用于制备生物样品的方法以及用于固封显微镜载玻片的组合物与流程

发明概述

本发明的主题是用于制备生物学、细胞学、组织学和解剖学(autopsical)样品的方法以及用于固封显微镜载玻片的组合物。本发明的主题还涉及用本文所述组合物固封的样品。

发明背景

在组织细胞病理学诊断中，生物样品的显微镜观察用于诊断的制定。

生物样品(即，组织和细胞)的制备是多阶段过程，其利用自动技术和/或手动方案使样品本身适合于显微镜观察。

如本领域已知的，样品经历几个过程，其在“固封”在显微镜载玻片上之前为显微镜分析提供固定、透明化(diaphanization)和染色。

“固封”包括用盖玻片覆盖显微镜载玻片上的样品，所述盖玻片通常具有小于1毫米的厚度。通过使用折射率与显微镜载玻片相似的固封介质，实现了盖玻片与显微镜载玻片的稳定粘附。

固封介质是粘性物质，通常可溶于有机溶剂，作为粘合剂，并且一旦干燥能确保样品的良好保存。而且，基本要求是用于固封的所有材料都是超透明的，以便允许来自光源的光定量地到达物镜。最常见的固封介质是加拿大香脂(canadabalsam)(也称为加拿大松脂)。

然后，固封的显微镜载玻片在光学显微镜下进行观察，以制定诊断。

显微镜载玻片的固封是一种组织细胞病理学样品的包装，并且显著影响其随时间流逝的抗老化和可读性。

因此，固封的目的是允许待分析样品在具有合适折射率的介质内，即，类似于玻璃的折射率，以避免在显微镜观察期间可能的图像变形。

固封的另一目的是保护样品，并且允许其长期保存。

在固封显微镜载玻片的实践过程中，在进行用水溶性物质染色(例如，典型的苏木紫和曙红染色剂)后，需要进行样品脱水，包括以增加的醇尺度浸泡显微镜载玻片，最后通过二甲苯。由于上述固封介质不能与水或其溶液混合，因此脱水是必要的。在适当脱水后，通过一次性移液管将等份试样的固封介质沉积在显微镜载玻片上，观察任何过量的固封介质。之后，将薄的盖玻片放置在显微镜载玻片上。

可以手动或者通过使用自动盖玻器自动进行该过程。

标准的自动盖玻器可以将盖玻片依次施加在载有样品切片的显微镜载玻片上，通过直接从用于染色的筐(basket)中取出。在染色结束后，将筐放置在自动盖玻器的托盘中，随后夹具从框中一次取出显微镜载玻片，并将其置于供应固封介质的喷嘴下方的水平位置。

在供应固封介质的等分试样后，用吸盘将盖玻片放在显微镜载玻片上，从而完成制备物制备。

这些自动盖玻器中的一些不使用盖玻片，而是使用在用二甲苯适当浸泡之后显微镜载玻片表面上所释放的膜，以允许适当的粘附。

然而，上文简要描述的正确使用的样品固封过程具有若干缺点。

当采用手动固封过程时，需要使用通风橱。事实上，它用于限制因使用有毒物质(如二甲苯)而产生的风险，这些有毒物质(如二甲苯)用于切片处理和作为固封介质的稀释剂。

此外，存在盖玻片在显微镜载玻片上正确定位的关键问题(在手动和自动固封的情况下)。可能发生盖玻片从显微镜载玻片的边缘略微伸出，并且在未对准更严重的情况下，盖玻片必须由使用者重新固封。然而，一旦固封介质变干，该操作就变得不可逆。如果使用干燥的固封介质进行操作，固封的显微镜载玻片在某些情况下应在二甲苯中保留长达3-4天，然后才能移除未对准的盖玻片，以便再次固封另一个。此外，显微镜有一个钩在移动托盘上的金属夹，可用于在观察期间保持显微镜载玻片固定。在将显微镜载玻片定位在透镜下方期间，金属夹剧烈地撞击固封的显微镜载玻片，从而导致来自显微镜载玻片边缘的小碎片破碎。盖玻片在显微镜载玻片上的错误定位会使固封在显微镜上的显微镜载玻片的碎裂显著恶化，因为所产生的碎片会积聚在显微镜灯上(放置在显微镜载玻片下方)并且另外留下固封显微镜载玻片的危险碎裂边缘。

此外，最常见的问题是在盖玻片和样品之间可能形成气泡。在固封过程期间，由于使用者的操作，容器的简单移动或用移液管收集固封介质(当沉积了过量固封介质时)会形成气泡。所有这些操作都引起盖玻片在显微镜载玻片上滑动，导致固封介质中包含小气泡。由于固封介质的高粘度，这些气泡仍然被困在其中，因此导致难以适当观察显微镜。自动固封系统(盖玻器)也会出现同样的问题。

另一个缺点是固封介质的不准确和可能的大量输送。当该情况发生时，将需要去除从已固封的显微镜载玻片泄漏的多余固封介质，因为其具有强粘合力，因此显然使用者难以操作。去除多余的固封介质是精巧的工艺，因为盖玻片上可能的液体污迹会损害显微镜观察。

制备物的“脱固封”是另一重要问题。事实上，在那些需要从长时间固封的显微镜载玻片中回收生物样品的情况下(为了进行进一步的测试)，为了能够移除盖玻片，如上所述，已固封的显微镜载玻片必须在二甲苯浴中保持至少3天。随时间流逝，实际上，固封介质变得不易溶于二甲苯(特别是用于溶解和/或稀释最常见固封介质的溶剂)。此外，如果没有适当进行固封介质的再溶解过程，则盖玻片的移除会导致样品与显微镜载玻片分离或部分样品被去除，从而不可避免地破坏样品本身的用于所需进一步测试的使用。

因此，显然，固封是非常耗时的，与待固封的显微镜载玻片数量成比例，并且也是由于施加固封介质和盖玻片所要求的高精度。完成已固封的显微镜载玻片干燥所需的时间应加入该时间。因此，为了加速干燥过程，使已固封的显微镜载玻片在60℃烘箱中孵育约30分钟。

关于自动过程，存在相对于手动过程的其他缺点。其中，存在仪器的精细校准。因为固封过程需要非常精确，因此设备需要毫米级校准，以避免宏观制备错误。例如，移动夹具的机构校准不准确会导致显微镜载玻片破裂；类似地，盖玻片的偏心(off-cencer)定位迫使使用者脱固封并再次固封制备物。此外，抽吸固封介质的设备的所有部件必须非常稳固，以避免形成气泡。

还存在自动盖玻器，其使用薄膜代替盖玻片；该盖玻器需要精确校准，以确保薄膜均匀铺展并且不会在显微镜载玻片上产生伪影。

此外，由于其是高精度仪器，因此，必须放置在专用隔震台上，并且也可以放置在抗震地板上。此外，有利的是将仪器置于护罩下完全水平的位置，并且清洁操作通常用二甲苯进行。

另外，仪器的清洁过程需要每天进行。在结束使用自动盖玻器时，必须从分配器单元、扣钩(clasp)和传送带以及从递送固封介质的喷嘴去除固封介质的残留物。该清洁过程是用浸有二甲苯的抹布进行的，二甲苯对使用者是有毒的，如果仪器没有放在通风橱下面则尤为如此。还应特别注意避免液体渗透到仪器和电接点内。此外，如果一些溶剂留在仪器内，则可能会出现溶剂蒸气。使用没有通风橱的设备，存在着火和中毒的风险。

因为小的显微镜载玻片碎片频繁破损，由于整个系统校准时的小瑕疵，必须从传送带、收集显微镜载玻片的框、装载框、真空杯和仪器的内部隔室去除上述碎片。另外，显然需要对所用仪器进行多个维护过程。

最后，用于免疫组织化学分析的显微镜载玻片通常在生物样品定位之前在磨砂端具有条形码标签。识别所需的这种标签可能是自动盖玻器扣钩的故障源，因为来自标签的胶水残留物常常积聚在扣钩上，因此需要二甲苯清洁。

鉴于上述情况，显然需要找到用于固封显微镜载玻片的系统，该系统可以解决与生物样品的常规固封过程相关的多个缺点。

发明目的

本发明的目的是提供固封用于生物学、细胞学、组织学和解剖学样品分析的显微镜载玻片的快速有效方法。

本发明的另一目的是提供一种特别适合用于固封本发明的显微镜载玻片的本发明方法、用于生物学、细胞学、组织学和解剖学样品分析的新型组合物。

本发明还有另一目的是提供一种组合物，该组合物允许获得没有气泡和瑕疵的固封的显微镜载玻片，并且同时提供其它优点，例如，对显微镜载玻片本身的适当保护。

本发明的另一目的是提供所述组合物用于制备用于显微镜观察的生物学、细胞学、组织学和解剖学样品的用途。

最后，本发明的一个目的是，提供用本发明方法和本发明组合物固封的生物学样品。

发明详述

根据本发明的一个方面，本发明的主题是一种固封用于生物学、细胞学、组织学和解剖学样品分析的显微镜载玻片的方法，所述方法包括将所述显微镜载玻片浸渍到至少一种流体组合物中，所述流体组合物包含：

a)选自下组的至少一种液体组分：二甲苯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸1-甲基-2-甲氧基乙酯和异链烷烃基溶剂；以及

b)选自聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚丙烯酸甲酯和聚丙烯酸乙酯的一种或多种聚合物或共聚物，其量为15％-80％([聚合物(b)的克数/100ml最终组合物])。

根据本发明的一个实施方式，本发明的主题是一种固封用于生物学、细胞学、组织学和解剖学样品分析的显微镜载玻片的方法，所述方法包括：

(i)将所述显微镜载玻片浸渍在包含如下物质的至少一种流体组合物中：

a)选自下组的至少一种液体组分：二甲苯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸1-甲基-2-甲氧基乙酯和异链烷烃基溶剂；以及

b)选自聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚丙烯酸甲酯和聚丙烯酸乙酯的一种或多种聚合物或共聚物，其量为15％-80％([聚合物(b)的克数/100ml最终组合物])；

(ii)从组合物中取出所述显微镜载玻片；

(iii)使其滴液；

(iv)任选地重复(i)至(ii)的步骤；以及

(v)使其空气干燥或用合适的方法干燥。

从(i)到(iii)的步骤可以重复两次或更多次；通常，两次浸渍就足够了。当进行两次或更多次浸渍时，组合物的组分和浓度可以彼此相同或不同。

根据一个实施方式，两种相同的组合物、优选组分(b)的浓度为约20％的两种相同的组合物进行两次浸渍。

根据一个实施方式，两种不同的组合物进行两次浸渍，所用第一组合物组分(b)的浓度为约30％，并且第二组合物组分(b)的浓度为约20％。

然而，其他实施方式是可能的，并且在本发明的范围内。

在本发明方法中，浸渍和滴落仅需要几秒/分钟，如其将在本说明书和实施例中更详细地描述。

干燥步骤(v)可以用本领域已知的任何合适的方法进行，例如，在通风橱下、烘箱中等。

除非明确说明，否则本发明中表示的所有百分比均指质量/体积百分比浓度([g/100ml])，即，组分(b)相对于100体积单位的最终组合物的重量。在实践中，例如，根据本发明，20％组合物表明在组合物中有20g聚合物(b)，其中，已加入合适量的液体组分(a)以达到总量体积为100毫升。

根据一个实施方式，所述一种或多种聚合物(b)为20-70％。

根据一个实施方式，所述一种或多种聚合物(b)为20-50％。

根据一个实施方式，所述一种或多种聚合物(b)为20-40％。

根据一个实施方式，所述一种或多种聚合物(b)为30-70％。

根据一个实施方式，所述一种或多种聚合物(b)为30-60％。

根据一个实施方式，所述一种或多种聚合物(b)为30-40％。

根据一个实施方式，所述一种或多种聚合物(b)为40-70％。

根据一个实施方式，所述一种或多种聚合物(b)为40-60％。

根据一个实施方式，所述一种或多种聚合物(b)为40-50％。

根据一个实施方式，所述一种或多种聚合物(b)为50-70％。

根据一个实施方式，所述一种或多种聚合物(b)为60-70％。

根据一个优选实施方式，所述一种或多种聚合物(b)的量为10-50％，更优选20-40％或25-45％。

根据本发明，“浸渍”或“进行浸渍”(或衍生的动词变形)表示通常将显微镜载玻片垂直地引入流体组合物中以覆盖显微镜载玻片。

在本发明中，“链烷烃基溶剂”表示包含优选具有最多达13个碳原子的脂族烃的混合物的液体组分，其中，在液体组分中所述烃混合物的量优选大于40％，优选至少50％，例如申请人以商标和ottix实际销售的产品。

根据一个优选实施方式，液体组分(a)选自下组：乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸1-甲基-2-甲氧基乙酯和它们的混合物。

根据本发明的另一个方面，本发明的主题是一种固封用于生物学、细胞学、组织学和解剖学样品分析的显微镜载玻片的组合物，所述组合物包含：

a')液体组分，其选自下组：乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸1-甲基-2-甲氧基乙酯和它们的混合物；以及

b’)选自聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚丙烯酸甲酯和聚丙烯酸乙酯的一种或多种聚合物或共聚物，其量为15％-80％([聚合物(b’)的克数/100ml最终组合物])。

所述组合物在本文中还称为“本发明组合物”。

另一方面，术语“本文所述组合物”是指本发明组合物以及与本发明方法一起的上文所述述的组合物。

根据一个优选实施方式，本发明组合物的液体组分(a’)选自下组：乙酸乙酯、乙酸1-甲基-2-甲氧基乙酯和它们的混合物。

根据一个优选实施方式，本发明组合物的聚合物或共聚物(b’)选自下组：甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸丁酯共聚物，例如，实际以商品名paraloid和elvacite销售的产品。

根据一个优选实施方式，在本发明组合物中，所述一种或多种聚合物(b’)的量为10-50％，更优选20-40％或25-45％。

根据一个优选实施方式，本发明的组合物还包含至少一种拉伸剂(stretchingagent)，例如，聚醚改性的聚甲基烷基硅氧烷，其量优选为0.1-0.3％。

根据本发明的另一个方面，本发明的主题是使用本发明组合物的如上所述方法。

本发明的主题还涉及本发明组合物用于制备生物学、细胞学、组织学和解剖学样品(在下文中也仅称为生物样品)的显微镜载玻片的用途。

本文所述的组合物可基本上类似于树脂，并可用于在光学显微镜下固封样品，该样品通常为生物样品。

在本发明中，“树脂”是指液体粘性材料，其可以在特定条件下硬化，如下文所述。

在本发明中，“固封”是指在制备常规生物样品(例如，在组织学或细胞学以及其它类型样品)的过程中为了进行显微镜分析通常在显微镜载玻片上进行的最后步骤，这是本领域技术人员所熟知的。

根据一些实施方式，本文所述的组合物还可包含除上文所提及的那些之外的其它组分。

实际上，在一个实施方式中，本文所述的组合物还包含目前以商品名(包含异链烷烃)、(包含二甲苯和乙苯)、(包含二甲苯)和(包含甲苯和丙烯酸酯聚合物)销售的一种或多种固封介质，其量为相对于由(a)或(a')和(b)或(b')形成的组合物的总体积的5体积/体积％至30体积/体积％。

本文所述的组合物可以包含可以改进组合物与显微镜载玻片粘附性的组分(“粘结增强剂”化合物)，例如，一种或多种官能化有机硅烷衍生物，优选γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷；这些组分优选为0.5％-10％，更优选为1％-5％。

此外，本文所述的组合物可包含抗刮擦剂，例如聚硅氧烷(即，硅氧烷)和/或链烷烃，优选聚二甲基硅氧烷和/或拉伸剂，例如聚醚改性的聚甲基烷基硅氧烷，例如以商品名实际销售的产品；这些组分的含量优选为0.01％-5％，更优选为0.1％-1％。

本文所述的组合物可进一步包含抗氧化剂，优选官能化的酚和/或芳族胺，还更优选丁基羟基甲苯(bht)；这些组分优选为0.05-2％，更优选为0.1％-1％。

本文所述的组合物还可包含能够保护组合物本身免受uv光影响的一些组分(“uv吸收剂”)，优选官能化的二苯甲酮和/或苯并三唑，例如2-羟基二苯甲酮、4-羟基二苯甲酮和2-羟基苯基苯并三唑。这些组分优选为0.01％-2％，更优选0.1％-1％。

此外，本文所述的组合物可包含增塑剂，优选选自下组的至少一种增塑剂：邻苯二甲酸盐/酯、己二酸盐/酯和苯甲酸盐/酯；优选为0.05％-5％，优选为0.1％-3％。

本领域技术人员可以完全理解组合物中上述各组分的效用。

制备本文所述组合物的方法不需要关键条件或过程。事实上，该方法完全可以在室温下发生，并且可以在配有盖子或其他种类的封闭物的容器(优选不透明或琥珀色容器)中进行，以避免液体组分的蒸发。向该容器中加入液体组分，然后在机械或磁力搅拌下，加入组成本文所述组合物或其优选实施方式之一的其它元素。最后，使其继续搅拌直至获得澄清的均匀混合物。在实验部分中提供了一些说明性实施方式的制备方法的实际实施例。

如下文广泛解释，本文所述的组合物可以有效地保护生物样品并且不会在显微镜下产生变形，因为所述组合物是超透明的，并且另外再现了盖玻片的所有功能特征。此外，本文所述组合物的特征在于：对显微镜载玻片的粘附性高、抗机械应力性和随时间的稳定性高。另外，就其性质而言，本文所述的组合物不会干扰材料，不会在结构中产生改变或伪影或使样品染色。

构成本文所述组合物的聚合物的独特组合同时赋予材料韧性和刚性。显然，需要一定程度的韧性才能在显微镜载玻片的整个区域上形成平坦且均匀的层，其均匀地覆盖显微镜载玻片约3-6微米，而没有组合物完全干燥后在切片边缘处破裂的风险。同时，必须为本文所述的组合物提供刚性，以便形成保护屏障，例如，其能抵抗机械应力，从而有效地保护样品。

此外，本文所述的组合物具有非常接近显微镜载玻片的折射率(1.48-1.50)，从而对裸眼是超透明的(如图3所示)。

本文所述的组合物、优选根据本发明的组合物特别适用于固封用于显微镜观察的显微镜载玻片，因为其不会使生物样品产生像差、变形和颜色变化；事实上，可以从描绘用本文所述组合物固封的生物样品的显微镜图像图4中注意到，该样品看起来超透明，完全适合观察，并且没有任何变形或像差。

可以精确调节本文所述组合物的粘度，以避免引入气泡，同时促进显微镜载玻片上合适厚度的层的粘附和在施加该组合物后自动平坦化。通过改变聚合物和液体组分之间的比例可以实现粘度的调节；如本领域技术人员所清楚的，通过增加本文所述组合物中液体组分的量，使粘度降低，反之亦然。

此外，本文所述组合物与水的完全不混溶使得其成为不能被空气湿气改变的材料。另一方面，它可溶于二甲苯、甲苯和柠檬烯基溶剂和异链烷烃基溶剂。

在那些需要使已固封的显微镜载玻片脱固封的情况下，例如，为了进一步分析组织细胞学材料，除了在组合物中并且能够溶解组合物的溶剂或溶剂混合物之外，通过将样品简单地浸渍在上述溶剂之一中，可以从显微镜载玻片上除去本文所述的组合物。组合物再溶解和样品脱固封的操作需要很少的时间，即，几分钟(5-7分钟)，明显短于提供需要几天时间的使用常规(即，通过封固介质和盖玻片)固封的显微镜载玻片的相同过程。

因此很清楚，本文所述组合物在显微镜载玻片表面上的应用导致相对于常规固封方法的多个优点。事实上，如上所述，该应用产生均匀、平坦、超透明、无气泡的薄膜，并且不需要采用如已知和常规技术那样的盖玻片，并且允许快速脱固封并具有合适的刚性和韧性特征。

不需要采用盖玻片的事实是本发明提供的重要结果。

在一些零星情况下，例如在40倍或更高的放大倍数下，待分析样品的观察可能是次优的。然而，已发现可以通过简单地在物镜上施加盖玻片(周长非常小，与物镜的周长成比例)，通过水基粘合剂混合物来修正可能不完美的聚焦，该混合物不会损坏物镜本身，可以很容易去除。因此，在根据本发明的已固封样品不能进行充分分析的情况下，将显微镜载玻片作为物镜上的接触镜片(contactlen)进行倾斜是足够的。对于该应用，可以使用一滴水基粘合剂混合物，例如，包含如下物质的混合物、以及优选由以下物质组成的混合物：

-pvp(聚乙烯吡咯烷酮)，浓度为2至20％；

-peg400，浓度为5至20％；以及

-适量水，一直到100毫升。

该混合物具有粘合性，完全安全，具有高折射率(约1.50)，并且如果必须将其去除，则使用水就足够了。

本发明方法和本文所述组合物的另一个优点在于，允许在将组合物本身施加于一个或多个显微镜载玻片上之后使本文所述组合物(其类似于树脂)固化的条件。事实上，这些条件不需要uv照射，而是简单地暴露在空气中或约50℃温度，在后一种情况下，相对于单独的空气暴露节省了时间。

因此，本文所述组合物的固化条件导致与生物样品的稳定性限制相关的显著优点，所述稳定性限制不能以可接受的方式容忍延长的热应力或持续的uv照射。由于这些应力，存在样品的各种特征被改变的真实可能性，例如，由于与dna、整体生物结构和染料的干扰，因此在样品结构中产生改变或伪影。

另一方面，通过uv的聚合过程需要显微镜载玻片相对于uv源的明确限定的取向，并且次优取向会延长照射时间，从而损坏生物样品。另一方面，如果使用通常的自动染色机，将显微镜载玻片放入框中，为了实现显微镜载玻片相对于uv源的最佳取向，使用者将被迫进行干预以将其从框处移出并放置在合适的表面上，这是一个需要时间并弱化了自动处理优点的操作。

不同的是，本发明允许使用者通过单个简单的过程将显微镜载玻片直接固封到用于染色的框中，而无需移除/重新调整显微镜载玻片。

由本文所述组合物提供的另一个优点是固化所述组合物所需的时间短，但在任何情况下留给使用者或自动仪器的时间足以方便地操作待固封的显微镜载玻片。

事实上，本文所述组合物的固化时间是允许使用者或自动仪器适当处理待固封的显微镜载玻片的理想时间，因此同时允许迅捷且快速的固封操作并显著减少生物样品的制备时间，从而优化工作流程。

由于一个或多个显微镜载玻片(通常以垂直位置)简单快速地浸入所述组合物中，因此本文所述的组合物可适当地施加到待固封的显微镜载玻片上。根据树脂的所需厚度，可以进行多次浸渍。因此显然，组合物的粘度也影响浸渍期间施加到显微镜载玻片上的树脂厚度。

例如，可以进行双重浸渍，其提供了将显微镜载玻片引入含有20％本发明组合物的两个工位中。根据一个实施方式，可以提供如下全部过程：在约20％的第一树脂中浸渍约1.5分钟，滴液约1分钟，在20％树脂中进行约1.5分钟第二次浸渍，最后滴液约1分钟，并空气干燥或烘箱干燥。

或者，可以在含有两种不同浓度树脂的两个工位中进行显微镜载玻片的双重浸渍；例如首先在30％树脂中浸渍约1.5分钟，滴液约1分钟，然后在20％树脂中进行10秒钟第二次浸渍，然后滴液约1分钟。

就组合物的浸渍和/或滴液和/或定性定量组成而言，其它可能的解决方案显然在本领域专家的技术范围内。

对于本文所述组合物的浸渍，显微镜载玻片可有利地容纳在如图5和图6中所述的框中。

图5和6具体显示了适于放置显微镜载玻片的框，其必须浸渍在本文所述的组合物中，以实施本发明的方法。特别是，图5显示了具有单个显微镜载玻片的框，图6显示了容纳所有显微镜载玻片的框，准备用于根据本发明的方法进行浸渍。

参见图5和图6，所述框由主体(1)制成，其特征在于可以通过适度压力将显微镜载玻片(3)插入其中的狭缝(2)。在该主体上连接有手柄(4)，该手柄允许借助于自动染色机的移动臂进行拾取和运输过程。重要的是，显微镜载玻片通过显微镜载玻片本身的(进入到切片中的)磨砂带容纳在框中。显微镜载玻片的剩余表面将保持无约束，以使本文所述的组合物覆盖显微镜载玻片，然后在浸渍之后立即(即，在“滴落”步骤中)通过重力均匀地滴落。

如本文所述的框及其在根据本发明的方法中的用途构成了本发明的另一主题。

显然，根据本发明的方法产生了所有上述优点以及许多其他优点。

在这些额外的优点中，存在进一步且显著的省时。事实上，如在本说明书的实验部分中所示，在本文所述组合物中的浸渍步骤可以同时涉及更多的显微镜载玻片，即，其可以在可变数量的显微镜载玻片上平行进行，例如，如果使用标准框作为载体，则最多达30个。这导致相对于常规固封过程明显省时，常规固封提供了固封介质和盖玻片一次设置一个样品，即按顺序地。

在包含待固封/已固封的显微镜载玻片的框内的本发明所述组合物可以通过用合适的溶剂(例如，二甲苯或其替代物)，或用乙酸乙酯快速洗涤框而容易地去除。

此外，本发明所述的组合物允许使用者将显微镜载玻片直接固封到通常用于染色的框中，使用一个简单的动作(框的浸渍)而无需去除和重新定位显微镜载玻片，进一步节省时间。例如，在实验部分中将对用于固封样品的手动方法(其包括使用本文所述的组合物和通常用于染色的框)进行描述。

除了用于手动固封的常规过程之外，本文所述的组合物还可以容易地用于常规的自动染色机中，其通常用于制备生物样品并且是本领域技术人员明确已知的。这是非常有利的，因为自动染色机并不具有上文讨论的自动盖玻器所具有的所有关键问题，例如仪器的精确和精细校准，而且这将允许提供精确的固封过程而无需任何使用者的使用。

作为说明，自动染色机是包括各种容纳流体(通常是染色溶液)的罐和机械臂的仪器。机械臂可以自动抬起、定位和将待染色的包含显微镜载玻片的框浸渍到各种罐中。可以对机械臂进行编程，以便限定各种罐中的浸渍顺序，以及各罐中的浸渍时间

本文所述组合物的这种应用提供了相对于常规固封方法数倍的省时，并且例如，在实验部分中将描述包括自动染色机和本文所述组合物的固封方法。

此外，与用于固封显微镜载玻片的已知组合物和树脂不同，本文所述的组合物、特别是本发明的组合物特别适用于实现本发明的方法，其具有该目的所需的特征。事实上，对于已知的组合物和树脂，由于不适合这种技术的所述已知组合物和树脂的粘度，不可能通过将显微镜载玻片浸渍到组合物中的技术来固封显微镜载玻片。

显然，由于本文所述的组合物，固封过程的省时是显而易见。实际上，常规固封过程(手动或自动)需要与显微镜载玻片的数量成比例的时间。将在实验部分中提供常规固封过程的比较例。

因此，本文所述的组合物允许通过用单个步骤替换来去除旨在一次制备一个样品的一系列精确步骤，所述单个步骤可以一次用于多个显微镜载玻片，而没有不精确性，并且高度可再现。

根据本发明的用途提供了制备用于显微镜分析的样品、特别是用于样品制备的固封步骤的上述所有优点，其中，例如生物样品的可再现加工、更精确以及显著省时。

最后，本发明的主题是用本文所述组合物固封的生物学、细胞学、组织学和解剖学样品，有利地是使用本发明的组合物和使用该组合物的本发明方法和所述样品，特征在于其不包括盖玻片。

附图说明

图1和2描绘了在固封过程结束时干燥后的本文所述组合物。

图3显示了本文所述组合物的超高透明度。

图4显示了显示用本文所述组合物固封的生物样品的显微镜图像。

图5和6显示了可用于本发明方法的框。

实验部分

实施例1

用于本发明方法的组合物的一个实施方式的制备方法

在不透明的容器中装入800ml乙酸丁酯。加入1.05g正十八烷基-3-(3',5'-二叔丁基-4'-羟基苯基)丙酸酯(抗氧化剂)并搅拌直至完全溶解，即，约2分钟。此时，加入200g聚甲基丙烯酸甲酯，在室温下搅拌约2小时，直至得到澄清的均匀混合物。然后加入10.45g/ml的γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(“粘结增强剂”)和10g己二酸2-乙基己酯(增塑剂)。

该方法完全在室温下进行，仅在获得澄清的均匀混合物后才停止机械搅拌(约20分钟)。因此，最终制剂看起来是粘稠且无颗粒的。

实施例2

用于本发明方法的组合物的一个实施方式的制备方法

为了生产1升溶液，不透明容器中装入700ml二甲苯。加入1.7g丁基羟基甲苯(bht)(抗氧化剂)并搅拌直至获得澄清的均匀混合物，即，约2分钟。此时，加入300g聚甲基丙烯酸甲酯，在室温下搅拌约2小时，直至得到澄清的均匀混合物。然后，仍然在室温下加入2g液体链烷烃(抗刮擦剂)和2.1g的2-(5-叔丁基羟基苯基)苯并三唑(“uv吸收剂”)。在搅拌约30分钟后，获得澄清的均匀混合物。因此，最终制剂看起来是粘稠且无颗粒的。

实施例3

用于本发明方法的组合物的一个实施方式的制备方法

为了生产1升溶液，不透明容器中装入600ml二甲苯。加入2g正十八烷基-3-(3',5'-二叔丁基-4'-羟基苯基)丙酸酯(抗氧化剂)并搅拌直至获得澄清的均匀混合物，即，约2分钟。此时，加入400g聚甲基丙烯酸丁酯，在室温下搅拌约2小时，直至得到澄清的均匀混合物。然后，仍然在室温下加入15g的邻苯二甲酸二丁酯(增塑剂)。在搅拌约30分钟后，获得澄清的均匀混合物，该混合物看起来是粘稠且无颗粒的。

实施例4

用于本发明方法的组合物的一个实施方式的制备方法

在不透明的容器中装入1000ml二甲苯和250ml的加入400g聚甲基丙烯酸丁酯，在室温下搅拌约2小时，直至得到澄清均匀、粘稠且无颗粒的混合物。

实施例5

用于本发明方法的组合物的一个实施方式的制备方法

在不透明的容器中装入800ml二甲苯和240ml的加入250g聚甲基丙烯酸乙酯，在室温下搅拌约2小时，直至得到澄清均匀、粘稠且无颗粒的混合物。

实施例6

用于本发明方法的组合物的一个实施方式的制备方法

在不透明的容器中装入800ml二甲苯和100ml的加入200g聚丙烯酸乙酯，在室温下搅拌约2小时，直至得到澄清均匀、粘稠且无颗粒的混合物。

实施例7

一个实施方式的本发明组合物的制备方法

在不透明的容器中装入400ml乙酸乙酯和400ml乙酸1-甲基-2-甲氧基乙酯。加入200g的paraloid和1g的(聚醚改性的聚甲基烷基硅氧烷)，在室温下搅拌约2小时，直至得到澄清均匀、粘稠且无颗粒的混合物。

实施例8

一个实施方式的本发明组合物的制备方法

在不透明的容器中装入350ml乙酸乙酯和350ml乙酸1-甲基-2-甲氧基乙酯。加入300g的elvacite(甲基丙烯酸甲酯/甲基丙烯酸正丁酯共聚物)和1.5g的(聚醚改性的聚甲基烷基硅氧烷)，在室温下搅拌约2小时，直至得到澄清均匀、粘稠且无颗粒的混合物。

实施例9

固封方法

实施例9.1(比较例)

常规手动固封过程

在以醇洗涤结束的常见手动染色过程结束时，30个显微镜载玻片中的每一个经历以下步骤：(i)将显微镜载玻片水平放置在工作台上；(ii)将适量固封介质递送至显微镜载玻片(约2滴)；(iii)放置盖玻片；和(iv)调整盖玻片。固封每个显微镜载玻片所需的总时间：约12秒；乘以每个显微镜载玻片：约360秒(即，约6分钟)。

对于所有显微镜载玻片的常规固封所花费的总时间，应该增加固封介质的干燥时间，其花费约20分钟进行可接受地干燥，总固封时间为约26分30秒。

与上面所描述的不同，利用根据本发明的方法并考虑两次浸渍可以节省时间，如下文实施例中可见。

此外，如从刚刚描述的实施例可见，除了花费大量时间之外，常规固封所需的上述四个步骤绝对不可能没有不精确或错误，这些是特别重要的特征。因此，在下列情况下，上述步骤的总时间进一步增加：(1)在显微镜载玻片上过量添加固封介质，并且需要除去过量的固封介质；(2)固封介质从显微镜载玻片漏出，并且需要等待其完全和彻底干燥以实现工作流程的实际管理。

最后，需要在固封过程之后至少等待一天以有效存储如此固封的显微镜载玻片，因为需要等其彻底干燥。

实施例9.2

使用本发明方法的手动固封过程

在以二甲苯洗涤(或类似溶剂)结束的常规手动染色方法之后，使含有25个显微镜载玻片的框手动浸渍到含有实施例7组合物的罐中约1.5分钟，之后通过滴液1分钟去除过量的组合物，并且在相同的组合物中进行约1.5分钟的第二次浸渍，然后滴液约1分钟。最后，已固封的显微镜载玻片在50℃下干燥15分钟，总工作时间为20分钟。

或者，可将25个已固封的显微镜载玻片置于65℃的烘箱中约5分钟，从而提供总体时间为约10分钟的固封过程。

以这种方式固封的显微镜载玻片显示在图5和6中。

实施例9.3

使用本发明方法的自动固封过程

在通过自动染色机进行以二甲苯洗涤结束的常规染色处理之后，通过自动臂取出25个显微镜载玻片(刚染色的)并在自动染色机的含有实施例8组合物的罐中浸渍1.5分钟。然后，自动染色机的自动臂将显微镜载玻片转移到空罐中，以便去除过量的组合物1分钟，然后将显微镜载玻片浸渍在含有实施例7组合物的罐中10秒，然后将其转移到空罐中，以便去除过量的组合物1分钟，并彻底空气干燥，或者将其放入烘箱中进行短时间干燥。

显微镜载玻片的该简化固封过程在染色后立即开始，并在几分钟内完成，而不以任何方式影响使用者。

显然，考虑使用本文所述组合物的固封过程(即，实施例9.2和9.3)提供了相对于常规固封(如实施例9.1中所述)所需时间的重要的时间节省，因此减少了用于制备生物样品的总时间，并且优化了工作流程，并且还消除了由于使用者操作导致的气泡、平坦化和可能的不准确性的问题。