用于毛细管分离技术后的柱上检测的组合式荧光和吸收检测器的制作方法

背景技术：

相关技术描述：分离化合物混合物的多种技术依赖于化合物通过通道或管(称为柱(column))移动，其中化合物以一系列条带出现在柱的末端。在从分离柱中出来时对条带中的化合物的检测和鉴定是成功分离技术中的关键步骤。

有效的检测方案不应降低分离柱中已经发生的分离。不幸的是，向分离柱添加流动池或其他附件(特别是对于具有毛细管尺寸的柱)通常降低分离。因此，更希望直接在分离柱上进行检测。

吸收分光光度法和荧光分光光度法是有效地用于凝相分离检测的两种光谱技术。吸收分光光度法的优势可以在于几乎所有分子都吸收，因此这种方法可以是将对大多数化合物做出反应的几乎通用检测器。

吸收检测器提供的信息是一种或多种光波长下的吸光度的量值。然而，吸收检测器的缺点是缺乏特异性和相对较差的灵敏度。

相反，荧光光谱法可以不如分光光度法通用，因为荧光量子产率在不同类别的化合物之间可以相差很大，并且某些化合物不发荧光。对于具有高量子产率的化合物，荧光光谱法可以异常灵敏，能够检测单个分子。

荧光检测器提供的信息与分光光度检测器提供的信息不同。荧光波长取决于分子结构，而信号量值取决于量子效率和浓度。

由于两种检测方式提供不同的信息，因此将两种方式组合可以大大增加可以鉴定的分子的特异性。过去，研究人员已经认识到并利用在单个检测器中结合荧光光谱法和分光光度法的价值。1975年描述了双模式检测器，并且在1999年报道了不同的方法。然而，这两种检测器都使用笨重的气体放电灯，并且都需要在分离柱的末端处添加。此外，这两种方法都不适合柱上检测，尤其不适用于毛细管柱分离。

可以修改现有技术的液相色谱(lc)系统以包括这两种类型的检测器。因此，检查lc吸收系统并确定可以如何将该系统修改为包括两个检测器可以很有用。

进行液相色谱(lc)以便分析液体溶液中化学物质的含量。图1是示出可以对其进行修改以用作本发明的一部分的现有技术系统的主要元件的图示。

在开始之前，应该理解，柱上检测可以指填充床(packedbed)材料何时在柱的末端之前终止，使得柱的最后部分实际上是空的。但是，在某些情况下，柱的填充床材料一直到柱的末端，并且必须添加毛细管以在毛细管部分进行检测。

因此，本发明的实施例应被认为将两种构造都包括在所有实施例的范围内，其中在柱的不包含填充床材料的区域中或在已添加到填充床材料末端处的柱的最末端的毛细管内进行柱上检测。

图1示出与毛细管液相色谱一起使用的具有低检测极限的基于led的uv吸收检测器。在此系统中，led输出波长可以随驱动电流和结温的变化而变化。因此，led应该由恒定电流源驱动，并且应避免系统发热。

led源的准单色性会导致系统中的杂散光，从而导致检测器非线性。通过在系统中采用滤光器，可以保护任何检测系统免受期望吸收带以外的任何led光的影响。

对于毛细管柱，柱上毛细管检测可以是优选的，因为可以通过消除柱外带分散而获得较窄的峰宽，并保持峰分离度。检测器中的短期噪声可以确定检测极限，并且通常可以通过进行积分、平滑和/或使用低通rc滤波器来降低该噪声。

图1示出对检测器设计的进一步优化并且噪声水平的降低可以引起小直径毛细管柱的更好检测极限。图1中的系统的元件包括基于uv的led40、第一球形透镜42、可以调谐至led40光源的带通滤光器46、第二球形透镜48、可以包括剃须刀片的狭缝50、可以具有约150μm的内直径(id)和约365μm的外直径的毛细管柱52，以及硅光电二极管检测器54。

本发明的元件的比例尺未在图4中示出。来自第二球形透镜48的uv光可以比所示的更剧烈地会聚。此外，第二球形透镜48的直径可以是毛细管柱54的内直径的10倍以上。因此，应当理解，提供图4以示出本发明的部件的物理顺序，而没有示出实际尺寸。

另外，应当理解，由第一球形透镜42和第二球形透镜48引起的uv光的会聚的任何附图都没有按比例示出，并且仅用于说明目的。

通过替换提供相同功能的其他部件，可以提供与上面列出的检测系统的部件相同的功能。例如，虽然在图4中示出第一球形透镜42和第二球形透镜48，但是可以替换不同类型的透镜，并且仍然应当认为其落入第一实施例的范围内。也可以使用单个透镜提供前两个球形透镜的功能，并获得期望的聚集效果。还应当理解，在不脱离第一实施例的期望功能的情况下，为第一实施例的所有方面给出的值仅是近似值，并且可以变化高达50％。

图2是图1所示系统的剖面图，但具有更多的构造细节。图2所示的系统不应视为限制性的，而应作为设计原理的演示。因此，针对部件的尺寸、形状、重量、功率、灵敏度或任何其他特性给定的特定值仅是示例，并且可以与给定的值不同。

图2示出具有第一球形透镜42的led40。led40可以被设置在led支架44内。led40可以被制造为与第一球形透镜42集成在一起，或者可以在制造之后被附接到第一球形透镜42或设置成与第一球形透镜42相邻。可以从适合于在毛细管柱52中分析的化合物的任何期望uv光带宽来选择led40。第一实施例使用260nmled40，但是uv光的波长可以根据期望而改变。

在此设计中，具有第一球形透镜42的市售260nmuvled40被用作光源。将led40安装在led支架44上。将led支架44拧入黑镜管中，并借助于固定环将其保持紧密。第一球形透镜42的直径可以是6mm，或者可以是用以聚集来自led40的光的任何合适的尺寸。

图2包括设置在第一球形透镜42之后的带通滤光器46。带通滤光器46可以是260nm带通滤光器，其用于减少杂散光从led40和/或任何周围环境到达检测器。可以根据需要调整带通滤光器的值，以便针对led40光源进行优化。

在第一实施例中，260nm带通滤光器可以定位在黑螺纹管中的led40和第二球形透镜42之间。

设计的另一元件可以是使用设置在带通滤光器46之后的第二球形透镜48。第二球形透镜48的功能可以是接收由第一球形透镜42聚集的uv光并更进一步聚集该uv光。期望聚集uv光，以使得发送到毛细管柱52中的光可以等于或小于内直径(id)的宽度。尽管这是优选的，但是在第一实施例中，uv光源的聚集可以不等于或不小于毛细管柱52的id。

在此设计中，融合二氧化硅球形透镜的直径可以是3mm以用于第二球形透镜48，并且可以安装在3mm的球形透镜盘上并且可以设置在led焦点处。第二球形透镜安装座可以在安装座上居中，此安装座可以拧入包含led40和带通滤光器46的黑镜管。

随着通过毛细管柱52并由检测器接收的光通过量(throughput)的增加，实验性地确定入射到检测器上的光强度可以比现有技术的毛细管lc设计高三个数量级。

为了减少到达检测器54的杂散光，在第二球形透镜48之后并且在毛细管柱52的前面设置一个或多个狭缝50。狭缝50可以由剃须刀片或任何其他合适的装置提供。狭缝的宽度可以大约为100μm。

带通滤光器46和狭缝50的组合在实验上将杂散光减小到3.6％的值，与可以在将杂散光减小到30.5％的值下操作的现有技术系统相比，这是非常低的。现有技术的设计可以已经使用特殊uv指数光电二极管来消除较高波长的杂散光，这显然不是很有效，或者可以已经在与商业柱(1mm内直径)的末端连接的250μmid空心毛细管前面使用狭缝(100μm宽)。这导致通过毛细管柱52的光通过量降低。此外，由于较大直径的管与较小直径的管之间的连接而引起的带增宽妨碍检测灵敏度。

通过毛细管柱52的uv光被定位成使其撞击uv检测器54。uv检测器54可以是任何uv敏感性装置。

在此设计中，uv检测器54可以是硅光电二极管。光电二极管54可以通过外螺纹设置在二极管支架上。可以建立黑帽以拧入二极管支架。此黑帽可以具有将毛细管柱52保持在中心的v形凹槽、允许光通过的中心孔以及在孔的相对侧上用以将狭缝保持在适当位置的凹槽。可以使用一对剃须刀片来制造一个或多个可调节狭缝50。狭缝50可以设置在盖中的中心孔的相对侧上，该盖在纵向上覆盖毛细管柱的外直径。

在检测器54中，运算放大器可以用于接收来自光电二极管的电流并将其转换成电压值。模数转换器可以用于与计算机或其他记录装置一起记录电压输出。应当理解，可以在模数转换器的输入处使用低通rc滤波器。

以下示例示出此设计的实验值，并且不应被视为对该设计性能的限制。数据点以1khz至42khz的速率采样。然后将这些数据点以10hz的速率进行平滑处理，以降低检测系统中的噪声水平。这些值不应被认为是限制性的，而是用来说明本发明的实施例的原理。可以调整数据点采样率和数据平滑率，以便针对所使用的检测系统优化结果。

led40和硅光电二极管检测器54可以分别需要6v和12v直流电源进行操作。检测器54需要0.139安培电流，并且可以使用4安培-小时12v直流电池操作约25小时，并且可以通过具有ac至dc适配器的线路电源来操作。然而，应当理解，这种设计的检测系统可以使用直流电源来操作，并且因此可以是便携的，这不仅是因为直流电源需求，而且因为检测系统的相对小尺寸。

除非另有说明，否则在这些实验中使用注射量为60nl的一体式止流注射器。在所有实验中均使用150μmidx365μmod特氟隆涂层的毛细管柱52。所报告的吸光度值是通过取透射率值倒数的常用对数来计算的。通过将样本信号除以通过记录基线获得的参考信号来计算透射率。

在1分钟基线数据测量中确定检测器噪声。将空心融合二氧化硅毛细管连接至纳米流动泵送系统并且填充水。然后记录基线约1分钟，并计算峰到峰吸光度。这产生峰到峰(p-p)噪声。计算短期噪声(rms)作为记录基线的标准偏差。对于暗噪声测量结果，关闭led40，并测量暗噪声作为基线中的标准偏差。为了确定数字转换器噪声，a/d转换器的正端子和负端子短接。通过使水以300nl/min流过毛细管并记录基线达1小时，然后测量基线的斜率来确定检测器漂移。

进行软件平滑以降低噪声水平。然而，应当理解，平滑功能可以以更快的速率在硬件中进行，并且可以代替软件平滑。尽管我们可以使用各种平滑技术，但是在第一实施例中使用的平滑技术是固定的窗口平均。可以使用的其他平滑技术包括但不限于通过对固定宽度的滑动窗口求平均来进行平滑、使用指数加权移动平均值进行平滑，以及使用被构造成白化基线噪声过程的因果或非因果滤波器进行平滑。

使用150μmid的毛细管柱52和溶液中注入的尿嘧啶(uracil)5.35pmol，在不同的平滑率下确定信噪比，并且使用最佳平滑率进行进一步工作。还研究了在进行和不进行任何平滑处理的情况下rc滤波器(0.5s和1s的时间常数)对短期噪声的影响。黑墨水填充的毛细管用于系统中的杂散光评估。通过将在黑墨水条件下获得的电压信号除以通过填充水的毛细管柱52获得的电压信号乘以100来测量杂散光水平。

基于uvled的吸收检测器54可以比现有技术的基于汞笔射线灯的检测器小得多。对于毛细管柱上检测，吸光度值可以小，因此降噪对于获得良好的检测极限可以是重要的。明亮的光源led40可以增加用于计算吸光度的光电流，而不会成比例地增加噪声。为了减少检测系统的成本和尺寸，制造单波长(260nm)检测器54而不是多波长检测器。

尽管led40具有集成的融合二氧化硅第一球形透镜42(直径6.35mm)，该透镜将光束在焦点(15-20mm)处聚集成1.5-2.0mm的光点，但是对于毛细管柱52尺寸(id为0.075至0.20mm)来说仍然太宽。因此，将第二融合二氧化硅球形透镜48(直径3mm)放置在led40的焦点处，以获得改善的光聚集。第一球形透镜42和第二球形透镜48可以由任何适当的材料构成。

选择led40以发射具有±5nm的带宽的光；然而，通过分光计，可以确定led也发出更高波长的光。额外的光波长可以对系统的杂散光有很大贡献。

实验期间使用fwhm为20nm的260nm带通滤光器。图6中的重叠光谱示出具有和不具有滤光器的led40的光输出，证实滤光器成功地消除来自更高波长的光。led40的位置已得到优化，以在毛细管柱52的中心获得最佳聚集。

作为检测器54的功能的一部分的此设计的特征是进行检测数据的处理。在第一实施例的实验用途中，在没有使用信号平滑和低通滤波器的情况下，发现检测器54的短期rms噪声为8mv。未经平滑的暗rms噪声经计算为6.95mv。软件平滑将暗rms噪声水平降低到74.4μv，如图7所示。在明亮和黑暗的房间中，暗电压值相同，证实毛细管柱52不能用作光导。数字转换器噪声可以对检测器可获得的最小噪声有很大贡献。发现数字转换器rms和p-p噪声分别为2.4mv和7.7mv。如图7所示，研究了软件平滑对数字转换器rms噪声的影响，并且所获得的最小rms和p-p噪声水平分别为15μv和95μv。

还研究了软件平滑对信噪比的影响，并且尽管发现平滑对用于色谱图中的峰宽的信号强度的影响可以忽略不计，但在不使用滤光器的情况下在入射光强度(io)(5.7μau)相对应的电压下，rms噪声水平降低到0.18mv的水平。借助0.5s的滤光器和每0.1s4200个数据点的平滑，rms噪声可以进一步降至0.14mv(4.4μau)。因此，led检测器rms噪声比以前的检测器和其他uvled检测器(约10-5au)低一个数量级(约10-6au)。发现检测器54的漂移非常低(每小时10-5au)，其在峰宽上可以忽略不计，并且在典型色谱图的持续时间内可能没有问题。

光源在毛细管柱54的id上的不适当聚集可以损害uv吸收检测器的线性。检测的极限取决于检测器54的短期噪声和测试分析物的摩尔吸收率。对于实验，选择测试分析物是基于摩尔吸收率和相关的先前led检测器工作。检测器54给出直到所测试的最高浓度的线性响应，从而证实系统中的杂散光低。对于所有测试分析物，线性动态范围均为三个数量级。对于sas，实验发现信噪比为3时的检测极限为24.6nm(7.63ppb)或1.5fmol。此检测极限可以是现有技术的基于笔射线汞灯的检测器的五分之一。

由于专为柱上检测而设计检测器54，因此在lc条件下使用苯酚对检测器性能进行测试，并与流通实验进行比较，如表2所示。在两种条件下，检测器的线性均非常好，并且检测极限被发现是相似的。因此，在实际lc条件下使用时，检测器性能不受损害。

由图1所示的系统进行毛细管lc。因此，检测系统包括用于以下操作的系统，该系统通过分析由检测器接收的uv光来分析设置在毛细管柱内液体中的至少一种化合物对uv光的吸收。用于分析吸收的系统可以是检测器的一部分，或者可以是耦合到检测系统以从检测器接收数据的计算机系统。

还应注意，图1中的系统示出使用整体毛细管柱的柱上lc检测。使用柱上检测可以改善峰形状并提高检测灵敏度，因为可以减少柱外带加宽。

由于毛细管lc系统的良好聚光性、低杂散光和极低噪声，所以对于测试化合物，可以获得图1中系统的低检测极限。具有150μm路径长度的毛细管格式中的对于sas的检测极限可以是具有1cm路径长度的基于led的检测器的三分之一。对于amp和dlt，与具有相同路径长度的检测器相比，检测极限改善了230倍和60倍。另外，在流通实验和分离条件下，我们的检测器中的苯酚检测极限相同。因此，在实际液相色谱工作下检测器性能不受损害。还证明苯酚混合物的可以再现的等度分离。

可以使用软件平滑来降低检测系统中的噪声水平。在不进行平滑的情况下，总均方根噪声水平为8mv。在每0.1秒4200个数据点进行平滑的情况下，噪声水平降低到0.18mv，并且当将低通rc滤波器(2hz时间常数)用于模数转换器的输入时，噪声进一步降低至0.14mv(相当于4.4μau)。这是基于毛细管的检测器有史以来最低的噪声水平之一。在不进行软件平滑而仅使用rc滤波器的情况下，噪声水平仅从8mv降低到2.4mv。因此，低通滤波显然不足以有效消除来自检测系统的高频噪声。对于5.35pmol尿嘧啶峰，信噪比从14增加到408。噪声水平比其中某些检测器仅依靠低通滤波器的现有技术小高达2个数量级。

关于图1系统的尺寸、重量、功率要求和便携性的最终评论是毛细管lc系统简单设计的直接结果。典型的商用系统可以具有11x13x22cm的尺寸，具有3.3lbs的重量，需要合规的交流电源线，并且具有约1mau的灵敏度。相比之下，图1中的系统可以具有大约5.2x3x3cm的尺寸，可以具有0.2lbs的重量，可以通过12直流电源操作并且仅使用1.68w，并且可以具有大约10μau的灵敏度。应当理解，这些值仅是近似值，并且在不脱离第一实施例的特性的情况下可以变化高达50％。

提供图3和图4作为可以在本发明中使用的第二和第三现有技术系统。具体地，第二和第三系统的所有特征和功能与第一系统相同，不同之处在于第一球形透镜42、滤光器46和第二球形透镜48的顺序改变。图3在图示中示出可以将第一球形透镜42定位成与第二球形透镜48相邻，并且然后完全去除滤光器46。

如果可以使uv光源更完全单色，则滤光器46最终可以变得不必要。进行滤光以便防止任何杂散光到达毛细管柱54。如果uv光源不产生杂散光或产生非常少的杂散光，则滤光器变得不必要，并且可以在不脱离本发明的原理的情况下从系统中移除。

相反，图4在图示中示出可以将滤光器46定位在led40和第一球形透镜42之间，并且然后如图3所示，将第二球形透镜48定位成邻近第一球形透镜。换句话说，可以将滤光器46设置在两个球形透镜42、48的前面以及在球形透镜之间，或者完全去除滤光器，并且仍然实现对来自led40的uv光的期望的聚集和滤光。

技术实现要素：

本发明是用于对毛细管液相色谱法进行基于uvled的吸收检测以便检测和定量液体中的化合物的系统和方法，其中简化的系统通过使用稳定的uv源消除对分束器和参比池的需要，并且降低功率要求，从而产生具有相对低的检测极限的便携式且体积更小的系统。

通过考虑以下结合附图的详细描述，本发明的这些和其他实施例对于本领域技术人员将变得显而易见。

附图说明

图1是可以被修改以用作本发明的一部分的第一现有技术系统的第一图示，并且示出毛细管lc系统的主要硬件元件。

图2是图1的系统的第二图示，其示出毛细管lc系统的更多构造细节。

图3是图1的修改的系统中的部件的图示。

图4是图1的不同修改的系统中的部件的图示。

图5是本发明的第一实施例的图示。

具体实施方式

现在将参考附图，在附图中将对本发明的各个实施例进行数字标记，并且在附图中将对实施例进行讨论，以使本领域技术人员能够制造和使用本发明。应该理解的是，以下描述说明本发明的实施例，并且不应被视为使所附权利要求变窄。

图5是本发明的第一实施例的图示。此第一实施例在单个紧凑的系统中结合荧光和分光光度(吸收)检测，该系统适用于通过基于毛细管柱分离进行的柱上检测。

系统中存在两个检测通道。第一检测通道是吸收通道，其包括从发光二极管(led)光源到吸收检测器的uv光路径中的所有元件。吸收通道基于现有技术中所示的设计。然而，可以修改吸收通道，以便将第二检测通道添加到系统。

第二检测通道是荧光通道，其包括从led光源到荧光检测器的uv光路径中的所有元件。

毛细管柱中至少一种化合物的检测基于在可选波长带上的柱上吸光度，这取决于led选择和置于led与毛细管柱之间的带通滤光器的组合。

将荧光通道添加到现有技术的吸收检测器中引入若干独特的特征，这些独特的特征不是任何先前的双重检测器设计的一部分。在标识这些独特的特征之前，将描述两个检测通道的元件。

与现有技术的元件相同的第一实施例的元件也可以具有如上所述的相同的特征和特性。图5中的系统的元件包括基于uv光的led60、第一球形透镜62和可以调谐到led60光源的激发(带通)滤光器64。为了提供两个检测通道，第一实施例的新特征是必要的。新特征是分色镜66。如本领域技术人员所理解的，分色镜也可以称为长通分色镜66或分色分束器。分色镜66使第一实施例能够使双检测器通道同时操作。

分色镜66在可以与从源led60行进的路径成大约直角的第一方向上基本上反射来自基于uv的led60的所有uv光。吸收通道光路径由虚线68表示。

uv光从分色镜朝向第二透镜70反射。第二透镜70可以是凸透镜，以便聚集uv光。

在第二透镜70之后可以是可以包括剃须刀片的狭缝72、可以具有大约150μm的内直径(id)和大约365μm的外直径的毛细管柱74，以及硅光电二极管检测器76。该描述完成系统中吸收通道的所有元件。

荧光通道开始使用相同的基于uv的led60、第一球形透镜62和可以调谐到led60光源的激发滤光器64。分色镜66也用于将uv光在第一方向78上发送通过第二透镜70、狭缝72并进入毛细管柱74。

然而，此时光的路径发散。毛细管柱72中的一种或多种化合物可以发荧光并散发出光，该光在下文中将被称为“荧光”。被测量的荧光在与第一方向78相反的方向(称为第二方向80)上传播。

如线82所示，荧光由第二透镜70聚集，使得其通过分色镜66。发射滤光器84可以在荧光通过第三透镜86之前过滤荧光，第三透镜86使荧光聚集通过狭缝或针孔88并进入荧光检测器90。

第一实施例的一些独特的特征包括用于两个检测通道的相同的uvled60。led60的期望特性是紧凑的尺寸、低功耗、高光谱辐照度、低成本和稳定的输出功率。led60的稳定输出使系统的吸收部分能够在没有参考通道的情况下操作。同样的稳定性对于低噪声荧光检测也可以是关键的，因为荧光信号直接取决于冲击到样品上的辐射通量。

另一个特征是将来自led60的光聚集到毛细管柱74中的第二透镜70也用作荧光检测器90的主要收集光学器件。落射(epi)照明方案确保荧光通道添加到吸收检测器76不会以任何方式降低吸收检测器的性能。

第一实施例的第三特征是，来自led60的入射激发辐射和来自毛细管柱74中的至少一种化合物的出射荧光被分色镜66隔开，该分色镜66还用作分束器，可以反射led60的激发波长并反射荧光的荧光波长。

吸收通道和荧光通道的两个光路径68、82的组合确保两个检测器76、90都对毛细管柱74中的相同小体积作出响应。

第四特征是在两个光路径68、82分离之后，可以在荧光发射光路径82中放置一个或多个滤光器84，以辨别残留的激发光并为毛细管柱74中的选定类别的化合物增加一定程度的特异性。来自led60的激发辐射与荧光信号的峰值之间的波长差取决于荧光分子的电子结构，因此不同的激发波长和发射滤光器组合可以用于靶向特定类别的化合物。

在本发明的可替代实施例中，荧光发射路径82中的发射滤光器84和荧光检测器90可以由可以记录整个荧光光谱的紧凑型光谱仪代替。

可以观察到，可以同时且连续地监视发射通道和吸收通道两者。每个通道可以根据分析物分子的电子结构，以不同的灵敏度提供对分析物浓度的测量。荧光度与吸光度的比率在第一近似值上，与浓度无关。相反，其可以是荧光量子产率的量度，并且其可以提供本身不能通过任一检测通道获得的分子标记。在将光谱仪结合在发射通道中的本发明的第一实施例中，记录的光谱可以提供关于洗脱分析物的信息，这有助于分析物的识别。

尽管上面仅详细描述几个示例实施例，但是本领域技术人员将容易理解，在实质上不脱离本发明的情况下，示例实施例中的许多修改是可能的。因此，所有这些修改旨在被包括在如所附权利要求所限定的本公开范围内。申请人的明确意图是不援引35u.s.c.§112，第6段对本文任何权利要求的任何限制，但权利要求明确使用“用于……的装置”和相关功能的限制除外。