基于唾液白介素-1β以及MMP-9的轻度或重度牙周炎的诊断的制作方法

本发明属于口腔护理领域，并且涉及基于唾液的牙周疾病的诊断。特别地，本发明涉及用于区分轻度与重度牙周炎的试剂盒以及方法。

背景技术：

牙周炎是由口腔微生物引起的慢性多因素的炎症疾病，以及其特征是逐步破坏硬(骨)以及软(牙周纽带)组织，最终导致牙齿松动或脱落。这需要区别于牙龈炎，牙龈炎是牙龈组织的可逆的感染和发炎。炎症牙周炎是最普遍的慢性人类疾病中的一种并且是成年牙齿脱落的主要原因。除了牙周炎对口腔健康的实质性负面影响外，这里还有大量证据证明牙周炎具有全身性影响，以及其是多种全身性疾病的危险因素，包括心脏病(例如动脉粥样硬化、中风)、糖尿病、妊娠并发症、类风湿关节炎以及呼吸道感染。

因此，从口腔以及整体健康来看，早期以及准确诊断牙周疾病，都很重要。

在一般牙科实践中，牙周疾病的诊断仍然较差(morganrg(2001)。britdentj191：436-41)，导致相对较低的治疗干预率以及大量未经治疗的病例。当前的诊断依赖于牙科专业人员对口腔组织情况(颜色、肿胀、探查的出血程度、探查口袋深度(pocketdepth)的出血程度，以及基于口腔x射线的骨脱落)进行不精确的主观临床检查。这些常规方法耗时，以及所使用的某些技术(口袋深度、x射线)反映了历史事件，诸如过去的疾病活动，而不是当前的疾病活动或对进一步疾病的敏感性。因此，期望更客观、更快、准确、更易于使用的诊断，其被期望优选也可以由非专业人员执行。从而，期待测量现有疾病活动，以及可能的对象对进一步的牙周疾病的敏感性。

唾液或口腔液长期以来被提倡作为口腔和一般疾病的诊断液，以及随着微型生物传感器(也称为“芯片上的实验室”)的出现，用于快速椅旁测试的即时诊断获得了更大的科学和临床兴趣，特别是对于牙周疾病的检测，与组织炎症和分解相关的炎症性生物标志物可能会由于邻近而容易地结束在唾液中，这表明唾液具有用于牙周疾病检测的强大潜力。的确，这个领域因此引起了明显的兴趣以及提出了令人鼓舞的结果。例如，us2010/0196941描述了测量生物标志物以确定牙周和/或种植体周围疾病的可能性的方法，同时ramseier等人(jperiodontol.2009mar；80(3):436-46)确定了与牙周疾病相关的宿主以及细菌衍生生物标志物。然而，目前还没有确定的测试出现。

生物标志物代表了支持临床表现的生物学指标，以及它们是诊断牙周疾病临床结果的客观测量。最终，经过验证的生物标志物可以被用于评估未来疾病的风险、在最早阶段识别疾病、识别对初始治疗的反应、以及允许实施预防策略。

先前用于唾液生物标志物的床旁检测(point-of-care)测试发展的限制包括缺少适用于椅旁应用的技术以及无法分析各个样本中的多种生物标志物。同样，在这样的测试中包括多种生物标志物的哪种的选择没有在文献中得到充分的解决，也没有在实际测试中实施。

而且，牙周炎可以在轻度到重度疾病的整个严重程度中显露出来。为了容易的评估情况的严重性，牙医通常将患有牙周炎的患者分为两组——患有轻度牙周炎的患者，以及患有重度牙周炎的患者。然而，进行这种评估的可用的方法涉及劳动密集型过程，牙医不会对每个患者和/或每次就诊都执行，并且消费者无法执行(自我诊断)。

期望提供一种更简单的过程，以及特别的仅需要从患者获得少量唾液样本的过程(并且可能的，由患者他或她自己获得)。期望将这种样本输入体外诊断设备中，基于测量，其将允许对唾液样本进行分类，从而其可以返回患者被分类为患有轻度牙周炎或患有重度牙周炎的可能性的指示。

技术实现要素：

为了更好地解决前述需求，本发明一方面涉及一种用于评估人类患者是否具有轻度牙周炎或重度牙周炎，该方法包括检测来自所述人类患者的唾液样品中的以下蛋白质的浓度：白介素-1β(il-1β)、基质金属蛋白酶-9(mmp-9)、以及以下中的至少一种蛋白质：白介素-6(il-6)、基质金属蛋白酶-3(mmp-3)；确定反映针对所述蛋白质的所确定的联合(joint)浓度的测试值；将测试值与阈值进行比较，该阈值以相同的方式反映与重度牙周炎相关联的联合浓度，以便评估测试值是否指示所述患者患有轻度牙周炎或患有重度牙周炎。

在另一方面，本发明提供了在人类患者的唾液样本中的蛋白质作为生物标志物的用途，蛋白质是以下蛋白质：白介素-1β(il-1β)、基质金属蛋白酶-9(mmp-9)、以及以下中的至少一种蛋白质：白介素-6(il-6)基质金属蛋白酶-3(mmp-3)，该生物标志物用于作为评估所述患者是否具有轻度牙周炎或重度牙周炎。

在另一方面，本发明在于一种评估人类患者是否具有轻度牙周炎或重度牙周炎的系统，该系统包括：

-检测装置，能够以及适于在人类患者的唾液样本中检测蛋白质白介素-1β(il-1β)、基质金属蛋白酶-9(mmp-9)、以及以下中的至少一项：白介素-6(il-6)和基质金属蛋白酶-3(mmp-3)；以及

-处理器，能够以及适于根据所述蛋白质的所确定的浓度，确定对象具有轻度牙周炎或重度牙周炎的指示。

系统可选地包含到能够呈现信息的界面(特别是图形用户界面)的数据连接，优选地还能够输入信息，所述界面是系统的一部分或远程界面；

可选地，前述项目中的一个或多个，特别是处理器，能够“在云中”运行，即，不是在固定机器上，而是通过基于互联网的应用的装置。

另一方面，本发明提供了一种用于在人类患者唾液样本中检测用于牙周炎的至少三种生物标志物的试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种(典型是三种)检测试剂，用于检测白介素-1β(il-1β)、基质金属蛋白酶-9(mmp-9)、以及以下项中的一种：白介素-6(il-6)和基质金属蛋白酶-3(mmp-3)。典型的，使用三种或多种检测试剂，每种检测试剂结合不同的生物标志物。在一个实施例中，第一检测试剂能够结合白介素-1β(il-1β)，第二检测试剂能够结合mmp-9，以及第三检测试剂能够结合il-6或mmp-3中的一种。

又一方面，本发明提供了一种体外方法，该体外方法用于确定在从第一时间点t1到第二时间点t2的时间间隔内患有牙周炎的人类患者的牙周炎状态的变化，该方法包括：在t1时从所述患者获得的至少一个唾液样本中以及在t2时从所述患者获得的至少一个唾液样本中，检测以下蛋白质的浓度：il-6或mmp-3中的至少一种、以及il-1β、mmp-9，以及比较浓度，由此在浓度的任何一种、两种或所有三种中的差异反映出状态变化。

在另一方面，本发明提供一种诊断人类患者是否具有轻度牙周炎或重度牙周炎的方法，包括：在人类患者的唾液样本中检测蛋白质白介素-1β(il-1β)、基质金属蛋白酶-9(mmp-9)、以及以下项中的至少一种蛋白质：白介素-6(il-6)和基质金属蛋白酶-3(mmp-3)，以及基于所述样本中所述蛋白质的浓度来评估患者是否存在轻度牙周炎或重度牙周炎。可选地，该方面的方法包括治疗患者牙周炎的进一步步骤。

在又一方面，本发明提供了一种在患有轻度或重度牙周炎患者中检测以下蛋白质的方法：白介素-1β(il-1β)、基质金属蛋白酶-9(mmp-9)以及以下项中的至少一种蛋白质：白介素-6(il-6)和基质金属蛋白酶-3(mmp-3)，该方法包括：

(a)从人类患者获取唾液样本；以及

(b)通过使样本与用于结合所述蛋白质的一种或多种检测试剂接触、并检测在每种蛋白质与一种或多种检测试剂之间的结合，来检测样本中是否存在白介素-1β(il-1β)、基质金属蛋白酶-9(mmp-9)以及以下项中的至少一种：白介素-6(il-6)和基质金属蛋白酶-3(mmp-3)。典型的，存在能够结合白介素-1β(il-1β)的第一检测试剂、能够结合mmp-9的第二检测试剂、以及能够结合il-6和mmp-3中的一个的第三检测试剂。

附图说明

图1示意性的示出用于如本公开所描述的方法的系统。

具体实施方式

在一般意义上，本发明基于明智的洞察力，即在患有牙周炎的人类患者的唾液样品中少到三种蛋白质可以用作生物标志物，用于将所述牙周炎分类为两类中的任一类，一类为重度牙周炎，另一类为轻度或中度(即不是重度，在前文以及下文中术语“轻度牙周炎”将包括中度牙周炎，除非另有指示)。后面一类在下文中统称为轻度牙周炎。

这些蛋白质是白介素-1β(interleukin-1β，il-1β)、基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase-9,mmp-9)以及白介素-6(il-6)、基质金属蛋白酶-3(mmp-3)中的至少一种或全部两种。

il-1β是细胞因子的白介素-1家族的成员。这种细胞因子是通过激活的巨噬细胞以原蛋白质形式产生的，其被胱天蛋白质酶1(casp1/ice)蛋白质水解加工成其活性形式。该细胞因子是炎症反应的重要介质，并参与多种细胞活动，包括细胞增殖、分化和凋亡。

il-6是一种白介素，既可作为促炎症性细胞因子又可作为抗炎症性肌浆球蛋白(myokine)。在人类中，它是由il-6基因编码的。

白介素-6由t细胞和巨噬细胞分泌，以刺激免疫反应，例如：在感染期间和创伤后，尤其是导致炎症的烧伤或其他组织损伤。il-6在抵抗感染中也起着重要的作用，如il-6已在小鼠中被证明在抵抗肺炎链球菌中被需要。另外，成骨细胞分泌il-6以刺激破骨细胞形成。许多血管的中膜中的平滑肌细胞也产生il-6作为促炎症性细胞因子。

mmp是一种酶家族，其负责降解细胞外基质成分，例如胶原蛋白、蛋白聚糖、层粘连蛋白、弹性蛋白和纤连蛋白。在生理和病理条件下，它们在牙周韧带重塑(pdl)中都发挥重要作用。mmp-3酶降解ii、iii、iv、ix和x型胶原、蛋白聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白和弹性蛋白。mmp-9，也称为92kdaiv型胶原酶，92kda明胶酶或明胶酶b(gelb)，是一种基质素，属于一类参与细胞外基质降解的锌金属蛋白酶家族的酶。

上述四种蛋白质是本领域已知的。本领域技术人员知道其结构以及在含水样本(例如唾液样本)中检测它们的方法。在下文中，上述蛋白质生物标志物统称为“本发明的生物标志物面板(panel)”。在一个实施例中，本发明的生物标志物面板由本发明中识别的四种蛋白质生物标志物组成，即il-1β、il-6、mmp-3以及mmp-9。优选地，本发明的生物标志物面板由不超过三种在本发明中识别的蛋白质生物标志物组成，即il-1β、il-6和mmp-9或il-1β、mmp-3和mmp-9。除了本发明的生物标志物面板外，其他生物标志物和/或数据，例如人口统计数据(例如年龄，性别)也可以包括在用于确定牙周炎的类型的数据集合中。优选的扩展的生物标志物面板是：

il-1b+mmp-9+il-6+mmp-3

il-1b+mmp-9+il-6+mmp-8

il-1b+mmp-9+il-6+mmp-3+mmp-8

il-1b+mmp-9+il-6+mmp-8+hgf(肝细胞生长因子)。

当可选地包括其他生物标志物时，生物标志物的总数(即本发明的生物标志物面板加上附加的生物标志物)典型的为4、5或6

然而，本发明的可期待的优点是可以通过优选地测量不超过四个生物标志物，以及更优选的仅测量三个生物标志物(优选的具有生物标志物面板il-1β、il-6和mmp-9)来确定患者牙周炎的分类。特别地，该确定不需要涉及其他数据的使用，这有利地提供了简单直接的诊断测试。

该方法，如期待的，仅需要少量的唾液样本，例如取自对象的水滴大小的样本。样本的尺寸典型的范围在0.1μl到2ml，诸如1-2ml，然而，更小量(例如0.1到100μl)可以被用于体外设备处理，以及然而获得更大的样本，诸如高达20ml，诸如7.5到17ml，也是可能的。

该样本被放入体外(invitro)诊断设备，该设备测量所涉及的至少三种蛋白质的浓度，以及返回诊断结果，基于具有轻度牙周炎或重度牙周炎对对象进行分类。

本发明的易用性使得可以定期(例如，作为定期牙科检查的一部分或甚至在家)对大多数患有牙周炎或发生牙周炎的高风险的牙科患者进行测试。尤其是，这可以在它发展为重度牙周炎之前，检测轻度牙周炎的存在，因此可以更及时地采取口腔护理措施，以防止牙周炎恶化。或者，例如，对已知处于牙周炎高风险并首次进行检查的患者，该方法可以识别牙周炎是否是轻度或重度。并且，该方法可以在对先前被诊断为重度牙周炎的患者进行治疗之后应用，以便检查牙周炎是否已经被改善从而变为轻度。特别地，该方法也适用于自我诊断，由此通过患者他或她本人实施取出样本以及将其放入设备的步骤。

当执行本发明以确定牙周炎是轻度还是重度时，患者可能典型的被已知患有牙周炎。因此，在某些实施例中，该方法用于评估已知患有牙周炎的人类患者是否患有轻度牙周炎或重度牙周炎。

本发明的方法典型的包括通过使用一种或多种检测试剂来检测构成本发明的生物标志物面板的上述至少三种蛋白质，以及可选的其他生物标志物蛋白质。

根据本发明被测试的“唾液”可以是未稀释的唾液，其可以通过吐出或擦拭来获得，或者是稀释的唾液，其可以通过用液体冲洗口腔来获得。稀释的唾液可通过以下方法获得：患者用无菌水(例如5ml或10ml)或其他合适的液体冲洗或漱口几秒钟，然后吐出到容器中。稀释的唾液有时可称为口腔冲洗液。

通过“检测”是指测量、定量、评分或测定生物标志物蛋白质的浓度。评估包括生物标志物蛋白质的生物化合物的方法是本领域已知的。可以认识到检测蛋白质生物标志物的方法包括直接测量和间接测量。本领域技术人员将能够选择测定特定生物标记蛋白的合适方法。

关于蛋白质生物标志物的术语“浓度”应具有其通常的含义，即一定体积中蛋白质的丰度。蛋白质浓度典型以每体积的质量进行测量，最典型为mg/ml或μg/ml，但有时低至pg/ml。备选的测量是摩尔含量(或摩尔浓度)，mol/l或“m”。所述浓度可以通过检测已知、已确定、或预定体积的样本的蛋白质的量确定。

备选的确定浓度是确定样本中蛋白质生物标志物的绝对量，或确定样本中的生物标志物的质量分数，例如相对于样本中所有其他蛋白质总量的生物标志物的量。

“检测试剂”是特异性地(或选择性地)结合、相互作用或检测目的生物标志物的试剂或化合物。这样的检测试剂可以包括，但不限于，优先结合蛋白生物标志物的抗体、多克隆抗体或单克隆抗体。

当涉及检测试剂时，短语“特异性地(或选择性地)结合”或“特异性地(或选择性地)与之发生免疫反应(immunoreactive)”，涉及结合反应，其确定蛋白质异质群体或其他生物制剂中蛋白质标志物的存在。因此，在指定的免疫测定条件下，特异性检测试剂(例如抗体)与特别的蛋白质结合至少是背景的两倍，以及基本上不与样本中存在的其他蛋白质大量结合。在这样的条件下特异性结合可能需要选择对于特别的蛋白质具有特异性的抗体。多种免疫测定形式可以被用于选择与特定蛋白质发生特异性免疫反应的抗体。例如，常规地使用固相elisa免疫测定法(酶联免疫吸附测定法)来选择与蛋白质具有特异性免疫反应的抗体(参见，例如,harlow&lane,antibodies,alaboratorymanual(1988),foradescriptionofimmunoassayformatsandconditionsthatcanbeusedtodeterminespecificimmunoreactivity)。典型的，特异性或选择性反应至少是背景信号或噪声的两倍，以及更典型的是背景的10到100倍以上。

“抗体”指的是基本上由免疫球蛋白基因或多种免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽配体，其特异性地结合(specificallybinds)并识别表位(例如抗原)。公认的免疫球蛋白基因包括κ和λ轻链恒定区基因，α、γ、δ、ε以及μ重链恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。抗体如下存在：例如作为完整抗体存在或者作为利用多种肽酶消化产生的许多特征明确的片段存在。这包括例如fab'和f(ab)'2片段。如本文所用，术语“抗体”还包括通过修饰完整抗体产生的或使用重组dna方法从头合成的那些抗体片段。它还包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或单链抗体。抗体的“fc”部分是指免疫球蛋白重链的部分，该部分包括一个或多个重链恒定区域域(domains)ch1、ch2和ch3，但不包括重链可变区域。抗体可以是双特异性抗体，例如，如下抗体：其具有与第一抗原特异性地结合的第一可变区以及与第二不同抗原特异性地结合的第二可变区。使用至少一种双特异性抗体可以减少所需的检测试剂的数量。

诊断方法的灵敏度和特异性不同。诊断测定的“灵敏度”是指测试阳性的患病个体的百分比(“真阳性”的百分比)。该测定法未检测到的患病个体是“假阴性”。没有患病并且在测定中测试为阴性的对象被称为“真阴性”。诊断测定的“特异性”为1减去假阳性率，其中“假阳性”率定义为没有疾病的、检测呈阳性的患者的比例。

可以通过任何手段在样本中检测本发明的生物标志物蛋白质。用于生物标志物检测的优选方法是基于抗体的测定、蛋白质阵列测定、基于质谱(ms)的测定和基于(近)红外光谱的测定。例如，免疫测定包括但不限于使用诸如蛋白质印迹、放射免疫测定、elisa、“三明治”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、荧光免疫测定等技术的竞争性以及非竞争性测定系统。这样的测定是常规的并且是本领域众所周知的。示例性的免疫测定在下面简要描述(但不旨在作为限制)。

免疫沉淀方案通常包括在裂解缓冲液(诸如补充有蛋白质磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(例如edta、pmsf、抑肽酶、钒酸钠)的ripa缓冲液(1％np-40或tritonx-100、1％脱氧胆酸钠、0.1％sds、0.15mnacl、0.01m磷酸钠(ph7.2)、1％trasylol))中裂解细胞群，向细胞裂解液中添加目标抗体，在4℃下孵育一段时间(例如1-4小时)，将a蛋白质和/或蛋白g凝胶微珠添加到细胞裂解液中，在4℃下孵育约一个小时或更长时间，在裂解缓冲液中洗涤微珠，然后将微珠重新悬浮在sds/样本缓冲液中。抗体免疫沉淀特定抗原的能力可以通过例如蛋白质印迹分析来评估。本领域技术人员将了解可以被修改以增加抗体与抗原的结合并降低背景的参数(例如，用凝胶微珠预先清除细胞裂解液)。

蛋白质印迹分析通常包括准备蛋白质样本，在聚丙烯酰胺凝胶(例如，取决于抗原的分子量，为8％-20％sds-page)中电泳蛋白质样本，将蛋白质样本从聚丙烯酰胺凝胶转移到膜上，诸如硝酸纤维素、pvdf或尼龙，在封闭溶液(例如含3％bsa的pbs或脱脂牛奶)中封闭膜，在洗涤缓冲液(例如pbs-tween20)中洗涤膜，利用稀释在封闭溶液中的基本抗体(目标抗体)封闭膜，在洗涤缓冲液中洗涤膜，利用与酶基体(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或被稀释在缓冲液中放射性分子(例如32p或125i)耦联的二级抗体(其分辨基本抗体，例如，抗人类抗体)来封闭膜，在洗涤缓冲液中洗涤膜，以及检测抗原的存在。本领域技术人员将了解可以被修改以增加检测到的信号并减少背景噪声的参数。

elisas典型的包括制备抗原(即目标生物标志物蛋白或其片段)，用抗原涂覆96孔(96-well)微量滴定板的孔，加入与可检测化合物例如酶基体(enzymaticsubstrate，例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)偶联的目标抗体到孔中，并孵育一段时间，并检测抗原的存在。在elisas中，目标抗体不必与可检测的化合物偶联；代替的，可以将与可检测的化合物偶联的第二抗体(其分辨目标抗体)添加到孔中。进一步，代替用抗原涂覆孔，可以将抗体涂覆到孔。在这种情况下，在将目标抗原添加到涂覆的孔中之后，可以添加与可检测的化合物偶联的第二抗体。本领域技术人员将了解可以修改以增加检测到的信号的参数以及本领域已知的elisas的其他变化。

由于使用了多种标志物，基于这些生物标志物的联合浓度阈值被确定。该阈值确定患者是否被分类为具有轻度牙周炎或重度牙周炎。本发明中反映的见解是：可以基于测量上述指出的生物标记物的组合，足够准确的检测出牙周炎处于轻度或重度。

该见解支持本发明的另一方面，蛋白质作为患有牙周炎的人类患者的唾液样本中的生物标志物的用途，蛋白质是以下蛋白质：il-1β、mmp-9、以及以下项中的至少一种：il-6或mmp-3，该生物标志物用于评估患者是否存在轻度牙周炎或重度牙周炎。

该使用可以以基本上在上文和下文中描述的方法来实施。

本发明的方法包括确定反映针对所述蛋白质的所测量的联合浓度的测试值。联合浓度值可以是通过输入确定的浓度并对这些值进行算术运算而获得的任何值。这可以是，例如，浓度的简单添加。它还可以包括将每个浓度乘以反映这些浓度的所期待权重的因子，以及然后将结果相加。它还可以涉及将浓度彼此相乘，或乘法、除法、减法、乘幂和加法的任意组合。它可以进一步涉及以一些幂(power)来提高浓度。

将得到的联合浓度值与阈值进行比较，该阈值以相同的方式反映与存在重度牙周炎相关联的联合浓度。该比较允许评估其唾液被接受测试的患者的测试值是否是存在重度牙周炎或轻度牙周炎的指示。

阈值例如可以是联合浓度值，其是以同样的方式基于针对在参考样本中的相同蛋白质确定的浓度而被获得，参考样本与存在重度牙周炎相关联(即在诊断为重度牙周炎的患者中)。典型的，由此，反映出相同的或更高的联合浓度的值指示受测患者存在重度牙周炎。类似地，在受测牙周炎患者的唾液中反映出较低的联合浓度的值指示牙周炎为轻度或中度(即非重度)。然而，应当理解，还可以计算阈值(例如，通过使用负乘数)，使得指示重度牙周炎的测试值将低于阈值，以及指示轻度牙周炎的测试值将高于阈值。

还可以基于测量样本集合中的现在的生物标志物蛋白的浓度来确定阈值，所述样本集合包括已知诊断为重度牙周炎以及不是重度(轻度和/或中度)牙周炎的患者。由此，可以对所测量的浓度值进行统计分析，可能包括机器学习方法，以允许以期望的灵敏度和特异性来区分被分类为具有轻度或中度牙周炎的患者以及被分类为该患者具有重度牙周炎的患者。由此，可以获得期望的阈值。基于该阈值，可以对待测样本进行相同的浓度测量，以及然后以与获得阈值相同的方式处理浓度值，从而确定联合浓度值，可以将其与阈值进行比较，因此可以将测试样本分类为具有轻度或重度牙周炎。

在一个令人关注的实施例中，以如下分数的形式获得联合浓度值。数值(蛋白质浓度值，例如ng/ml)被分配给每个测量，以及这些值以线性或非线性组合使用以计算0和1之间的分数。在如上所述基于对象集合确定阈值的情况下，典型的使用以联合浓度作为输入的s型函数来计算0到1之间的分数(如进一步所示)。

当分数超过某个阈值时，该方法指示患者具有重度牙周炎。该阈值可以基于期望的灵敏度和特异性来选择。

应当理解，根据本发明，在对对象进行“轻度或重度牙周炎分类”时，这是针对那些可以假设患有牙周炎的对象。这可以从例如以前进行过的牙周炎诊断得知(尽管可能无法区分其程度)，或者例如根据对象的口腔健康情况记录进行的假设得知。

本领域公认的临床定义基于以下内容：

牙龈指数(gi)

将根据等级为0到4的洛宾改良牙龈指数(mgi)记录全口牙龈指数，其中：

-0＝无炎症，

-1＝轻度炎症；任何部分的颜色略有变化、纹理少量变化，而不是整个边缘或乳突状牙龈单位变化，

-2＝轻度炎症；但涉及整个边缘或乳突状单位，

-3＝中度炎症；边缘或乳突状单位的上光、发红、水肿和/或肥大，

-4＝严重炎症；边缘或乳突状牙龈单位明显发红、水肿和/或肥大，自发性出血、充血或溃疡]。

探查深度(pd)

使用手动unc-15牙周探针将探查深度记录到最接近的毫米。探查深度是指从探针尖端(假设位于口袋底部)到游离牙龈边缘的距离。

牙龈萎缩(rec)

使用手动unc-15牙周探针将牙龈萎缩记录到最接近的毫米。牙龈萎缩是指从游离牙龈边缘到牙骨质-牙釉质结合处的距离。牙龈萎缩将以正数表示，牙龈过度生长将以负数表示。

临床附着丧失(cal)

临床附着丧失将根据每个部位的探查深度+萎缩量之和来计算。

探查出血(bop)

探查后，将评估每个部位的探查出血情况，如果在探查的30s内发生出血，则该部位的分数为1，否则分数为0。

得出的对象组(患者组)定义如下，其中轻度-中度牙周炎组和重度牙周炎组与本发明有关：：

-健康组(h)：所有部位的pd≤3mm(但在最后一个保留臼齿的远端最多可允许四个4mm的口袋)，无近端附着丧失的部位，≤10％部位的gi≥2.0，％bop分数≤10％；

-牙龈炎组(g)：>30％部位的gi≥3.0，无近端附着丧失的部位，没有pd>4mm的部位，％bop分数>10％；

-轻中度牙周炎组(mp)：近端pd为5-7mm，(相当于约2-4mmcal)≥8颗牙齿，％bop分数>30％；

-重度牙周炎组(ap)：近端pd≥7mm，(相当于约≥5mmcal)≥12颗牙齿，％bop分数>30％。

在一个实施例中，本发明的方法利用如图1示意性表示的系统。该系统可以是具有集成在其中的各种设备元件(单元)的单个装置。该系统还可以将其各种元件或这些元件中的一些作为单独的装置。图1所示的元件是测量设备(a)、图形用户界面(b)和计算机处理单元(c)。

如上所述，本发明的系统包括到界面的数据连接，由此界面本身可以是系统的一部分或可以是远程界面。后者是指使用不同的装置，优选是手持装置，诸如智能手机或平板电脑，用于提供实际界面。在这种情况下，数据连接将优选地涉及无线数据传输，诸如通过wi-fi或蓝牙，或通过其他技术或标准。

测量设备(a)被配置为接收唾液样本，例如通过将唾液滴放在药筒(cartridge)(a1)上，该药筒可以插入到设备(a)中。该设备可以是能够从相同唾液样本中确定至少蛋白质il-1β、mmp-9、以及以下项中的至少一种蛋白质：il-6和mmp-3的浓度的现有设备。

测量设备(a)应当能够接收唾液样本，例如通过将唾液滴放在药筒(a1)上，该药筒可以插入到设备(a)中。该设备可以是能够从相同唾液样本中确定至少蛋白质il-1β、mmp-9、以及可选地以下项中的至少一种蛋白质：il-6或mmp-3的浓度的现有设备。

处理单元(c)从部分(a)接收蛋白质浓度的数值。单元(c)被提供有软件(典型的为嵌入式软件)，该软件允许其计算介于0和1之间的分数(s)。该软件进一步包括对于阈值(t)的数值。如果计算值(s)超过(t)，则单元(c)将向图形用户界面(b)输出“重度牙周炎”的指示(i)，否则将输出“轻度牙周炎”。另一实施例可以使用(s)的特定值来指示确定性，所做出指示(i)利用确定性而被做出。这可以是概率分数，由此0.5是可能的阈值，以及例如分数s＝0.8将指示重度牙周炎的可能性。令人关注的选项是：

基于分数s，人员可以直接指示确定性，即s＝0.8意味着80％的牙龈炎确定性；

-基于分数s，人员可以进行二进制或三级指示：

-s<t->轻度牙周炎，s≥t->重度牙周炎

-s<r1->轻度牙周炎，r1≤s<r2->不确定，

-s≥r2->重度牙周炎

另外，可以对这种二进制或三级指示附加确定性。确定性将通过分数s与所选阈值(t，r1，r2)的距离而被确定。

可以实施分数的特定计算，例如，通过s形函数的方式，应用以下公式：

其中n是所用蛋白质/生物标志物的数量。c0，c1等是系数(数值)以及b1，b2等是相应的蛋白质浓度。

系数的确定可以通过训练过程来完成：

-选择n1名患有重度牙周炎的对象，以及n2名患有轻度牙周炎的对象。

没患有轻度牙周炎的对象被认为分数为s＝0，患有重度牙周炎的对象被认为具有分数为s＝1。

-从每个对象中获取唾液样本，以及如上所述确定生物标志物组合的蛋白质浓度。

-在蛋白质浓度和分数之间执行逻辑回归。

*其他回归或机器学习方法(线性回归、神经网络、支持向量机)可被用于训练分类器，该分类器基于蛋白质浓度预测对象是否患有牙龈炎或具有健康的口腔情况。

参考上述系统，在另一方面，本发明还提供了一种用于评估人类患者是否具有轻度牙周炎或重度牙周炎的系统，该系统包括：

-检测装置，能够并且适于检测人类患者唾液样本中的蛋白质il-1β、il-6以及以下项中的至少一种：mmp-9和mmp-8；如上所述，这样的装置是已知的，并且对于技术人员来说是容易获得的。典型的，提供一种用于在其中接收对象口腔样本的容器，该容器由检测装置提供。

-处理器，能够并且适于根据所述蛋白质的所确定的浓度，确定对象患有轻度牙周炎或者中度牙周炎的指示。

可选地，该系统包括能够呈现信息的用户界面(或到远程界面的数据连接)，特别是图形用户界面(gui)；gui是一种用户界面，它允许用户通过图形图标和可视指示符(诸如二级符号)与电子设备进行交互，而不是基于文本的用户界面、键入的命令标签或文本导航(在本发明中不排除任何这样的界面类型)；gui是众所周知的，并且典型的用于手持移动设备，诸如mp3播放器、便携式媒体播放器、游戏设备、智能手机以及较小的家庭、办公室和工业控件中；如所述的，可选地，还可以选择界面以便能够输入信息，诸如，对象的年龄、性别、bmi(身体质量指数)。

本发明还单独地或作为前述系统的一部分提供了一种试剂盒，用于检测人类患者唾液样本中的用于牙周炎的至少三种生物标志物，所述试剂盒包含一种或多种检测试剂，用于检测白介素-1β(il-1β)、基质金属蛋白酶-9(mmp-9)、以及以下项中的一种：白介素-6(il-6)和基质金属蛋白酶-3(mmp-3)。典型的，该试剂盒包含三种检测试剂，每种试剂针对不同的生物标志物，其中第一检测试剂能够结合il-1β，第二检测试剂能够结合mmp-8，第三检测试剂能够结合il-6和mmp-3中的一个。如以上参考本发明的方法所讨论的，所述试剂盒可以包含多种的检测试剂，诸如特别用于il-6和mmp-3中的另一个，和/或其他蛋白质。在优选的实施例中，试剂盒中可用的检测试剂由用于选择构成本发明的3-生物标志物面板的三种蛋白质的检测试剂(agents)组成，如上所述。

优选地，所述试剂盒包含固体支持物，例如芯片、微量滴定板或包含所述检测试剂的微珠或树脂。在一些实施例中，试剂盒包含质谱探针，诸如proteinchip^tm。

试剂盒还可提供特别的对未结合的检测试剂或对所述生物标志物的洗涤溶液和/或检测剂(reagents)(三明治型测定)。

在一个令人关注的方面，本发明的生物标志物面板的识别被应用于随时间监测人类患者牙周炎的状态。因此，本发明还提供了一种体外方法，用于确定在从第一时间点t1到第二时间点t2的时间间隔内患有牙周炎的人类患者的牙周炎状态的变化。该方法包括：在t1时从所述患者获得的至少一个唾液样本中以及在t2时从所述患者获得的至少一个唾液样本中，检测以下蛋白质的浓度：il-1β、mmp-8、以及以下项中的至少一种：il-6和mmp-3c，以及比较浓度，由此优选地，至少两个、并且更优选所有三个浓度的差异反映状态的变化。可以将这种差异视为浓度差异，从而无需首先生成0到1之间的数字或任何其他分类即允许直接比较。可以理解的是，在两个时间点接收的测量结果也可以以与如上的当确定轻度或重度牙周炎时相同的方式进行处理。

本发明还提供了一种诊断人类患者是否具有轻度牙周炎或重度牙周炎的方法，包括：在患者唾液中检测以下蛋白质的存在：白介素-1β(il-1β)、基质金属蛋白酶-9(mmp-9)、以及以下项中的至少一种蛋白质：白介素-6(il-6)和基质金属蛋白酶-3(mmp-3)。基于所述样本中所述蛋白质的浓度评估患者存在轻度牙周炎或重度牙周炎。可选择地，这方面的该方法包括进一步治疗患者牙周炎的步骤。该可选的治疗步骤可包括施用已知的治疗试剂或牙科程序，或治疗试剂与牙科程序的组合。已知的治疗试剂包括施用含抗菌剂的试剂，例如漱口剂、片、凝胶或微球体。用于治疗牙周炎的典型抗菌试剂是洗必泰(chlorhexidine)。其他治疗试剂包括抗生素，典型的是口服抗生素，以及酶抑制剂，诸如强力霉素。已知的非手术治疗程序包括刮治或根面平整(srp)。已知的外科手术程序包括减少(surgicalpocketreduction)、皮瓣手术、牙龈移植或骨移植。

本发明还提供了一种检测患有轻度或重度牙周炎的患者中的蛋白质白介素-1β(il-1β)、基质金属蛋白酶-9(mmp-9)、以及以下项中的至少一种蛋白质：白介素-6(il-6)和基质金属蛋白酶-3(mmp-3)的方法，包括：

(a)从人类患者身上取得唾液样本；以及

(b)通过使样本与能与il-1β结合的第一检测试剂、能与mmp-9结合的第二检测试剂、以及能与il-6和mmp-3中的一个结合的第三检测试剂接触以及检测每种蛋白质与检测试剂之间的结合，来检测在唾液样本中是否存在蛋白质白介素-1β(il-1β)、基质金属蛋白酶-9(mmp-9)、以及以下项中的至少一种蛋白质：白介素-6(il-6)和基质金属蛋白酶-3(mmp-3)。

参考以下非限制性实施例，将进一步说明本发明。

实施例

在一项针对60位对象的临床研究中，其中32位被诊断患有轻度牙周炎(包括中度牙周炎)，以及28位具有重度牙周炎，获得了roc(接收者-操作者-特征)曲线-下-面积(auc)值。

在统计中，接收者操作特性曲线或roc曲线是一个图形图，它说明了二进制分类器系统随着判别阈值变化时的性能。曲线通过绘制各种阈值设置下的真阳性率(tpr)与假阳性率(fpr)而被创建。真阳性率在机器学习中也称为灵敏度、重现或检测概率^[1]。假阳性率也称为混乱(fall-out)或错误警报概率，并且可以被计算为(1-特异性)。因此，roc曲线是灵敏度作为混乱(fall-out)的函数。通常，如果已知用于检测和错误警报的概率分布，则可以通过在y-轴上绘制检测概率的累积分布函数(从-∞到判别阈值的概率分布下的区域)，相对于x轴上的错误报警概率的累积分布函数来生成roc曲线。测试的准确性取决于该测试将测试对象分为有或没有相关疾病的人群的程度。准确性通过roc曲线下的面积测量。面积1代表完美的测试；面积0.5表示毫无价值的测试。对诊断测试的准确性进行分类的指南是传统的学术评分系统：

-0.90-1＝优秀(a)

-0.80-0.90＝良好(b)

-0.70-0.80＝一般(c)

-0.60-0.70＝较差(d)

-0.50-0.60＝失败(f)

基于上述内容，在上述临床研究的结果中，rocauc值大于0.75被认为代表了提供根据本发明的诊断测试的期望精度。

下表1总结了来自所有确定的生物标志物以及生物标志物面板中的代表0.70以上的rocauc值的数据。

表中所示的生物标志物蛋白质是如上所述的il-1β、mmp-9、il-6和mmp-3，以及mmp-8和hgf。

在该表中，可以看出，用由三个标志物：il-1β、mmp-9和il-6组成的生物标志物面板，可获得rocauc为0.77的最大结果。

用四个生物标志物面板获得接近上述的结果，为0.76，即il-1β，mmp-9，il-6和mmp-3或mmp-8。与此接近的结果0.76通过四个生物标志物(即，il-1β、mmp-9、il-6、以及mmp-3或mmp-8)而被获得。对于五个标志物面板，分别获得0.74和0.75的结果。然而，三个标志物面板il-1β，mmp-9，mmp-3的rocauc也为0.74。为了提供可用于本发明的简单但足够可靠的测试，希望使用尽可能少的生物标志物。由此可以看出，1个标志物和2个标志物的生物标志物面板提供的rocauc值低于或远低于0.7，即，相比完美测试的值(1)，更接近于上述毫无价值的值(0.5)。

现已发现，具有rocauc高于0.70、应用尽可能少的标志物的最佳结果取决于由il-1β、mmp-9、以及il-6或mmp、或添加如所示的其他标志物组成的生物标志物面板。显然，在结果相似的情况下，三标记物面板il-1β、mmp-9、以及il-6或mmp-3比四标记物面板更优。

表1

尽管已经在附图和前面的描述中详细图示和描述了本发明，但是这样的图示和描述应被认为是说明性或示例性的而不是限制性的；本发明不限于所公开的实施例。例如，可以以不同单位提出用于不同生物标志物的检测试剂。或，方便地，本发明的试剂盒可以包括在所有实施例中使用的用于蛋白质生物标志物的固定的检测试剂集合，即mmp-9以及il-1β，以及包括用于其他生物标志物中的任一种的检测试剂(即mmp-8或mmp-3)的灵活模块。

通过研究附图，公开内容和所附权利要求，本领域技术人员在实践所要求保护的发明时可以理解和实现所公开的实施例的其他变型。在权利要求中，词语“包括”不排除其他元件或步骤，以及不定冠词“一”或“一个”不排除多个。在互不相同的从属权利要求中叙述本发明的某些特征这一纯粹事实并不指示不能有利地使用这些特征的组合。权利要求中的任何附图标记都不应被解释为限制保护范围。

总之，我们在此公开了一种用于评估患有牙周炎的人类患者是否具有轻度或重度牙周炎的体外方法。该方法基于确定对三种生物标志物蛋白质的选择的见解。相应的，在患有牙周炎患者的唾液样本中，测量了以下蛋白质的浓度：白介素-1β(il-1β)、基质金属蛋白酶-9(mmp-9)以及以下项中的至少一种蛋白质：白介素-6(il-6)和基质金属蛋白酶-3(mmp-3)。基于所测量的浓度，确定反映针对所述蛋白质的联合浓度的值。将该值与阈值进行比较，该阈值以相同的方式反映与重度牙周炎相关的联合浓度。该比较允许评估测试值是否指示所述患者存在重度或轻度牙周炎。从而，典型的，反映联合浓度的测试值低于由阈值所反映的联合浓度是所述患者存在轻度牙周炎的指示，以及，反映联合浓度的测试值处于或高于由阈值所反映的联合浓度是所述患者存在重度牙周炎的指示。