一种游离肼的检测方法及其在磷酸西格列汀原料药杂质检测中的应用与流程

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种游离肼的检测方法及其在磷酸西格列汀原料药杂质检测中的应用。
背景技术：
：糖尿病是一种以糖代谢紊乱为主的慢性综合性疾病，包括胰岛素依赖型糖尿病(ⅰ型糖尿病)、非胰岛素依赖型糖尿病(ⅱ型糖尿病，占比90％)及妊娠期糖尿病。国际糖尿病联盟发布的全球糖尿病地图(第8版)显示，2017年全球糖尿病患病率(20～79岁)大约为8.8％，约有4.25亿成人糖尿病患者，到2045年，这一数字可能达到6.29亿。中国是糖尿病患者人数最多的国家，约占世界总数的四分之一。糖尿病作为一种高发慢性病，具有病情不可逆、后期并发症多等特点。血糖若控制不佳，糖尿病慢性化可引发糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变等并发症，造成肾衰、失明等严重后果，给社会和家庭造成巨大负担。同时，糖尿病也是引起众多心血管疾病的危险因素，如心肌梗死、脑卒中等。相关降糖机制研究表明，人体内血糖升高时可促进活性肠促胰岛激素胰高血糖素样肽-1(glp-l)和葡萄糖依赖性促胰岛素分泌肽(gip)的分泌，进而激发胰岛素的合成分泌过程，最终达到控制血糖的效果。体内的glp-1和gip容易被二肽基肽酶iv(dpp-iv)降解失活；因此，二肽基肽酶iv成为糖尿病治疗的靶点。磷酸西格列汀是首个获得美国食品药品监督管理局(fda)批准用于治疗ii型糖尿病的二肽基肽酶-4抑制剂(dpp-4抑制剂)，可有效抑制胰高血糖素样肽-1(glp-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素分泌多肽(gip)的灭活，提高内源性glp-1和gip的水平，促进胰岛β细胞释放胰岛素，同时抑制胰岛α细胞分泌胰高血糖素，从而提高胰岛素水平，降低血糖，且不易诱发低血糖和增加体重。磷酸西格列汀，化学名称：7-[(3r)-3-氨基-1-氧-4-(2,4,5-三氟苯基)丁基]-5,6,7,8-四氢-3-(三氟甲基)-1,2,4-三唑酮[4,3-a]吡嗪磷酸盐(1:1)一水合物，化学分子式c16h15f6n5o·h3po4·h2o，化学结构如式(i)所示。水合肼(nh2nh2·xh2o)是磷酸西格列汀合成的起始物料之一，如果合成反应不充分，很可能导致磷酸西格列汀原料药中残留杂质游离肼。由于含量极微，一直未纳入磷酸西格列汀杂质的检测项目。2018年7月欧盟药品局(ema)发布公告，华海药业供应的缬沙坦原料未知杂质中发现极微量的基因毒性杂质亚硝基二甲胺(以下称ndma)，并据此在成员国召回使用华海药业供应缬沙坦原料生产的药品。此事件后，公众对药品原料中的极微量杂质和药品安全给予了极大的关注。游离肼(nh2nh2)是一种基因毒性杂质，为确保用药安全性，有必要对磷酸西格列汀原料药中的游离肼进行定性和定量检测。现有技术有报道的针对肼类物质的检测方法有：(1)紫外分光光度法：由于游离肼的特殊结构，无发色团，因而其无紫外吸收，无法直接采用紫外检测器测定，一般需衍生化处理后再进行紫外检测。如：公开号cn102478521a的中国专利申请，利用游离肼与对二甲氨基苯甲醛发生反应，生成黄色的缩合物，于456nm波长处用紫外分光光度计检测氨氯地平类药物中游离肼含量。该方法操作繁琐，且灵敏度不高。(2)高效液相色谱法：由于游离肼的极性较大，在一般的反相液相色谱保留时间过短，需采用强极性填料或者离子交换填料的色谱柱，并需要强离子对试剂洗脱。如公布号cn101858894b的中国发明专利，以磺酸基键合与十八烷基键合的混合填料为固定相，以有机相(甲醇或乙腈)和水相(磷酸盐缓冲液或高氯酸盐缓冲液)组成的混合溶液为流动相，对米屈肼同时进行离子交换色谱和反相色谱洗脱。(3)气相色谱法：公开号cn103698459a的中国发明专利申请公开了先使游离肼在酸性条件下与丙酮发生反应，然后利用气相色谱检测衍生物4-甲基-3-戊烯-2-酮腙。由于需要衍生化，该方法操作较繁琐，耗时较长；且丙酮有一定的毒性，对环保不利。(4)荧光探针技术：公布号cn106431986b的中国发明专利公开了一种利用荧光探针分子检测游离肼的方法，但该方法仅能实现定性检测，无法进行定量测定。(5)离子色谱法：离子色谱法是近年来检测极性大、离子型化合物的热门方法。早在1992年，王永强就报道了采用dionex2020i离子色谱仪、安培检测器、hpic-cg1前置柱，hpic-cs1分析柱，以0.005mol/l赖氨酸/0.003mol/l盐酸为淋洗溶液测定水和污水中的微量肼(王永强；离子色谱法测定水和污水中微量肼；科技通报；1992年11月，第8卷第6期：354-357)。王勇等以去离子水作为尘土中肼离子的提取剂，经onguardiirp小柱和0.22μm过滤膜过滤后，以5mmol/l甲基磺酸为淋洗液，采用ionpaccs-12a离子交换色谱柱进行分离，并在柱后加碱后采用金电极安培检测器检测；该方法检出限为5.0μg/l,定量限为16.6μg/l(王勇，耿庆，等；离子色谱法检验液体炸药爆炸尘土中的肼离子；《色谱》，2013，第31卷第9期：920～923)。但是现有技术中还有对磷酸西格列汀原料药中极微量游离肼进行检测的相关报道。技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明提供一种游离肼的检测方法，以及该方法在磷酸西格列汀原料药杂质检测中的应用。具体地说，本发明提供一种基于离子色谱法检测游离肼的方法，以及该方法在磷酸西格列汀原料药中游离肼定性定量检测中的应用。本发明的方法无需对被检样品进行衍生化，无需特定的色谱柱填料，不使用有机溶剂，对环境无污染。而且本方法便捷、灵敏、检测成本低，游离肼最低线性检出浓度为0.18μg/ml，以信噪比3:1确定的最低检出浓度为0.05μg/ml；出峰时间在10min左右。且通过加样回收实验表明，供试品溶液中其他成分对游离肼的检测无干扰。本发明可实现在磷酸西格列汀原料药中快速、有效检测游离肼的目的，填补现有技术空白。为了实现上述目的，本发明采用了如下的技术手段：一种游离肼的检测方法，所述方法基于离子色谱法，包括：色谱条件的建立：色谱柱：thermodionexionpaccs12a色谱柱，250mm*4mm；保护柱：thermodionexionpaccg12保护柱，4mm*50mm；阳离子抑制器cers4mm；检测器：电导检测器；流动相：5mmol/l甲烷磺酸；流速：0.8ml/min-1.3ml/min；柱温：28℃-35℃；进样量：25ul。优选地，所述流速为1.0ml/min。根据色谱柱性能，所述柱温优选为32℃。本发明的检测方法，还包括对照品溶液的制备，具体步骤包括：精密量取硫酸肼适量，用超纯水或去离子水溶解并稀释成每1ml约含0.9μg游离肼的溶液，即得。本发明的检测方法，供试品溶液的制备也采用超纯水或去离子水作为溶剂。本发明的检测方法，还包括定性检测和/或定量测定，具体步骤包括：定性检测：在所述色谱条件下，精密量取对照品溶液25μl，注入离子色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分的色谱峰高为满量程的10％-20％；再精密量取供试品溶液和对照品溶液各25μl，分别进样，注入离子色谱仪，记录色谱图；与对照品溶液的色谱图比较，观察供试品溶液的色谱图中是否在相应的保留时间出现相应的色谱峰；定量测定：在所述色谱条件下，精密量取对照品溶液25μl，注入离子色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分的色谱峰高为满量程的10％-20％；再精密量取供试品溶液和对照品溶液各25μl，分别进样，注入离子色谱仪，按外标法计算供试品溶液中游离肼的含量。本发明的检测方法，最低线性检出浓度为0.18μg/ml，以信噪比3:1确定的最低检出浓度为0.05μg/ml。本发明还有一个目的在于提供上述检测方法在磷酸西格列汀原料药杂质检测中的应用。具体的，所述应用为利用本发明提供的上述检测方法，对磷酸西格列汀原料药中的游离肼进行定性检测和/或定量测定。本发明还提供一种磷酸西格列汀原料药中游离肼的检测方法，包括色谱条件建立、对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、定性检测和/或定量测定，其中，色谱条件的建立：色谱柱：thermodionexionpaccs12a色谱柱，250mm*4mm；保护柱：thermodionexionpaccg12保护柱，4mm*50mm；阳离子抑制器cers4mm；检测器：电导检测器；流动相：5mmol/l甲烷磺酸；流速：0.8ml/min-1.3ml/min；优选为1.0ml/min；柱温：28℃-35℃；优选为32℃；进样量：25ul；对照品溶液的制备：精密量取硫酸肼适量，用超纯水或去离子水溶解并稀释成每1ml含0.9μg游离肼的溶液，即得；供试品溶液的制备：取磷酸西格列汀适量，加超纯水或去离子水溶解并稀释成每1ml含60mg的溶液，即得；定性检测：在所述色谱条件下，精密量取对照品溶液25μl，注入离子色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分的色谱峰高为满量程的10％-20％；再精密量取供试品溶液和对照品溶液各25μl，分别进样，注入离子色谱仪，记录色谱图；与对照品溶液的色谱图比较，观察供试品溶液的色谱图中是否在相应的保留时间出现相应的色谱峰；和/或定量测定：在所述色谱条件下，精密量取对照品溶液25μl，注入离子色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分的色谱峰高为满量程的10％-20％；再精密量取供试品溶液和对照品溶液各25μl，分别进样，注入离子色谱仪，按外标法计算供试品溶液中游离肼的含量。本领域技术人员应该理解，在配制对照品溶液和供试品溶液时，由于每次称样量的差异，溶液浓度将在一定范围内波动。对于本发明，该波动的范围为±10％；例如浓度为0.99～0.81μg/ml范围内的对照品溶液都可用于本发明的检测方法。本发明建立的游离肼的检测方法，无需样品衍生化等处理，灵敏度高，最低线性检出浓度为0.18μg/ml，最低检出浓度为0.05μg/ml。本发明针对磷酸西格列汀建立的检测其中微量游离肼的方法，待测样品的前处理简单，方法专属性强，磷酸西格列汀原料药中其他成分对游离肼检测无干扰；且完成一个样品检测的时间短、可操作性强。因此，本发明提供的检测方法可以有效、快速地检测磷酸西格列汀原料中的游离肼，从而更好地控制产品的质量，为药品的安全使用提供保障。附图说明下面结合附图，对本发明做详细的说明。图1示出的是实施例1中流动相为15mmol/l→50mmol/l甲磺酸、梯度洗脱时的硫酸肼的色谱图；图中，标号为1的色谱峰为游离肼的色谱峰。图2示出的是实施例1中流动相为10mmol/l→40mmol/l甲磺酸、梯度洗脱时的硫酸肼的色谱图；图中，标号为1的色谱峰为游离肼的色谱峰。图3示出的是实施例1中流动相为20mmol/l→40mmol/l甲磺酸、梯度洗脱时的硫酸肼的色谱图；图中，标号为1的色谱峰为游离肼的色谱峰。图4示出的是实施例1中流动相为16mmol/l甲磺酸时的硫酸肼的色谱图；图中，标号为1的色谱峰为游离肼的色谱峰。图5示出的是实施例1中流动相为7mmol/l甲磺酸时的硫酸肼的色谱图；图中，标号为1的色谱峰为游离肼的色谱峰。图6示出的是实施例1中流动相为5mmol/l甲磺酸时的硫酸肼的色谱图；图中，标号为1的色谱峰为游离肼的色谱峰。图7示出的是实施例1中流动相为3mmol/l甲磺酸时的硫酸肼的色谱图；图中，标号为1的色谱峰为游离肼的色谱峰。图8示出的是实施例1中流动相为5mmol/l甲磺酸、流速为0.6ml/min时的硫酸肼的色谱图；图中，标号为1的色谱峰为游离肼的色谱峰。图9示出的是实施例1中流动相为5mmol/l甲磺酸、流速为1.3ml/min时的硫酸肼的色谱图；图中，标号为1的色谱峰为游离肼的色谱峰。图10示出的是实施例2中专属性试验，对照品溶液的色谱图；图中，标号为1的色谱峰为游离肼的色谱峰。图11示出的是实施例2中专属性试验，供试品溶液的色谱图。图12示出的是游离肼的标准曲线。图13示出的是实施例2中检出限试验，游离肼浓度为0.05μg/ml的色谱图；图中，标号为1的色谱峰为游离肼的色谱峰。图14示出的是实施例2中加样回收率试验，编号100％-3的测试样品溶液的色谱图；图中，标号为1的色谱峰为游离肼的色谱峰。具体实施方式以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。其中，部分试剂和仪器购买情况如下：离子色谱仪：thermodionexaq离子色谱仪带阳离子抑制器cers(4mm)和电导检测器，赛默飞世尔科技有限公司；色谱柱:thermodionexionpaccs12a(4mm*250mm)，赛默飞世尔科技有限公司；保护柱：thermodionexionpaccg12(4mm*50mm)，赛默飞世尔科技有限公司；电子天平：cpa225d赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。试剂以及试药：甲磺酸淋洗液：egciiimsa赛默飞世尔科技有限公司；硫酸肼：上海麦克林生化科技有限公司；超纯水：杭州娃哈哈集团；磷酸西格列汀：通化东宝药业股份有限公司，批号171101、171102、171103、160501、160502和160503。实施例1流动相的选择本实施例的目的在于考察以甲磺酸为流动相，其浓度和洗脱程序对游离肼分离和检测的影响。除流动相外，本实施例均采用如下的色谱条件离子色谱仪：thermodionexaquion型离子色谱仪；色谱柱：thermodionexionpaccs12a(4mm*250mm)；保护柱：thermodionexionpaccg12(4mm*50mm)；流速：1.0ml/min；柱温：28-35℃；阳离子抑制器cers(4mm)；检测器：电导检测仪；进样量：25μl。本实施例均采用硫酸肼对照品溶液进行测定，硫酸肼对照品溶液的制备方法为：精密量取硫酸肼适量，用超纯水溶解并稀释成每1ml约含0.9μg游离肼的溶液，即得。测定方法：精密量取对照品溶液25μl，注入离子色谱仪，记录色谱图。1.1甲磺酸浓度及洗脱程序的优选(1)15mmol/l→50mmol/l甲磺酸梯度洗脱按照表1所示的梯度洗脱程序进行洗脱和测定，色谱图见图1。表1梯度洗脱程序1时间(min)甲磺酸(mmol/l)0.01520.01520.150110.050110.115140.015从图1可以看出：游离肼出峰时间较早(保留时间6.42min)，与其他杂质分离度较差，出现明显的梯度峰。因此该流动相不适于游离肼的分离和检测。(2)10mmol/l→40mmol/l甲磺酸梯度洗脱按照表2所示的梯度洗脱程序进行洗脱和测定，色谱图见图2。表2梯度洗脱程序2时间(min)甲磺酸(mmol/l)0.01020.01020.14040.04040.11060.010从图2可以看出：改变初始浓度进行梯度洗脱后，游离肼出峰时间仍然较早(保留时间6.731min)，与其他杂质分离度较差；同时，还出现明显的梯度峰。上述两个梯度洗脱条件不适于游离肼的分离。(3)20mmol/l→40mmol/l甲磺酸梯度洗脱按照表3所示的梯度洗脱程序进行洗脱和测定，色谱图见图3。表3梯度洗脱程序3从图3可以看出：在该梯度洗脱条件下，游离肼出峰时间仍然较早(保留时间5.247min)，与其他杂质分离度较差；同时，还出现明显的梯度峰。上述三个梯度洗脱条件都不适于游离肼的分离。因此，决定采用等度洗脱方式进行洗脱，从而避免梯度峰，实现基线分离。(4)16mmol/l甲磺酸等度洗脱以16mmol/l甲磺酸为流动相进行洗脱和测定，色谱图见图4。从图4可以看出，游离肼出峰时间较早(保留时间5.397min)，且未能与其他杂峰达到基线分离。(5)7mmol/l甲磺酸等度洗脱以7mmol/l甲磺酸为流动相进行洗脱和测定，色谱图见图5。从图5可以看出，7mmol/l甲磺酸的洗脱能力较强，且游离肼的色谱峰响应较好，保留时间适宜(9.617min)；但是基线不平，容易造成测试计算误差。(6)5mmol/l甲磺酸等度洗脱以5mmol/l甲磺酸为流动相进行洗脱和测定，色谱图见图6。从图6可以看出，5mmol/l甲磺酸的洗脱能力较强，对游离肼的分离好，游离肼的色谱峰响应较好，保留时间适宜(11.591min)，且基线较平整。(7)3mmol/l甲磺酸等度洗脱以3mmol/l甲磺酸为流动相进行洗脱和测定，色谱图见图7。从图7可以看出，3mmol/l甲磺酸的洗脱能力弱，游离肼保留时间过长(保留时间19.947min)，同时游离肼的色谱峰峰型较差。从以上不同流动相的洗脱效果看，5mmol/l甲磺酸作为流动相，游离肼的保留时间适宜，吸收峰峰型好，与杂质实现了基线分离，且基线平滑。因此，优选流动相为5mmol/l甲磺酸。流动相的流速对分离效果也有影响，因此以5mmol/l甲磺酸为流动相进行了如下试验以优选出最佳的流动相流速。1.2流动相流速的优选(1)流速0.6ml/min以5mmol/l甲磺酸为流动相，流速0.6ml/min下进行洗脱和测定，色谱图见图8。从图8可以看出，比较1.0ml/min流速，在流速0.6ml/min条件下，游离肼的色谱峰响应仍较好，保留时间有所延后(保留时间20.597min)，但是基线出现了较大波动，容易造成测试计算误差。(2)流速1.3ml/min以5mmol/l甲磺酸为流动相，流速1.3ml/min下进行洗脱和测定，色谱图见图9。从图9可以看出，比较1.0ml/min流速，游离肼的色谱峰响应较好；另外系统管路压力稍大。上面的试验结果示出，5mmol/l甲磺酸作为流动相，流速在0.8～1.3ml/min之间游离肼色谱峰的响应均较好，尤其是流速为1.0ml/min时，游离肼的保留时间最适宜，色谱峰峰型好，实现了与其它杂峰的基线分离。因此，优选的5mmol/l甲磺酸的流速为1.0ml/min。经过上述研究和优选，建立了本发明的检测方法的色谱条件，具体的：离子色谱仪：thermodionexaquion型离子色谱仪；色谱柱：thermodionexionpaccs12a(4mm*250mm)；保护柱：thermodionexionpaccg12(4mm*50mm)；流动相：5mmol/l甲磺酸(超纯水配制)流速：0.8-1.3ml/min；柱温：28-35℃。优选地，色谱条件为：离子色谱仪：thermodionexaquion型离子色谱仪；色谱柱：thermodionexionpaccs12a(4mm*250mm)；保护柱：thermodionexionpaccg12(4mm*50mm)；流动相：5mmol/l甲磺酸(超纯水配制)流速：1.0ml/min；柱温：32℃。实施例2本发明的游离肼检测方法的方法学研究在实施例1的基础上，建立了游离肼的检测方法，具体的：i.色谱条件：离子色谱仪：thermodionexaquion型离子色谱仪；色谱柱：thermodionexionpaccs12a(4mm*250mm)；保护柱：thermodionexionpaccg12(4mm*50mm)；流动相：5mmol/l甲磺酸(超纯水配制)流速：0.8-1.3ml/min，优选1.0ml/min；柱温：28-35℃，优选32℃；阳离子抑制器cers(4mm)；检测器：电导检测仪；进样量：25μl。ii.对照品溶液的制备：精密量取硫酸肼适量，用超纯水溶解并稀释成每1ml约含0.9μg游离肼的溶液，即得；供试品溶液的制备：取磷酸西格列汀适量，加超纯水溶解并稀释成每1ml约含60mg的溶液，即得。iii.定性检测：在所述色谱条件下，精密量取对照品溶液25μl，注入离子色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分的色谱峰高为满量程的10％-20％；再精密量取供试品溶液和对照品溶液各25μl，分别进样，注入离子色谱仪，记录色谱图；与对照品溶液的色谱图比较，观察供试品溶液的色谱图中是否在相应的保留时间出现相应的色谱峰。iv.定量测定：在所述色谱条件下，精密量取对照品溶液25μl，注入离子色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分的色谱峰高为满量程的10％-20％；再精密量取供试品溶液和对照品溶液各25μl，分别进样，注入离子色谱仪，按外标法计算供试品溶液中游离肼的含量。本实施例以优选的色谱条件，对建立的游离肼的检测方法从专属性、稳定性、精密度、线性检测范围、最低检出限、耐用性、准确性(加样回收法)等方面进行方法学的验证。2.1专属性精密量取供试品溶液和对照品溶液各25μl，分别注入离子色谱仪，记录色谱图。结果见表4及图10和图11。.表4专属性试验结果专属性实验称样量(mg)浓度(μg/ml)保留时间(min)峰面积理论塔板数纯度硫酸肼35.620.8711.5910.0071616498.7％磷酸西格列汀600.0360003.00/00对照品溶液游离肼实现了基线分离，色谱峰型好，保留时间适当。虽然磷酸西格列汀中未检测到游离肼，但是在游离肼相应的出峰位置，未检测到其它色谱峰，说明本发明的方法专属性强。如果磷酸西格列汀中有极微量的游离肼存在，其它组分不会对游离肼产生干扰，本发明提供的方法能有效分离并检出游离肼。2.2稳定性供试品溶液以及对照品溶液制备好后，在放置室温(18-23℃)中放置分别在0h、2.5h、7.5h、20h测定，结果见表5。表5稳定性试验结果硫酸肼保留时间(min)峰面积磷酸西格列汀保留时间(min)峰面积0h11.6340.00850h/02.5h11.6740.00852.5h/07.5h11.9300.00877.5h/020h12.0970.009020h/0平均值11.8340.0087平均值/0rsd％1.85％2.72％rsd％//表4的数据示出，本发明提供的方法稳定。2.3线性范围取硫酸肼对照品适量，分别加超纯水稀释成0.18ug/ml、0.45ug/ml、0.89ug/ml、1.34ug/ml和2.70ug/ml的一系列浓度的溶液，分别取25ul注入离子色谱仪，记录色谱图，以游离肼浓度为横轴，以色谱峰面积(y)为纵坐标，进行线性回归，标准曲线见图12，线性回归方程为：y＝0.0115x-0.0001(r2＝0.9976)结果表明，当游离肼浓度在0.18μg/ml-2.70μg/ml的范围内，其浓度与色谱峰面积具有良好的线性关系(r＝0.9987)。本法对游离肼的最低线性检出浓度为0.18μg/ml，检出线性范围为0.0003％-0.00450％。2.4检出限游离肼对照品溶液用超纯水多次稀释后分别进样，按照信噪比3：1计算计算游离肼的最低检出浓度为0.05μg/ml。游离肼浓度为0.05μg/ml时的色谱图见图13。2.5精密度准确称取36.65mg硫酸肼，用超纯水配制成浓度为0.89μg/ml的对照品溶液；重复测定游离肼对照品溶液6次，结果见表6，rsd为1.78％。说明本发明的方法精密度符合要求。同一样品重复测定的rsd也符合要求。表6精密度试验结果2.6耐用性按照本发明提供游离肼的检测方法，用同一供试品溶液使用同一根色谱柱，分别微调流速、柱温、流动相，供试样品中其他成分对游离肼检测无干扰，表明所建方法耐用性高。结果见表7。表7耐用性试验结果2.7准确度(加样回收实验)精密称取硫酸肼36.65mg，用超纯水配制成浓度为8.91μg/ml贮备液，然后取贮备液适量，用超纯水稀释成浓度为0.891μg/ml的对照品溶液。精密称取磷酸西格列汀9份，每份约600mg，用超纯水配制成浓度约为600mg/ml的供试品溶液。分别精密吸取25μl，注入离子色谱仪，进行测定。结果在供试品溶液中未检测到游离肼。然后按照表8所示分别加入相应体积的贮备液，其中50％加入量为0.5ml贮备液，100％加入量为1.0ml贮备液，150％加入量为1.5ml贮备液，摇匀后，分别精密吸取25μl，注入离子色谱仪，进行测定，记录色谱图，计算游离肼的含量，计算回收率，结果见表8，编号100％-3的加样回收测试样品溶液的色谱图，见图14。表8加样回收率试验结果表8的数据表明本发明的方法准确度较高，图14表明磷酸西格列汀成分对游离肼检出无影响。总之，通过上述方法学研究证明，本发明提供的利用离子色谱检测磷酸西格列汀中游离肼的方法，专属性、稳定性和耐用性好，精密度和准确性高，最低线性检出浓度为0.18μg/ml，以信噪比3:1确定的最低检出浓度为0.05μg/ml，检出线性范围为0.0003％-0.00450％。实施例3使用本发明方法对6批磷酸西格列汀进行测定具体测定结果如下：分别称取磷酸西格列汀原料药适量，加超纯水溶解并稀释制成每1ml约含60mg的溶液，作为对照品溶液；精密量取硫酸肼适量，用超纯水稀释成每1ml约含0.9μg的溶液，作为对照溶液。在实施例2所述的色谱条件下，精密量取对照品溶液25μl，注入离子色谱仪，调节仪器灵敏度，使主成分的色谱峰高为满量程的10％-20％。再精密量取供试品溶液和对照品溶液各25μl，分别进样，注入离子色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的5倍，按外标法计算磷酸西格列汀中游离肼杂质含量。结果见表9。表96批磷酸西格列汀中杂质游离肼的测定结果名称批号浓度(μg/ml)峰面积含量硫酸肼c102056180.880.0091/磷酸西格列汀16050159985.000未检出磷酸西格列汀16050259995.000未检出磷酸西格列汀16050360005.000未检出磷酸西格列汀17110159960.000未检出磷酸西格列汀17110260006.000未检出磷酸西格列汀17110360027.000未检出上述检测结果表明，所检测的吉林通化东宝生产的磷酸西格列汀中未检测到游离肼，在游离肼检测项目上产品质量是合格的。当前第1页12