使用循环癌症相关巨噬细胞样细胞(CAML)预测患癌对象总生存期和无进展生存期的方法与流程

本发明一般涉及生物标志物在血液和其他体液中预测患有癌症(例如实体瘤)的对象的总生存期和无进展生存期的用途。

背景技术：

当肿瘤细胞脱离原发性实体瘤时，它们渗入血液或淋巴循环，最终离开血流并进入器官或组织形成转移。90％的癌症相关死亡是由转移过程引起的。最常见的转移部位是肺、肝、骨和脑。在循环中发现的肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞(ctc)。许多研究出版物和临床试验显示，ctc具有临床实用性：(i)通过计算血流中的ctc来提供预后生存和癌症复发信息，和(ii)通过检查蛋白表达水平以及ctc中的基因突变和易位的发生来提供治疗信息。然而，即使在iv期癌症患者中，ctc与对象中癌症的发展和/或存在也不是一致相关。尽管ctc最常见于乳腺癌、前列腺癌和结肠直肠癌的iv期，但它们在相同癌症的早期阶段很少见。ctc在其他癌症中也很少见。

循环癌症相关巨噬细胞样细胞(caml)是在患癌症对象的血液中发现的另一种癌症相关细胞类型。caml与所有测试的实体肿瘤和癌症的所有阶段相关。caml是多倍体并且尺寸非常大，尺寸为～25μm至～300μm。这些多倍体细胞可以是cd45(-)或cd45(+)并表达cd11c、cd14和cd31，这证实了它们作为髓系的起源。它们经常在吞噬ctc和细胞碎片的过程中被发现[1,7]。

与血液和其他体液中的生物标志物(例如caml)的鉴定和表征相关的测定可用于提供预后信息。本发明涉及为临床医生和其他重要目标提供这样的工具。

技术实现要素：

本发明涉及使用一类具有独特特征的细胞的方法，在患有实体瘤(包括恶性上皮肿瘤(carcinoma)、肉瘤、成神经细胞瘤和黑素瘤)的对象的血液中发现所述细胞。这些循环细胞称为“循环癌症相关巨噬细胞样细胞”(caml)，已显示其与患有癌症的对象中实体瘤的存在相关。已经表征和描述了与caml相关的五种形态[1,2]。已经通过使用精密微过滤器的微滤，在患有i期至iv期实体瘤的对象的外周血中一致地发现caml。

与caml相关的医学应用包括但不限于使用该细胞作为生物标志物以提供癌症的早期检测和癌症的诊断，特别是在癌症再现或复发的早期检测和诊断中，以及在确定癌症突变中。还通过本文呈现的数据显示caml作为在疾病进展和患者生存期方面进行预测的生物标志物，具有临床实用性。

caml可单独用作癌症标志物，或与循环肿瘤细胞(ctc)、上皮间充质转化细胞(emt)、循环癌症相关血管内皮细胞(cave)、游离dna(cfdna)、循环肿瘤dna(ctdna)、甲基化dna、蛋白质组学、代谢组学、脂质组学和其他生物标志物组合使用，以提供对患者疾病的更完整的了解。

更具体地，并且在第一实施例中，本发明涉及用于预测患有癌症的对象的总生存期(os)和无进展生存期(pfs)的方法。这些方法包括确定来自患有癌症的第一对象的生物样本中的循环细胞的尺寸，并将结果与患有癌症的第二对象进行比较。预测具有较大尺寸细胞的对象的os和pfs小于具有较小尺寸细胞的对象的os和pfs。

在一个方面，该方法包括确定来自患有癌症的对象的生物样本中的循环细胞的尺寸，其中，当所述样本中的至少一个细胞的尺寸约为50μm或更大时，预测该对象的os和pfs小于患有癌症且没有一个细胞的尺寸超过约50μm的对象。

在第二实施例中，本发明涉及用于预测患有癌症的对象的os和pfs的方法。该方法包括确定来自患有癌症的对象的选定体积的生物样本中的循环细胞的比例，其中，当所述比例相当于每7.5ml生物样本约6个或更多个细胞时，预测该对象的os和pfs小于患有癌症且比例相当于每7.5ml生物样本少于6个细胞的对象。

在第三实施例中，本发明涉及用于预测患有癌症的对象的os和pfs的方法。该方法包括确定来自患有癌症的对象的生物样本中循环细胞中cep17点的数量，其中，当所述样本中的至少一个细胞具有约10个或更多个cep17点时，预测该对象的os和pfs小于患有癌症且来自对象的生物样本中的细胞没有约10个或更多个cep17点的对象。

在本发明实施例的某些方面，os或pfs或两者为至少12个月的时期。在本发明实施例的其他方面，os或pfs或两者为至少24个月的时期。

在本发明实施例的某些方面，生物样本的尺寸在5至15ml之间。

在本发明的每个实施例和方面中，循环细胞可以定义为具有以下每个特征：

(a)大的非典型多倍体核，尺寸约为14-64μm，或单个细胞中有多个核；

(b)细胞尺寸约20-300μm；和

(c)形态学形状选自由纺锤形、蝌蚪形、圆形、椭圆形(oblong)、两条腿、多于两条腿、细腿和无定形组成的组。

在本发明实施例的某些方面，循环细胞可进一步定义为具有以下一个或多个附加特征：

(d)cd14阳性表型；

(e)cd45表达；

(f)epcam表达；

(g)波形蛋白表达；

(h)pd-l1表达；

(i)单核细胞cd11c标志物表达；

(j)内皮cd146标志物表达；

(k)内皮cd202b标志物表达；和

(l)内皮cd31标志物表达。

在本发明的每个方面和实施例中，循环细胞可以称为“癌症相关巨噬细胞样细胞”或caml。

在本发明实施例的某些方面，生物样本的来源可以是，但不限于，外周血、血液、淋巴结、骨髓、脑脊髓液、组织和尿液中的一种或多种。例如，当生物样本是血液时，血液可以是肘前静脉血、下腔静脉血、股静脉血、门静脉血或颈静脉血。样本可以是新鲜样本或解冻的适当制备的冷冻保存的样本。

在本发明实施例的某些方面，癌症是实体瘤、i期癌症、ii期癌症、iii期癌症、iv期癌症、恶性上皮肿瘤、肉瘤、成神经细胞瘤、黑素瘤、上皮细胞癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肝癌、头颈癌、肾癌、卵巢癌、食道癌或其他实体瘤癌症。

在本发明实施例的某些方面，使用一种或多种手段从生物样本中分离循环细胞用于确定步骤，所述手段选自尺寸排阻方法、免疫捕获、红细胞裂解、白细胞耗竭、ficoll、电泳、介电泳、流式细胞术、磁悬浮和各种微流控芯片或其组合。

在本发明的一个方面，使用包括使用微过滤器的尺寸排阻方法从生物样本中分离循环细胞。微过滤器的孔径可以在约5微米至约20微米的范围。微过滤器的孔可以具有圆形、跑道形状、椭圆形、正方形和/或矩形孔形状。微过滤器可具有精确的孔几何形状和/或均匀的孔分布。

在本发明的另一方面，使用微流控芯片通过基于物理尺寸的分选、基于流体动力学尺寸的分选、分组、捕捉(trapping)、免疫捕获、浓缩大细胞或基于尺寸消除小细胞从生物样本中分离循环细胞。

在本发明的进一步的方面，使用cellsieve^tm低压微滤测定法从生物样本中分离循环细胞。

附图说明

图1显示了用于鉴定和亚型分型caml的细胞分化标志物的强度。

图2比较了六种不同癌症和不同癌症阶段中ctc相对于caml的存在。

图3a-3b显示了不同癌症阶段中caml尺寸的平均数量。

图4显示了caml尺寸与每个细胞的cep17点数量之间的关系。

图5显示了发现组n＝157名患者和验证组n＝158名患者的24个月的总生存期(os)概率图。对caml尺寸≥50μm和<50μm的数据进行分析。发现组(n＝157)；危险比：3.4(95％ci＝2.1-5.6，p<0.001)。验证组(n＝158)；危险比：4.2(95％ci＝2.3-7.7，p<0.001)。

图6显示了发现组n＝157名患者和验证组n＝158名患者的24个月的无进展生存期(pfs)概率图。对caml尺寸≥50μm和<50μm进行数据分析。发现组(n＝157)；危险比：3.2(95％ci＝2.1-5.0，p<0.001)。验证组(n＝158)；危险比：3.8(95％ci＝2.7-6.8，p<0.001)。

图7显示了24个月的os(左图)和pfs(右图)，该分析针对caml数量≥6和<6的n＝293名患者样本。

图8显示了24个月的os(左图)和pfs(右图)，该分析针对caml尺寸≥50μm和<50μm的n＝293名患者样本。

图9显示了24个月的pfs，该分析针对caml尺寸<50μm、50-110μm和>110μm的i期和ii期(左图)以及iii期和iv期(右图)的n＝293名患者样本。

图10a显示了i期患者(n＝62)的24个月的os(左图)和pfs(右图)，该分析针对caml尺寸≥50μm和<50μm。

图10b显示了ii期患者(n＝72)的24个月的os(左图)和pfs(右图)，该分析针对caml尺寸≥50μm和<50μm。

图10c显示了iii期患者(n＝69)的24个月的os(左图)和pfs(右图)，该分析针对caml尺寸≥50μm和<50μm。

图10d显示了iv期患者(n＝106)的24个月的os(左图)和pfs(右图)，该分析针对caml尺寸≥50μm和<50μm。

图11a显示了乳腺癌患者(n＝59)的24个月的os(左图)和pfs(右图)，该分析针对caml尺寸≥50μm和<50μm。

图11b显示了食道癌患者(n＝27)的24个月的os(左图)和pfs(右图)，该分析针对caml尺寸≥50μm和<50μm。

图11c显示了非小细胞肺癌(nsclc)患者(n＝59)的24个月的os(左图)和pfs(右图)，该分析针对caml尺寸≥50μm和<50μm。

图11d显示了食道癌患者(n＝59)的24个月的os(左图)和pfs(右图)，该分析针对caml尺寸≥50μm和<50μm。

图11e显示了前列腺癌患者(n＝74)的24个月的os(左图)和pfs(右图)，该分析针对caml尺寸≥50μm和<50μm。

图11f显示了肾细胞癌患者(n＝37)的24个月的os(左图)和pfs(右图)，该分析针对caml尺寸≥50μm和<50μm。

具体实施方式

说明书中定义的内容(例如详细的结构和元件)只不过是为了帮助全面理解本发明而提供的内容。因此，本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对本文描述的实施例进行各种改变和修改。

癌症是世界上最可怕的疾病之一，影响着所有国家的所有人口和种族。大约40％的男性和女性在其一生中会患上癌症。仅在美国，在任何特定时间都有超过1200万癌症患者，预计2018年新增癌症病例170万例，死亡人数超过60万例。估计全世界的癌症死亡人数约为每年800万人，其中300万发生在患者可以获得治疗的发达国家。

理想情况下，将有一种诊断方法可以快速确定所选疗法是否有效并为生存提供预后。

在本公开中，发现在来自i-iv期的实体瘤患者的血液中呈现的一种细胞类型比任何其他癌症相关细胞更一致。这些循环细胞是巨噬细胞样细胞，其含有与原发性肿瘤相同的肿瘤标志物，并且它们在本文中称为循环癌症相关巨噬细胞样细胞(caml)。

与循环肿瘤细胞(ctc)一起，可以分离和表征存在于来自患有癌症的患者的生物样本中的caml，例如通过使用尺寸排阻方法，包括微滤方法。微过滤器可以形成足够大的孔，以允许红细胞和大多数白细胞通过，同时保留较大的细胞，例如ctc和caml。然后，可以直接在过滤器上或通过其他方式表征已收集的细胞。

caml在单独使用时具有许多临床实用性。此外，生物样本中caml的表征可以与血液中其他标志物(如ctc、游离dna和游离蛋白质)的测定组合，以进一步提高诊断技术的灵敏度和特异性。对于caml和ctc尤其如此，因为它们可以使用相同的手段同时分离和鉴定。

循环肿瘤细胞

如本文所定义，与恶性上皮肿瘤相关的ctc表达许多细胞角蛋白(ck)。ck8、18和19是最常表达并用于诊断的细胞角蛋白，但是测量不必仅限于这些标志物。实体瘤ctc的表面通常表达上皮细胞粘附分子(epcam)。但是，这种表达不统一或不一致。ctc不表达任何cd45，因为它是白细胞标志物。在鉴定肿瘤相关细胞(例如ctc和caml)的测定中，使用针对实体瘤相关标志物(例如ck8、18和19)的抗体或针对cd45或dapi的抗体就足够了。将染色技术与形态学组合，可以鉴定病理学上可定义的ctc(pdctc)、凋亡ctc和caml[3]。

实体瘤相关pdctc表达ck8、18和19，并且可以通过以下特征鉴定和定义：

·被dapi染色的“癌症样”细胞核。原子核通常是大的，具有点样。例外情况是细胞在分裂时。细胞核也可以浓缩。

·表达ck8、18和19中的一个或多个；来自上皮癌的ctc通常表达至少ck8、18和19。细胞角蛋白具有丝状样。

·缺乏cd45表达。

癌症相关凋亡ctc表达ck8、18和19，并且可以通过以下特征鉴定和定义：

·降解核。

·表达ck8、18和19中的一个或多个；并非所有细胞角蛋白都是丝状样，但是部分或整体看起来是斑点形式的碎片。

·缺乏cd45表达。

循环癌症相关巨噬细胞样细胞(caml)

如本文所定义，本发明方法中使用的循环细胞可称为“caml”。每次对“循环细胞”的引用与caml同义，并且每次对“caml”的引用与循环细胞同义。无论称为caml还是“循环细胞”，这些细胞的特征在于具有以下一个或多个特点：

·caml具有大的非典型多倍体细胞核或多个单独的细胞核，通常散布在细胞中，尽管扩大的融合核仁是常见的。caml核的直径尺寸通常在约10μm至约70μm的范围，更通常直径尺寸在约14μm至约64μm的范围。

·对于许多癌症，caml表达该疾病的癌症标志物。例如，上皮癌相关caml可以表达ck8、18或19，波形蛋白等。标志物通常是弥漫性的，或与液泡和/或摄入的物质相关。任何标志物的染色样式几乎均匀地在整个细胞中扩散。对于肉瘤、成神经细胞瘤和黑素瘤，可以使用与癌症相关的其他标志物代替ck8、18或19。

·caml可以是cd45阳性或cd45阴性，且本发明包括两种类型的caml的使用。

·caml是大的，最长尺寸为约20微米至约300微米。

·发现caml具有许多不同的形态学形状，包括纺锤形、蝌蚪形、圆形、椭圆形、两条腿、多于两条腿、细腿或无定形形状。

·来自恶性上皮肿瘤的caml通常具有弥漫性的细胞角蛋白。

·如果caml表达epcam，则epcam通常在整个细胞中扩散，或与液泡和/或摄入的物质相关，并且在整个细胞中几乎均匀，但并非所有caml表达epcam，因为一些肿瘤epcam表达非常低或没有。

·如果caml表达标志物，则该标志物通常在整个细胞中扩散，或与空泡和/或摄入的物质相关，并且在整个细胞中几乎均匀，但并非所有caml都以同等强度表达相同的标志物。

·caml经常表达与肿瘤起源标志物相关的标志物；例如，如果肿瘤是前列腺癌起源并且表达psma，则来自这样的患者的caml也表达psma。作为另一示例，如果原发性肿瘤是胰腺起源并且表达pdx-1，那么来自这样的患者的caml也表达pdx-1。作为进一步的示例，如果原发性肿瘤或癌症起源的ctc表达cxcr-4，则来自这样的患者的caml也表达cxcr-4。

·如果原发性肿瘤或源自癌症的ctc表达药物靶标的生物标志物，则来自这样的患者的caml也表达药物靶标的生物标志物。免疫疗法的这种生物标志物的一个示例是pd-l1。

·caml表达单核细胞标志物(例如cd11c、cd14)和内皮标志物(例如cd146、cd202b、cd31)。

·caml具有结合fc片段的能力。

评估了一组广泛的标志物在caml上的表达，结果显示在图1中。在本发明的一个方面，本发明的caml表达图1显示的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或全部21种标志物。对来自患有不同癌症的93名不同患者的1118种caml筛选标志物。最初分离caml并用dapi、细胞角蛋白和cd45鉴定；然后，依次对总共27种标志物重新染色，包括骨髓/巨噬细胞、白细胞、巨核细胞、上皮细胞、内皮细胞、祖/干和运动标志物。从图1中可以看出，标志物表达范围为0％至96％。发现几乎所有caml都表达cd31的水平，并且通常共表达细胞角蛋白、cd14、cxcr4、波形蛋白和其他标志物。然而，虽然caml含有清晰的髓系标志物(cd14)，但cd31标志物更常表达，为96％。

caml还存在许多表型，这些表型似乎与经典细胞分化的理解不匹配(即cd45[白细胞]和细胞角蛋白[上皮细胞]、cd11c[巨噬细胞]和cd41[巨核细胞]、cd146[内皮]和cd41cd61[巨核细胞]、cd41/cd61[巨核细胞]以及cd68/cd163[清道夫巨噬细胞]共表达)。许多标志物出现在多种细胞类型上。综合起来，这些数据显示caml是在它们的分化过程早期的骨髓衍生细胞，具有许多与干细胞和促血管生成能力相关的表型属性。

caml可以通过比色染色(例如h&e)或如图1所示的特定标志物的荧光染色来可视化。对于细胞质，cd31是最阳性的表型。推荐单独的cd31，或与图1中的其他阳性标志物组合，或与肿瘤相关癌症标志物组合。

在本发明的各个实施例和方面中，循环细胞和caml可以定义为具有以下特征的细胞：(a)尺寸约为14-64μm的大的非典型多倍体细胞核，或单个细胞中的多个细胞核；(b)细胞尺寸约为20-300微米；(c)形态学形状选自由纺锤形、蝌蚪形、圆形、椭圆形、两条腿、多于两条腿、细腿和无定形组成的组。在进一步的实施例中，caml可以定义为还具有以下一个或多个附加特征：(d)cd14阳性表型；(e)cd45表达；(f)epcam表达；(g)波形蛋白表达；(h)pd-l1表达；(i)单核细胞cd11c标志物表达；(j)内皮cd146标志物表达；(k)内皮cd202b标志物表达；以及(1)内皮cd31标志物表达。

如上暗示，本文所述的caml和ctc的独特特征使其非常适合用于临床方法，包括筛选和诊断诸如癌症等疾病、监测治疗、监测疾病进展和复发的方法。

使用细胞尺寸预测os和pfs

如以上总结中暗示，本发明涉及基于循环细胞尺寸预测患有癌症的对象的总生存期(os)和无进展生存期(pfs)的方法。这些方法包括确定来自患有癌症的第一对象的生物样本中的循环细胞的尺寸，并将结果与患有癌症的第二对象进行比较。预测具有较大尺寸细胞的对象的os和pfs小于具有较小尺寸细胞的对象的os和pfs。

在本发明的优选方面，该方法包括确定来自患有癌症的对象的生物样本中的循环细胞的尺寸，其中，当所述样本中的至少一个细胞的尺寸约为50μm或更大时，预测该对象的os和pfs小于患有癌症且没有一个细胞的尺寸超过约50μm的对象。

50μm值可以认为是该方法的截止值。在该方法的相关方面，截止值可以是40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60μm或更多中的任何一个。

在本发明的一个方面，本发明的方法包括确定来自患有癌症的对象的生物样本中的循环细胞的尺寸，其中，当所述样本中的至少一个细胞的尺寸约为50μm或更大时，预测该对象的os和pfs小于患有癌症且没有一个细胞的尺寸超过约50μm的对象。

关于该方法，重要的是认识到特定循环细胞的尺寸可以根据细胞的状态和形态、确定尺寸的环境以及确定尺寸的方式而变化。因为循环细胞采用的形态类型包括纺锤形、蝌蚪形、圆形、椭圆形、两条腿等(如本文进一步定义)，尺寸也可以根据细胞上被选择用于测量的两个点而变化。然而，通常在细胞体上最远的两个点之间测量细胞的尺寸。因此，如果形状是圆形的，则测量细胞的直径。如果形状是纺锤形，则可以测量沿着细胞的轴向长度的两端之间的距离。

在该实施例的每个方面，循环细胞也可以称为caml。

使用细胞数量预测os和pfs

本发明还涉及基于循环细胞数量预测患有癌症的对象的总生存期(os)和无进展生存期(pfs)的方法。这些方法包括确定来自患有癌症的对象的选定体积的生物样本中的循环细胞的比例，其中，当所述比例相当于每7.5ml生物样本约4个或更多个细胞时，预测该对象的os和pfs小于患有癌症且比例相当于每7.5ml生物样本少于4个细胞的对象。

4个循环细胞值可以认为是该方法的截止值。在该方法的相关方面，截止值可以是每7.5ml生物样本4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10个细胞中的任何一个。

作为进一步的示例，本发明的方法包括确定来自患有癌症的对象的选定体积的生物样本中的循环细胞的比例，其中，当所述比例相当于每7.5ml生物样本约6个或更多个细胞时，预测该对象的os和pfs小于患有癌症且比例相当于每7.5ml生物样本少于6个细胞的对象。

在该实施例的每个方面，循环细胞也可以称为caml。

使用cep17点数量预测os和pfs

本发明进一步涉及基于cep17点数量预测患有癌症的对象的总生存期(os)和无进展生存期(pfs)的方法。这些方法包括确定来自患有癌症的对象的生物样本中循环细胞中cep17点的数量，其中，当所述样本中的至少一个细胞具有约8个或更多个cep17点时，预测该对象的os和pfs小于患有癌症且来自对象的生物样本中的细胞没有约8个或更多个cep17点的对象。

为了避免任何混淆，短语“来自对象的生物样本中的细胞没有约8个或更多个cep17点”应理解为意指生物样本中的每个细胞具有7个或更少个cep17点。

“8个或更多个”cep17点值可以认为是该方法的截止值。在该方法的相关方面，截止值可以是8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、或15个或更多个cep17点或更多个中的任何一个。

在本发明的一个方面，本发明的方法包括确定来自患有癌症的对象的生物样本中循环细胞中cep17点的数量，其中，当所述样本中的至少一个细胞具有约10个或更多个cep17点时，预测该对象的os和pfs小于患有癌症且来自对象的生物样本中的细胞没有约10个或更多个cep17点的对象。为了避免任何混淆，短语“来自对象的生物样本中的细胞没有约10个或更多个cep17点”应理解为意指生物样本中的每个细胞具有9个或更少个cep17点。

在该实施例的每个方面，循环细胞也可以称为caml。

在本发明的每种方法中，总生存期(os)或无进展生存期(pfs)或两者均为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个月或更长时间的时期。在本发明的一个方面，os或pfs或两者为至少约24个月的时期。

如本文所用，总生存期(os)意指患有癌症的对象从选定日期开始存活的时间长度，例如诊断日期、治疗开始日期以及抽取血液以评估癌症进展的日期。

如本文所用，无进展生存期(pfs)是指患有癌症的对象从选定日期(例如治疗开始日期或抽取血液以评估癌症进展的日期)开始癌症没有恶化或进展的存活的时间长度。

在本发明的每种方法中，显而易见的是，测定循环细胞(caml)的生物样本的量可以变化。然而，当方法是基于确定细胞尺寸时，为了获得相关数量的细胞，生物样本应该为至少约2.5ml。生物样本的量也可以为至少约3、4、5、6、7、7.5、8、9、10、11、12、12.5、13、14、15、16、17、17.5、18、19、20、21、22、22.5、23、24、25、26、27、27.5、28、29或30ml、或更多。生物样本的量也可以在约2.5至20ml之间、在约5至15ml之间、或在约5至10ml之间。在本发明的一个方面，生物样本为约7.5ml。

关于基于生物样本中的循环细胞(caml)数量预测患有癌症的对象的os和pfs的方法，确定来自患有癌症的对象的选定体积的生物样本中的循环细胞(caml)的比例。应当理解，可以使用各种生物样本量，但是确定样本中细胞数量与样本尺寸的比例并在对象之间进行比较。例如，15ml样本中8个细胞的比例相当于7.5ml样本中4个细胞，且相当于3.75ml样本中2个细胞。

在本发明的每个实施例和方面中，循环细胞(caml)可以定义为具有以下每个特征：

(a)大的非典型多倍体核，尺寸约为14-64μm，或相同细胞中有多个核；

(b)细胞尺寸约为20-300μm；和

(c)形态学形状选自由纺锤形、蝌蚪形、圆形、椭圆形、两条腿、多于两条腿、细腿和无定形组成的组。

在本发明实施例的某些方面，循环细胞(caml)可进一步定义为具有以下一个或多个附加特征：

(d)cd14阳性表型；

(e)cd45表达；

(f)epcam表达；

(g)波形蛋白表达；

(h)pd-l1表达；

(i)单核细胞cd11c标志物表达；

(j)内皮cd146标志物表达；

(k)内皮cd202b标志物表达；和

(l)内皮cd31标志物表达。

在本发明的每个实施例和方面，生物样本的来源可以是，但不限于，外周血、血液、淋巴结、骨髓、脑脊髓液、组织和尿液中的一种或多种。例如，当生物样本是血液时，血液可以是肘前静脉血、下腔静脉血、股静脉血、门静脉血或颈静脉血。样本可以是新鲜样本或解冻的冷冻保存的样本[8]。

当比较两个患有癌症的对象之间的循环细胞(caml)尺寸时，优选对象患有相同类型的癌症。然而，除了其他因素，就癌症的类型、癌症的阶段、癌症的进展速度、治疗史以及癌症的缓解和/或复发史而言，可能难以完全匹配两个对象。因此，应该理解，在该方法中比较的两个对象的癌症特征可能存在一些变化。

在本发明的每个实施例和方面，癌症是实体瘤、i期癌症、ii期癌症、iii期癌症、iv期癌症、恶性上皮肿瘤、肉瘤、成神经细胞瘤、黑素瘤、上皮细胞癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肝癌、头颈癌、肾癌、卵巢癌、食道癌或其他实体瘤癌症。技术人员将理解，本发明的方法不限于特定形式或类型的癌症，并且它们可以与多种癌症联合实施。

在本发明的每个实施例和方面，使用一种或多种手段从生物样本中分离循环细胞(caml)用于确定步骤，所述手段选自尺寸排阻方法、免疫捕获、红细胞裂解、白细胞耗竭、ficoll、电泳、介电泳、流式细胞术、磁悬浮和各种微流控芯片或其组合。在特定方面，尺寸排阻方法包括使用微过滤器。

在本发明的一个方面，使用包括使用微过滤器的尺寸排阻方法从生物样本中分离循环细胞(caml)。合适的微过滤器可具有各种孔径和形状。微过滤器的孔径可以在约5至20微米的范围。在本发明的某些方面，孔径在约5至10微米之间；在其他方面，孔径可以在约7至8微米之间。较大的孔径将消除过滤器上的大部分wbc污染。微过滤器的孔可以具有圆形、跑道形状、椭圆形、正方形和/或矩形孔形状。微过滤器可具有精确的孔几何形状和/或均匀的孔分布。

在本发明的另一方面，使用微流控芯片通过基于物理尺寸的分选、基于流体动力学尺寸的分选、分组、捕捉、免疫捕获、浓缩大细胞或基于尺寸消除小细胞从生物样本中分离循环细胞。循环细胞(caml)捕捉效率可根据收集方法而变化。可以在不同平台上捕获的循环细胞(caml)的尺寸也可以变化。使用循环细胞尺寸来确定预后和生存期的原则是相同的，但统计数据会有所不同。使用cellsieve^tm微过滤器收集循环细胞可提供100％的捕获效率和高质量的细胞。

在本发明的另一方面是血液采集管。cellsave血液采集管(menarinisiliconbiosystems公司，圣地亚哥，加利福尼亚)提供稳定的细胞形态和尺寸。其他可用的血液收集管不提供细胞稳定性。细胞可能扩大，甚至可能在大多数其他血液采集管中爆裂。

在本发明的另一个方面是鉴定样本中的大细胞而不特异性地将细胞鉴定为caml细胞本身，而是简单地基于细胞质和细胞核的尺寸鉴定细胞。示例是使用颜色度量染色(例如h&e染色)或仅观察ck(+)细胞的技术。

在本发明的进一步的方面，使用cellsieve^tm低压微滤测定从生物样本中分离循环细胞(caml)。

示例

样本收集和处理

在本文提供的和下文概述的每个示例中，在cellsave管(menarinisiliconbiosystems公司，圣地亚哥，加利福尼亚)中收集外周血并在96小时内处理。使用cellsieve^tm微滤技术来收集血液样本中的所有癌症相关细胞(ctc、emt、cec和caml)。cellsieve^tm微过滤器在9mm区域内具有超过160,000个均匀阵列形式的孔，其具有7μm孔径。试剂包括预固定缓冲液、后固定缓冲液、透化缓冲液和抗体混合物。进行过滤的技术使用以5ml/min[6]抽取的注射泵组或真空泵[4]。过滤过程开始于在7.5ml预固定缓冲液中预固定7.5ml血液，然后通过过滤器吸取。然后对过滤器和捕获的细胞进行洗涤、后固定、洗涤、透化和洗涤。然后，用由fitc抗细胞角蛋白8、18、19；藻红蛋白(pe)缀合的epcam；和cy5抗cd45(5)组成的抗体混合物对过滤器上捕获的细胞染色，然后洗涤。将过滤器置于显微镜载玻片上并用fluoromount-g/dapi(southernbiotech)覆盖。使用具有carlzeissaxiocam的olympusbx54wi荧光显微镜，使用特定的荧光块和单色相机对细胞进行成像。将曝光预设为3秒(cy5、2秒(pe)、100-750毫秒(fitc)和10-50毫秒(dapi)，用于细胞之间的同等信号比较。使用zen2011blue(carlzeiss)处理图像。

因为一些癌症并不总是表现出ck和epcam的高表达，所以用cd31和/或cd14对过滤器上的细胞重新染色以改善caml计数。重新染色技术已发表[5]。然后，重新对细胞进行成像。cd31增加了肺癌的caml计数。

癌症患者血液中ctc和caml的频率

在癌症的早期阶段很少发现pdctc。尽管在iii期和iv期乳腺癌和前列腺癌患者中更常发现pdctc，但在大多数其他实体瘤中，它们的频率低。更常见的是caml。

例如，从293名癌症患者(乳腺(n＝59)、前列腺(n＝52)、胰腺(n＝59)、肺(n＝59)，食管(n＝27)和肾细胞癌(n＝37))和30名健康对照中获得7.5ml外周全血。使用cellsieve^tm微滤测定分析样本。

从图2中可以看出，发现caml比pdctc更常见。在93％的患者样本中发现了caml，包括i期(n＝60)(84％)、ii期(n＝62)(94％)、iii期(n＝65)(95％)的转移前患者，和转移iv期(n＝97)(97％)患者以及9名未分期(未确定)，但在所有健康对照中不存在caml。因此，在实体瘤的早期阶段发现caml的比例很高，而ctc则不然。

caml数量和尺寸变化作为阶段的函数

图3a和3b基于来自图2的样本的阶段分析了caml的数量和尺寸。随着阶段的增加，caml平均数量增加。对于所有阶段，具有端到端的尺寸在25-50μm之间的caml的平均数量大致相同。然而，caml尺寸50-100μm和尺寸>100μm的平均数量随阶段而增加，如图3b所示。

caml尺寸与核区中cep17点数量的相关性

假定caml尺寸增加是caml吞噬肿瘤细胞和肿瘤物质的结果。实际上，一项实验证明，染色体计数探针17(cep17)点的数量(吞噬的核数量的指示)与细胞的尺寸很好地相关。图4显示尺寸>50μm的caml比尺寸在25-50μm之间的caml具有更多的cep17点。该数据还表明，50μm的caml尺寸是与图3b中呈现的疾病进展的结果一致的分界线。

确定疾病侵袭性的尺寸标准的发展

图3和4暗示可用50μm分开侵袭性疾病。使用cellsieve^tm微滤测定分析7.5ml外周全血。对来自各种癌症和阶段的追踪24个月的157名患者的发现组进行os(图5中的虚曲线)和无进展生存期(图6中的虚曲线)分析。os的危险比为3.4且95％ci＝2.1-5.6，p<0.001。pfs的危险比为3.2且95％ci＝2.1-5.0，p<0.001。这表明caml尺寸≥50μm的患者的pfs和os较短。

对来自相似种类的癌症和阶段的158名患者的验证组进行os分析(图5中的实曲线)和pfs(图6中的实曲线)分析。os的危险比为4.2且95％ci＝2.3-7.7，p<0.001。pfs的危险比为3.8且95％ci＝2.7-6.8，p<0.001。验证结果与发现结果非常一致。

caml尺寸的多变量分析和预后信息

基于图5和6中显示的数据，对上述n＝293名患者样本进行os和pfs的多变量分析。追踪患者24个月。进行多变量分析，如下表所示。其表明caml尺寸为50μm是确定os和pfs的最重要参数。p值越小，统计数据准确的概率就越高。

表1

基于caml编号的os和pfs分析在图7中显示。该数据显示，当7.5ml外周血样本中的caml数量≥6个caml时，与相同尺寸的样本中具有<6个caml的患者相比，os和pfs均降低。

与os和pfs相关的进一步的数据呈现在图8中。图8呈现的数据是基于caml尺寸：≥50μm相对于<50μm。如p值表明，caml尺寸≥50μm对于预测不良预后非常重要。

图9将图分成三种不同的caml尺寸：<50μm、50-100μm和>100μm。明显地，caml尺寸越大，预后越差。同样重要的是要注意，即使对于i和ii期(左图)，caml尺寸对于确定预后也是重要的。

使用更大的样本量n＝315来证明caml尺寸预测所有阶段和各种癌症中的生存期和进展概念的实用性。315名癌症患者来自(乳腺(n＝59)、前列腺(n＝74)、胰腺(n＝59)、肺(n＝59)、食道(n＝27)和肾细胞癌(n＝37)。他们处于i期(62)、ii期(72)、iii期(n＝69)、iv期(106)和6名未分期。

图10a-10d分别提供了对于i、ii、iii和iv期的caml尺寸≥50μm和<50μm的os(左图)和pfs(右图)的详细信息。

图11a-11f分别提供了乳腺癌、食道癌、非小细胞肺癌(nsclc)、胰腺癌、前列腺癌和肾细胞癌的caml尺寸≥50μm和<50μm的os(左图)和pfs(右图)的详细信息。按阶段或癌症，caml尺寸>50μm表明os和pfs差。最佳尺寸截止值可以根据癌症的类型稍微改变以获得最佳p值。

引用

1.adams,d.,etal.,circulatinggiantmacrophagesasapotentialbiomarkerofsolidtumors.pnas2014,111(9):3514-3519.

2.internationalpatentapplicationpublicationno.wo2013/181532,dateddecember5,2013.

3.adams,d.l.,etal.,cytometriccharacterizationofcirculatingtumorcellscapturedbymicrofiltrationandtheircorrelationtothectctest.cytometryparta2015；87a:137–144.

4.adamsdl,etal.thesystematicstudyofcirculatingtumorcellisolationusinglithographicmicrofilters.rscadv2014,4:4334–4342.

5.adamsetal.,multi-phenotypicsubtypingofcirculatingtumorcellsusingsequentialfluorescentquenchingandrestaining,scientificreports2016,6:33488|doi:10.1038/srep33488.

6.internationalpatentapplicationpublicationno.wo2013/078409,datedmay30,2013.

7.internationalpatentapplicationpublicationno.wo2016/33103,datedmarch3,2016.

8.zhup,etal.,detectionoftumor-associatedcellsincryopreservedperipheralbloodmononuclearcellsamplesforretrospectiveanalysis,joftranslationalmedicine,2016,14:198.doi:10.1186/s12967-016-0953-2.