海水叶绿素a、藻蓝蛋白和藻红蛋白参数测量装置的制作方法

本发明属于便携式海水原位荧光探测技术领域，具体涉及一种基于微流控芯片的海水叶绿素a、藻蓝蛋白和藻红蛋白三参数测量装置。

背景技术：

现有技术中，基于叶绿素荧光技术的海水叶绿素a、藻蓝蛋白、藻红蛋白三参数的测量装置和方法尚未形成突破性进展，相关领域的研究Multi-Color-PAM、Trilux三参数荧光传感器等国外仪器已经可以满足需要，然而该类仪器比较复杂、价格昂贵、灵敏度低不能很好地应用于现场海水中。而且，基于荧光技术的光合作用测量方法的研究大多都以淡水蓝、绿藻为研究对象，并不适合海洋藻类的研究。传统仪器及测量方法测量时间长，操作复杂、误差大、功耗大、体积大、成本高，而且无法长期在线测量。海洋领域，尚未出现基于叶绿素荧光技术的叶绿素a、藻蓝蛋白、藻红蛋白三参数测量方法的研究。因此，提供一种高效低成本的、原位便携式海洋叶绿素a、藻蓝蛋白、藻红蛋白三参数测量装置及方法是很有必要的。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对上述技术问题，提供一种基于微流控芯片测量海水叶绿素a、藻蓝蛋白、藻红蛋白浓度的装置及方法。为实现上述目的，采用以下技术方案：

海水叶绿素a、藻蓝蛋白和藻红蛋白参数测量装置包括采样装置和检测装置，采样装置包括具有环流结构的微流控芯片、过滤头、海水进样管路、排废管路、微型电磁阀、微型气泵、微量注射泵、流通池；检测装置包括470nm、610nm、530nm三种不同波段的激发LED光源、光纤、光电二极管、透镜、滤光片以及信号处理单元。微流控芯片采样装置设有液体和气体环路的芯片通道，过滤头和芯片直接通过所述海水进样管路连通，芯片通道上设有多个控制通道通断的微型电磁阀，芯片通道上还设有微型电压泵、流通池和反冲通道。检测装置中三种不同波长的激发LED分别通过光纤接有透镜和滤光片，透镜与滤光片前方设有分光镜，分光镜前方通过光纤接有测量光电二极管与比对光电二极管,微流控芯片还设有排废管路以及信号处理单元，信号处理单元采用基于可编程增益跨阻放大器和正交数字同步检波功能电路等光路检测系统组成，该特殊研发的电路可以有效消除环境光、不同频率噪声对测量结果的影响。

装置将过滤后海水通过微通道注入到流通池形成一个环路后进行三路LED光路检测，用三种不同波长的LED光源作为激发光源实现海水藻类的光合作用测量。能够提高测量精度和准确度，集成度高，可更换性强，便携可同时用于实验室，台站以及浮标原位检测。激发光源LED为可更换器件，可根据不同的测量要求或者对激发光源LED进行更换。装置搭载了特殊研制的电路能够有效屏蔽外界环境光对测量结果的影响。

过滤头为孔径不大于10um的囊式过滤器；

进样管路、排废管路和反冲管路内径为0.5mm-1mm，外径为1mm-2mm；

流通池检测窗口内径为1mm-3mm，流通池长度为30-50mm；

分光镜防止LED因长时间工作发光强度不稳定，其中一路LED光束作为激发光，另外一路光束作为LED参考光对动态激发光源进行补偿；

两路光电二极管分别作为荧光检测器与参考光源接收器，光电二极管均采用的是滨松，噪声在2pA以下；

微型压电泵和微气泵的流速为50-500ul/min；

滤光片、透镜、分光镜均通过光纤集成在微流控芯片内。

海水叶绿素a、藻红蛋白、藻蓝蛋白三参数的测量方法是基于叶绿素荧光技术，海水通过微流控芯片进入集成在芯片内部的流通池内，再利用集成在芯片上的470nm、610nm、530nm三种不同波长的LED激发光源分别照射浮游植物悬浮液，测量浮游植物发出的荧光量子强度从而实现海水叶绿素a、藻蓝蛋白、藻红蛋白浓度的实时测量。该方法包括以下步骤：

1)打开阀2、4、6、8、9和微型压电泵1，关闭其他泵阀，使海水经过过滤头B后进入到芯片通道进行清洗并充满海水进样管路C和流通池M，多余的海水经过排废管路D排出；

2)关闭阀2、4、6、8、9以及微型压电泵1，通过模拟开关实现三路不同波长的LED激发光源的切换，检测光电二极管N和对比光电二极管O分别检测在三种不同波长激发光照射下流通池内荧光与参比光的光强比，计算公式为其中I为激发的荧光强度，I0为激发光发光强度；海水中的叶绿素a、藻蓝蛋白和藻红蛋白再经过LED光激发后，会发出不同波长的荧光信号，所发出的荧光强度为：

F＝kφI0(1-e^-εcb)

其中k为仪器常数，Φ为物质荧光效率，I0为激发光发光强度，c为物质浓度，b为样品光程差，ε为摩尔吸收系数。

从公式中看出，当激发光发光强度稳定，荧光强度仅与叶绿素a、藻蓝蛋白、藻红蛋白的浓度有关，叶绿素浓度与荧光强度F的关系为：c＝A-Blg(D-F)式中D＝kQI0。据此检测接收到的荧光信号的强度F即可检测到海水叶绿素a、藻红蛋白、藻蓝蛋白的浓度c。

本技术方案采用微流控芯片技术，将预处理，反应，分离和监测等单元集成到芯片内，在芯片上快速完成海水叶绿素a、藻蓝蛋白、藻红蛋白浓度的测量，自动进样、分析、校正，自动化程度高，效率高，仪器体积减小优化，系统集成度高，功耗低，成本低，适合原位测量、快速测量、连续测量、实验室测量和便携野外测量；在不同波长的LED激发光照射下采用可变增益放大器和数字正交同步检波电路与双光路检测方案，有效消除环境光与LED电流变化不同频率引起的噪声对测量结果的影响，提高了装置的检出限和检测精度；反冲洗系统有效清理过滤头与进样管路和环流管路，延长仪器原位运行时间；纯光学方法、无需化学试剂，对生物体无损伤。

附图说明

图1：本发明的三参数测量装置的结构示意图。

其中：1.微型压电泵；2-9.阀；10.微气泵；A.微流控芯片；B.过滤头；C.进样管路；D.排废管路；E.反冲管路；F、G、H.激发光源；I.光纤；J.滤光片；K.分光镜；L.透镜；M.流通池；N.光电二极管；O.对比光电二极管；P.检测电路。

具体实施方式

如图1所示，通过实施例对本技术方案微流控芯片的藻类分类测量装置和方法做进一步的说明。

以我国近海代表性藻类为研究对象，以470nm、610nm、530nm三种不同波长的激发光源，分别对激发产生的荧光信号进行检测，从而实现以叶绿素a、藻蓝蛋白、藻红蛋白三参数的测量。

检测装置包括具有环路结构的微流控芯片A、过滤头B、海水进样管路C、排废管路D、反冲管路E、三种不同波段的高亮度激发LED灯F、G、H、光纤I、滤光片J、分光镜K、透镜L、流通池M、测量光电二极管N、参考光电二极管O和检测电路P。其中微流控芯片A上设有多个液体环路的芯片通道，所述芯片通道上设有多个控制芯片通道开关的微型电磁阀2-9，芯片通道上还设有微型压电泵1、流通池M，所述流通池M通过光纤I与透镜L、滤光片J、参考光电二极管N、测量光电二极管O相连。

过滤头B主要为10um的金属烧结材料的过滤装置，主要是将海水中的颗粒物过滤掉以免颗粒物堵塞管路和影响测量结果。所述过滤头B放置于海水中(原位测量)。过滤头B一端通过阀4与进样管路C相连接，另一端通过阀2与微型压电泵1相连，第三段连接阀3进行排空反冲。

微型压电泵1主要是将过滤后的海水通过进样管路C送至流通池M内进行后续检测，流通池M充满进样品后多余的海水将通过排废管路D排出。

微气泵10分别通过阀7、阀5、阀4与过滤头B相连，主要是反冲过滤头，防止生物附着，延长在线监测时间。

三种不同波段的激发光源F、G和H分别通过光纤I与分光镜K相连，分光镜K将激发光源分成两路，一路通过光纤I与透镜滤光片组相连后通过光纤I与流通池M相连，作为激发光激发海水中藻类产生荧光信号。另外一路作为参考光与参考光电二极管O相连。参比主要作用是消除高亮度LED灯发光强度变化所带来的检测误差，以及流通池内部海水中的微小颗粒引起的对海水荧光信号的检测带来的干扰。

检测电路为特殊研发的基于可编程增益与正交同步检波功能的电路，能够有效消除环境光变化以及激发光源编程对测量结果产生的影响。

对海水测量主要步骤如下：

1.打开阀2、4、6、8、9和微型压电泵1，关闭其他的泵阀、使过滤后的海水样品进入到流通池，并充满流通池M，多余的海水通过排废管路D流出。

2.分别开启470nm、610nm和530nm高亮激发LED灯，分别测定在三种不同波长下激发的荧光的强度，并计算荧光值，将计算得到的荧光值分别带入公式从而得到三种海水中藻类的浓度值。

3.现场测定海水样品分别在激发波长为470nm、610nm和530nm波长处的激发荧光值便可得到海水中三种不同藻类的浓度值。

4.测定完成后，关闭阀2、6、8、9后，打开阀3、4、5、7，启动微型气泵10对过滤头B进行反冲，从而延长过滤头的使用寿命。

实施例仅说明本发明的技术方案，而非对其进行任何限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。