2重链基因h1两端添加notⅰ、kpnⅰ，由puc19-l1、puc19-h1分别获得抗体的l1和h1基因片段。其中：3a2重链引物和轻链引物具体核苷酸序列如下：3a2l1fatttgcggccgcgagatcgtgatgacccagag3a2l1rggggtaccgcactcgttcctgtagaag3a2h1fcccaagcttatggacaggctgaccagcagc3a2h1rcgggatcccttgccggggctcctgctgatgpcr的体系如下：takaraextaq0.25μl，10×extaqbuffer5μl，dntp(各2.5mm)4μl，质粒dna0.5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，蒸馏水38.25μl；pcr程序如下：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1-2min(1kbp/min)30个循环；72℃5min。2)用bamhi、handⅲ酶切3a2轻链核苷酸片段和pbudce4.1载体，经过连接和转化，将3a2轻链核苷酸片段连入pbudce4.1载体，提取质粒后进行notⅰ、kpnⅰ双酶切。酶切体系及程序如下：质粒dna/pcr产物1.2-1.5μg，内切酶notⅰ(takara)2μl，内切酶kpnⅰ(takara)2μl，10×buffer5μl，补水至50μl，37℃4-6h；脱磷程序如下：酶切产物1μg，ciap1μl，10×alialinephosphatasebuffer5μl，补水至50μl；37℃1-2h，按照实验室常规方法回收。并与notⅰ、kpnⅰ酶切后的3a2重链核苷酸片段进行连接，体系如下：根据浓度按照片段:载体10:1的比例进行加样，10×t4dnaligasebuffer2.5μl，t4dnaligase1μl，补水至25μl，16℃过夜，第二天取出转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，按照实验室一般方法筛选阳性克隆，最终得到pbudce4.1-h1-l1载体，命名为pbudce4.1-3a2。用同样的方法可以得到pbudce4.1-h2-l2载体，命名为pbudce4.1-5h7。其中，5h7重链引物和轻链引物具体核苷酸序列如下：5h7l2fatttgcggccgcgagatcgtgatggtgcagag5h7l2rggggtaccgcactcgttcctgtagaagc5h7h2fcccaagcttatggacaggctgaccagcagc5h7h2rcgggatccgaccatcagcaggagccccggc1.2、大肠杆菌培养，质粒大提：质粒大提试剂盒购自全式金公司，货号：em121-01将得到的含有pbudce4.1-h1-l1、pbudce4.1-h2-l2的大肠杆菌进行培养，进行质粒大量提取。提取步骤按试剂盒说明书进行。结果：1、经测序，所有目的载体的测序结果与理论序列比对一致，质粒pbudce4.1-h1-l1中的目的基因片段h1、l1测序结果分别与seq:no.5、seq:no.6一致；pbudce4.1-h2-l2中的目的基因片段h2、l2测序结果分别与seq:no.7、seq:no.8一致。pbudce4.1-3a2(pbudce4.1-h1-l1)的核苷酸序列如seqno.9所示，pbudce4.1-5h7(pbudce4.1-h2-l)的核苷酸序列如seqno.10所示。2、提取出的两种质粒pbudce4.1-h1-l1、pbudce4.1-h2-l2经检测浓度分别为1.123mg/ml和1.286mg/ml。实施例2转染cho细胞，筛选表达抗体对的细胞株对材料与试剂：cho细胞购于上海纪宁jn-b1955、lipo2000购自thermo公司、feeda补料购自gibco公司、cho-s-sfmii干粉培养基购自invitrogen公司。2.1、cho细胞培养将cho细胞按照5×105个/ml接种到15ml培养基(cho-s-sfmii(invitrogen))，于有盖的125ml锥形瓶中，加入终浓度为8mm的谷氨酰胺，将培养瓶放置在37℃，相对湿度70-80％，5％二氧化碳细胞摇床培养箱中培养，转速为：125rpm。培养2天开始每天观察细胞生长情况，计数。计数时先取20μl，加入20μl的0.4％台盼蓝染色液，加入细胞计数板中利用细胞计数仪计数。每次记录活细胞数、死细胞数。当细胞数约为2.0×106且活率高于95％时转至6孔细胞培养板铺板培养，每孔加细胞数为3×106个/ml的细胞液共3ml。2.2、cho细胞转染将大量提取得到的质粒pbudce4.1-h1-l1和pbudce4.1-h2-l2分别进行细胞转染，具体操作步骤如下：1)接种细胞至70～90％汇合度时转染；2)使用opti-mem培养基稀释lipofectamine3000试剂，充分混匀；3)使用opti-mem培养基稀释dna，制备dna预混液，然后添加p3000试剂，充分混匀；4)将稀释dna与稀释的lipofectamine3000试剂混合(1:1比例)；5)孵育5min；6)加入dna-脂质体复合物至细胞中。质粒pbudce4.1-h1-l1和质粒pbudce4.1-h2-l2分别转染6孔板三个孔。2.3、稳定细胞株的筛选转染24h后，利用有限稀释法筛选细胞单克隆，用移液器将进行亚克隆的细胞混匀，用含有zeocin(1mg/l)筛选培养基稀释细胞至密度为4cell/ml，每孔200μl/孔铺96孔板，每个质粒转染的细胞铺96孔板10块，置5％co2、37℃的培养箱中进行培养；2周后，显微镜下观察标记出生长单个细胞团的孔，每板约长出克隆数20个，显微镜下观察去除明显的非单克隆细胞，根据泊松分布，其余克隆可认为是单克隆；培养至第20天左右，每孔取100μl上清液，用elisa方法进行检测，筛选表达量高的细胞株转移至24孔板中培养；3天后，在24孔板中每孔取100μl上清液，用elisa方法进行检测，筛选表达量高的细胞株转移至6孔板中培养；5天后，在6孔板中每孔取100μl上清液，用elisa方法进行检测，筛选表达量高的细胞株转移至摇瓶中培养；将摇瓶中细胞再次进行亚克隆，筛选表达量最高的细胞株扩大培养、冻存；结果：对于转染质粒pbudce4.1-h1-l1和质粒pbudce4.1-h2-l2的细胞：1)96孔板中培养的单克隆细胞取上清液，用酶联免疫吸附法(elisa法)测定抗体表达量，选取高表达的克隆100个转入24孔板中继续进行培养；2)24孔板中培养的单克隆细胞取上清液，用用酶联免疫吸附法(elisa法)测定抗体表达量，选取高表达的克隆24个转入6孔板中继续进行培养；3)6孔板中培养的单克隆细胞取上清液，用用酶联免疫吸附法(elisa法)测定抗体表达量，选取高表达的克隆1个转入摇瓶中进行培养；4)摇瓶中细胞再次进行亚克隆，筛选得到2株表达量最高的细胞株，命名为cho/3a2和cho/5h7。实施例3使用cho细胞株制备单克隆抗体对及效价测定3.1、两株cho细胞株cho/3a2和cho/5h7的批次培养将细胞株cho/3a2和cho/5h7按照0.4×106cell/ml的密度接种到sf250ml细胞培养三角瓶中，培养体系为50ml，培养基使用能够显著提高抗体产量的专用培养基(cho-med-01)，其基配方是：cho-s-sfmii干粉培养基10g/l，nahco32.45g/l，8mm谷氨酰胺，2mm柠檬酸铁，最终ph为7.1。接种后台盼蓝染色计数，将培养瓶放置在37℃，相对湿度70-80％，5％二氧化碳细胞摇床培养箱中培养，转速为：125rpm。每天观察细胞生长状况，台盼蓝染色计数，计数时先取20μl，加入有20μl的0.4％台盼蓝染色液的离心管中混匀，取20μl加入细胞计数板中利用细胞计数仪计数。每次记录活细胞数、死细胞数、细胞活率、细胞结团率。计数的同时，每次取细胞培养液100μl进行elisa检测抗体表达量，取500μl进行生化指标葡萄糖的检测。根据监测情况，用1l超纯水，溶解80.2gfeeda粉末，制成feeda液体。按照表1的cho细胞培养补料方案增添feeda液体。表1：cho细胞培养补料方案第1天第3天第5天第7天第9天第11天feeda(ml/l)终浓度7891098根据葡萄糖的检测指标数，补加40％无菌葡萄糖，使补料之后的葡萄糖浓度在6g/l。当细胞活率低于90％时，停止培养，收取细胞液进行离心，4℃、12000rpm离心10min，0.22μm的滤膜进行过滤。实验中，检测细胞的长时间培养时不同时间点的细胞密度与活率曲线和长时间培养时不同时间点的抗体产量曲线。结果见图2至图5。3.2、从细胞培养上清液中纯化hcv-3a2和hcv-5h7单克隆抗体1)用pbs缓冲液ph7.2冲洗protiena柱子，约5个柱体积。2)上样：将过滤的细胞培养上清上样，抗体与填料中proteina结合。3)平衡：pbs缓冲液冲洗柱子，直至基线平衡，一般5～10个柱体积。4)洗脱：使用柠檬酸钠溶液ph3.2进行抗体洗脱，收集抗体。5)脱盐：将收集到的抗体上样至脱盐层析柱脱盐。6)收集：收集抗体溶液，加0.5％叠氮钠4℃保存。用酶联免疫吸附法(elisa法)检测上样、流穿液、洗脱液等中的抗体浓度。3.3、单克隆抗体3a2和5h7的酶标本实施例使用过碘酸钠法标记抗体，具体操作步骤如下：1)称取5mghrp溶解于1ml蒸馏水中。2)于上液中加入0.2ml新配的0.1mnaio4溶液，室温下避光搅拌20分钟。加入5mg纯化的抗体，混匀。3)将上述溶液装入透析袋中，对1mmph4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。4)加20μl0.2mph9.5碳酸盐缓冲液，使hrp的ph升高到9.0～9.5，然后立即加入10mgigg在1ml0.01m碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。5)加0.1ml新配的4mg/mlnabh4液，混匀，再置4℃2小时。6)将上述液装入透析袋中，对0.15mph7.4pbs透析，4℃过夜。7)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。8)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15mph7.4的pbs中。9)将上述溶液装入透析袋中，对0.15mph7.4的pbs缓冲盐水透析，去除铵离子，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物——酶标的(hrp)抗体3a2和5h7，分装后，冰冻保存。3.4抗体的效价鉴定取hcv抗原包被酶标板，5％bsa溶液封闭后间接elasa法检测纯化后单克隆抗体的效价。1)把含有上述抗体的样品分别做倍比稀释，pbs做阴性对照，每孔100μl，加入酶标板中，37℃温育1小时。2)tbst洗涤后，加入1:4000稀释的hrp标记的二抗，每孔100μl，37℃孵育1小时。3)tbst洗涤后，加入tmb底物显色15min后终止反应。酶标仪读取od450值，检测结果见表2。表2：抗体效价检测实验结果实施例44.1基因工程抗体与单克隆抗体在检测中的对比试验1)用ph9.6的碳酸盐缓冲液将基因工程抗体3a2、单克隆抗体2g7稀释到5μg/ml，分别包被酶标板(每个抗体设置三个检测孔)，4℃过夜。2)24h后取出酶标板，tsbt洗涤一次，5％bsa溶液37℃封闭2小时；3)每孔加入hcv抗体阳性血清，以健康人血清样品阴性对照，37℃孵育1小时。孵育完成后取出酶标板，tbst洗涤三次，向包被了3a2抗体的检测孔中加入标记了hrp的5h7基因工程抗体100μl(1:4000)、向包被了2g7抗体的检测孔中加入标记了hrp的6a2单克隆抗体100μl(1:4000)，37℃孵育1小时。4)tbst洗涤五次，加入tmb底物，37℃显色20min。取出后加终止液，在酶标仪上测定od450读数，检测结果见表3。由检测结果可知基因工程抗体3a2和5h7配对使用检测hcvcore抗原时，其敏感性与2g7和6a2单克隆抗体对一致。结果见表3。表3：基因工程抗体与单克隆抗体对比实验4.1配对抗体灵敏度评价本实验筛选到的配对抗体，第一单克隆抗体3a2(包被抗体)和第二单克隆抗体5h7(酶标抗体)，对重组hcv-cag进行梯度稀释检测，确定配对抗体3a2-5h7对重组hcv-cag的灵敏度。结果见表4。表4：3a2-5h7配对抗体灵敏度检测结果配对抗体3a2-5h7对重组hcv-cag的检测灵敏度为5pg/ml，高于一般检测试剂盒的灵敏度。4.2配对抗体特异性评价本实验筛选到的配对单克隆抗体：第一单克隆抗体3a2(包被抗体)和第二单克隆抗体5h7(酶标抗体)，对90份非丙肝患者血清样本进行检测，其中30份乙肝患者血清样本、30份梅毒患者血清样本、30份类风湿患者血清样本，检测结果如表5所示。表5：a2-5h7配对抗体特异性检测结果交叉反应率乙肝0梅毒0类风湿0结果显示：配对单克隆抗体3a2-5h7对所有乙肝患者血清没有交叉反应、对所有梅毒患者血清没有交叉反应、对所有类风湿患者血清没有交叉反应，说明本抗体对的特异性较高。配对单克隆抗体3a2-5h7对乙肝病毒、梅毒病毒及类风湿因子等没有交叉反应。综上所述，根据实施例结果可以看出，本发明筛选到了一对单克隆抗体，能够通过elisa检测hcv-cag检测灵敏度达5pg/ml，对乙肝、梅毒、类风湿因子等不呈现交叉反应，具有较高的灵敏度和特异性。上述基因工程抗体对包括独立存放的第一基因工程抗体和第二基因工程抗体；其中：所述第一基因工程抗体是命名为丙型肝炎病毒核心抗原抗体3a2，由中国仓鼠卵巢细胞株cho/3a2细胞分泌产生，其轻链的氨基酸序列如seqidno.1所示，其重链的氨基酸序列如seqidno.2所示；所述第二基因工程抗体是命名为丙型肝炎病毒核心抗原抗体5h7，由中国仓鼠卵巢细胞株cho/5h7细胞分泌产生，其轻链的氨基酸序列如seqidno.3所示，其重链的氨基酸序列如seqidno.4所示。稳定高效表达上述丙型肝炎病毒核心抗原抗体3a2和5h7的工程细胞株；其中：所述第一工程细胞株是命名为中国仓鼠卵巢细胞株cho/3a2，其能分泌产生丙型肝炎病毒核心抗原抗体3a2，该细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为：cctccno.c2018188；所述第二工程细胞株是命名为中国仓鼠卵巢细胞株cho/5h7，其能分泌产生丙型肝炎病毒核心抗原抗体5h7，该细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为：cctccno.c2018226。中国典型培养物保藏中心地址：中国，武汉，武汉大学。序列表<110>山东莱博生物科技有限公司<120>稳定高效表达丙型肝炎病毒核心抗原抗体的工程细胞株及其应用<141>2018-12-19<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>219<212>prt<213>人工序列<221>基因工程抗体3a2轻链氨基酸序列<400>1eivmtqsplslpvslgdqasiscrssqslehnngntylnwyqqkpgkapklliyrasslq60sggldrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyfclqgthvpftagsatkleikradaaktv120sifpvvseqltsggasvvcflnnfypkdinvkwkidgserqngvlnswqqqdskdstysm180sstltltkdeccrhnsytceathktstspivksfyrnec219<210>2<211>479<212>prt<213>人工序列<221>基因工程抗体3a2重链氨基酸序列<400>2mdrltssflllivpayvlsqasletlkesgpgilkpsttlsltcsfsgfslstsgmgvss60irqpsgkglewlahiwwdkvylllksaltiskdqsrnqvcgcgtsldtadtatyycvrra120fsygttrdyfdywcqgtfltvssakttppvvyplapgcgdttgssvtlacsvkgyfpesv180tvtwnsgslsssvhtfpallqsglytmsssvtvpsstwpsqtvtcsvahpassttvdkkl240epsgpistinpcppckechkcpapnleggpsvfifpdnikdvlmisltpkvtcvvvpvse300ddpdaliswfvnnvevhtaqtqthredynstirvvstlpiqhqdwmsgkefkckvnnkdl360pspiertiskikglvrapqvyilpptaeqlsrkdvsltclvvgfnpgdisvewtsnghte420enykdtapvldsdgsykiysklnmktskwektdsfscnvrheglknyylkktisrspgk479<210>3<211>219<212>prt<213>人工序列<221>基因工程抗体5h7轻链氨基酸序列<400>3eivmvqspdslsasvgtrvtcitcragqsissylnlydqkpgkapklliyaacslqsgvp60ssfsgsvdgtdfaltisslqpedfatyycqqsysfpvtfgqgtkveikreikradaaktv120sifpvvseqltsggasvvcflnnfypkdinvkwkidgserqngvlnswqqqdskdstysm180sstltltkdeccrhnsytceathktstspivksfyrnec219<210>4<211>479<212>prt<213>人工序列<221>基因工程抗体5h7重链氨基酸序列<400>4mdrltssfcgcivpayvlsqasletlkesgpgilkpacglsltewegsffslstsgapss60sirqpsgkglewlahippdkvcgcksaltiskagsrnqvggcctsldtadtatwccvrra120fsygttrdyfdywcqgtfltvssakttppvvyplapgcgdttgssvtlacsvkgyfpesv180tvtwnsgslsssvhtfpallqsglytmsssvtvpsstwpsqtvtcsvahpassttvdkkl240epsgpistinpcppckechkcpapnleggpsvfifpdnikdvlmisltpkvtcvvvpvse300ddpdaliswfvnnvevhtaqtqthredynstirvvstlpiqhqdwmsgkefkckvnnkdl360pspiertiskikglvrapqvyilpptaeqlsrkdvsltclvvgfnpgdisvewtsnghte420enykdtapvldsdgsykiysklnmktskwektdsfscnvrheglknyylkktisrspgk479<210>5<211>657<212>dna<213>人工序列<221>基因工程抗体3a2轻链核苷酸序列<400>5gagatcgtgatgacccagagccccctgagcctgcccgtgagcctgggcgaccaggccagc60atcagctgcaggagcagccagagcctggagcacaacaacggcaacacctacctgaactgg120taccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacagggccagcagcctgcag180agcggcggcctggacaggttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaagatc240agcagggtggaggccgaggacctgggcgtgtacttctgcctgcagggcacccacgtgccc300ttcaccgccggcagcgccaccaagctggagatcaagagggccgacgccgccaagaccgtg360agcatcttccccgtggtgagcgagcagctgaccagcggcggcgccagcgtggtgtgcttc420ctgaacaacttctaccccaaggacatcaacgtgaagtggaagatcgacggcagcgagagg480cagaacggcgtgctgaacagctggcagcagcaggacagcaaggacagcacctacagcatg540agcagcaccctgaccctgaccaaggacgagtgctgcaggcacaacagctacacctgcgag600gccacccacaagaccagcaccagccccatcgtgaagagcttctacaggaacgagtgc657<210>6<211>1437<212>dna<213>人工序列<221>基因工程抗体3a2重链核苷酸序列<400>6atggacaggctgaccagcagcttcctgctgctgatcgtgcccgcctacgtgctgagccag60gccagcctggagaccctgaaggagagcggccccggcatcctgaagcccagcaccaccctg120agcctgacctgcagcttcagcggcttcagcctgagcaccagcggcatgggcgtgagcagc180atcaggcagcccagcggcaagggcctggagtggctggcccacatctggtgggacaaggt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