采用絮凝技术富集水样中寄生虫卵（孢）囊的方法及应用与流程

本发明属于寄生虫检测领域，更具体地涉及采用絮凝技术富集水样中寄生虫卵(孢)囊的方法及应用。
背景技术：
：原水的水质关系到城市的饮用水安全，尤其是寄生虫检测具有重要的公共卫生意义。隐孢子虫和贾第虫是广泛存在与水体中的肠道病原微生物，也是世界范围内引起腹泻疾病的重要水源性病原。水源性传播是导致这两种病原寄生虫大范围传播的主要途径，世界范围内超过90％的水源性疾病的暴发都是由这两种病原寄生虫引起。美国环境保护署(usepa)和世界卫生组织将隐孢子虫和贾第虫列入了饮用水必检微生物，而我国也于2006年将这两种病原寄生虫加入了国家标准中的微生物检测指标(gb5749-2006)。目前原水中的隐孢子虫和贾第虫的富集方法主要采用1993年颁布的usepa-1623中的免疫磁分离法，主要包括卵(孢)囊的过滤离心、免疫磁分离步骤。其主要缺点是由于试剂盒和免疫磁分离的设备成本较高，因此限制了其使用规模。此外，这种富集方法的操作较为复杂，因此容易引起误差，不利于实际的监测应用。因此，迫切需要一种简便的，快速的卵(孢)囊富集方法以便于后续检测。技术实现要素：针对上述现有技术中对寄生虫的富集方法操作较为复杂，容易引起误差的问题，本发明提供采用絮凝技术富集水样中寄生虫卵(孢)囊的方法及应用。根据本发明提供的采用絮凝技术富集水样中寄生虫卵(孢)囊的方法，包括以下步骤：s1，采集水样；s2，在水样中加入絮凝剂，该絮凝剂的体积是水样的体积的1％-3％，该絮凝剂为摩尔浓度介于0.5-1.5mol/l之间的cacl2水溶液和摩尔浓度介于0.5-1.5mol/l之间的nahco3水溶液，再将加入絮凝剂后的水样的ph值调至10±0.1，生成絮凝物，静置后形成第一上清液和第一沉淀，该第一沉淀中含有寄生虫卵(孢)囊和杂质；s3，在第一沉淀中加入氨基磺酸溶液形成第一沉淀悬浮液，离心分离该第一沉淀悬浮液以得到第二沉淀，然后在第二沉淀中加入杜氏磷酸盐缓冲液形成第二沉淀悬浮液，离心分离该第二沉淀悬浮液得到离心沉淀，该离心沉淀中包含寄生虫卵(孢)囊，其中，杂质溶解于氨基磺酸溶液和/或杜氏磷酸盐缓冲液中被去除。从而，通过加入cacl2和nahco3，再使用naoh将ph值调至10±0.1，获得第一沉淀，该第一沉淀中含有寄生虫卵(孢)囊和杂质；通过对第一沉淀进行悬浮，离心去除第一沉淀中的杂质，获得离心沉淀，该离心沉淀中包含寄生虫卵(孢)囊。优选的，该s1中采集水样具体为采集水面20cm以下的水样。优选的，该s2包括：s21，在水样中边搅拌边加入cacl2水溶液和nahco3水溶液，然后再加入naoh调节ph至10±0.1。优选的，该步骤s3中离心分离该第一沉淀悬浮液和第二沉淀悬浮液的参数均为3750r/m。优选的，该氨基磺酸溶液的浓度为8-12wt％。优选的，该寄生虫卵(孢)囊为隐孢子虫卵囊。优选的，该寄生虫卵(孢)囊为贾第虫孢囊。优选的，该cacl2水溶液和nahco3水溶液的摩尔浓度相等。本发明还提供上述制备方法在寄生虫卵(孢)囊检测中的应用。总之，本发明提供的采用絮凝技术富集水样中寄生虫卵(孢)囊的方法及应用简便、快速，便于后续检测，避免了现有技术中富集操作复杂，引起误差的问题。附图说明图1a-图1b为采用本发明提供的方法富集黄浦江水样中隐孢子虫卵囊后进行检测的电泳图。图2a-图2b为采用本发明提供的方法富集黄浦江水样中贾第虫孢囊后进行检测的电泳图。具体实施方式下面将结合本发明的附图及具体实施方式，对本发明的技术方案进行详细的说明，但如下实施例仅是用以理解本发明，而不能限制本发明，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合，本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。主要仪器：水样采样器；水样收集桶(10l)；ph计(mettlertoledo)；电子分析天平(adgr-200)；磁力搅拌器(上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司)；中型台式离心机(eppendorfcentifuge5451d)；500ml水样离心瓶(eppendorf)；4℃/-20℃/80℃冰箱(thermal)；sx200全自动高压灭菌锅(tomy)；fastpreptmfp120(bio101)；紫外交联仪(spectrolinkertmxl-1500uvcrosslinker)；旋涡振荡器(dynel)；10/200/1000μl微量移液枪(eppendorf)；pcr仪(abi96-wellthermalcycler)；；小型台式离心机(eppendorfcentifuge5424)；琼脂糖凝胶电泳仪(thermoec105)；紫外凝胶成像系统(epichemiiidarkroomuvp)；主要试剂：氯化钙(cacl2，国药集团化学试剂有限公司)碳酸氢钠(nahco3，国药集团化学试剂有限公司)氢氧化钠(naoh，国药集团化学试剂有限公司)氨基磺酸(nh2so3h，国药集团化学试剂有限公司)吐温80(国药集团化学试剂有限公司)磷酸二氢钾(kh2po4，国药集团化学试剂有限公司)磷酸氢二钠(na2hpo4·7h2o，国药集团化学试剂有限公司)氯化钠(nacl2，国药集团化学试剂有限公司)氯化钾(kcl，国药集团化学试剂有限公司)spinforsoilkit---dna提取试剂盒(mpbiomedicals)；超纯水(thermoscientific，pittsburgh，pa)；fermentaspcrmastermix2×(appliedbiosystems)；牛血清白蛋白(sigma)；琼脂糖leagarose(lonza)；溴化乙锭(biotium)；6×dnaloadingbuffer(biolab)；tridyetm100bpdnaladder(biolab)；10×tae缓冲液；pcr引物(均由上海生工生物股份有限公司合成)。实施例1根据本发明提供的采用絮凝技术富集水样中寄生虫卵(孢)囊的方法包括：步骤(1)，用集水器采集水面20cm以下的水样10l于采样桶中，4℃低温保存；将采样桶中的水样倒入10l塑料桶中，倒入时轻轻摇晃，用适量去离子水冲洗采样桶，确保采样桶底部及桶壁上无残留固体。步骤(2)，在塑料桶中加入磁力搅拌转子，转速1000-1500转/min，在水样中形成稳定的小漩涡，同时加入约100ml的1mol/lcacl2水溶液和100ml的1mol/lnahco3水溶液，然后在加入cacl2水溶液和nahco3水溶液的水样中加入5mol/l的naoh水溶液，调节ph至10±0.1，生成大量的白色絮凝物，该白色絮凝物包含寄生虫卵(孢)囊，继续搅拌30min，搅拌结束后，静置4h以上，形成第一上清液和第一沉淀。步骤(3)，虹吸去除塑料桶中的第一上清液，得到第一沉淀，该第一沉淀中包含寄生虫卵(孢)囊和杂质。步骤(4)，在第一沉淀中加入200ml的10wt％氨基磺酸溶液，用力摇晃水桶，确保第一沉淀与氨基磺酸充分接触并完全溶解，获得第一沉淀悬浮液。步骤(5)，将塑料桶中的第一沉淀悬浮液倒入烧杯中，用200ml0.1％的吐温80溶液冲洗桶壁，然后用100ml0.1％的吐温80溶液，再次冲洗桶壁，将第一沉淀悬浮液转移至烧杯中；将烧杯中的溶液分别倒入离心瓶中，用50ml吐温80溶液冲洗烧杯，平均分配加入离心瓶中，确保烧杯杯壁无残留。配平离心瓶，以3750r/min的转速离心20min后，在离心瓶中形成第二上清液和第二沉淀，虹吸除去离心瓶中的第二上清液，得到第二沉淀，该第二沉淀中包含寄生虫卵(孢)囊。步骤(6)，往第二沉淀中加入35ml杜氏磷酸盐缓冲液(dpbs)使第二沉淀重新悬浮得到第二沉淀悬浮液，然后转移至离心管中，配平后在3750r/min转速下离心20min，在离心管中形成离心上清液和离心沉淀，该离心沉淀中包含寄生虫卵(孢)囊。其中，杜氏磷酸盐缓冲液(dpbs)包括：8.0g/lnacl、1.15g/lna2po4、0.2g/lkcl和0.2g/lkh2po4。步骤(7)，弃去离心上清液，得到离心沉淀，转移500μl离心沉淀至5ml离心管中，于-80℃冰箱中保存。本发明还提供采用絮凝技术富集水样中寄生虫卵(孢)囊的应用：采集上海黄浦江中水样45份即水样1-水样45，经过步骤(1)-步骤(7)分别获得各水样对应的黄浦江水样富集沉淀。分别采用上海某宠物医院宠物狗的粪便中的隐孢子虫卵囊阳性dna水样和贾第虫孢囊阳性dna水样作为阳性对照，对黄浦江水样富集沉淀中隐孢子虫卵囊和贾第虫孢囊的有无进行对照检测。采用巢式pcr技术，即两轮pcr，第一轮的产物略长于第二轮的目标产物，最终用来测序的是第二轮的产物。采用如下pcr体系(表1)和pcr程序(表2、表3)分别获得黄浦江水样富集沉淀隐孢子虫卵囊扩增产物、黄浦江水样富集沉淀贾第虫孢囊扩增产物、隐孢子虫卵囊阳性dna水样扩增产物和贾第虫孢囊阳性dna水样扩增产物。表1pcr体系试剂第一轮pcr加样体积第二轮pcr加样体积超纯水18.5μl16μlmastermix25μl25μlbsa(102μl-正向引物1.25μl2.5μl反向引物1.25μl2.5μldna模板2μl4μl*总计50μl50μl其中隐孢子虫卵囊18srrna基因：第一轮第一隐孢子虫正向引物(f1)，cctatcagctttagacggtagg第一隐孢子虫卵囊反向引物(r1)，tctaagaatttcacctctgactg第二轮第二隐孢子虫卵囊正向引物(f2)，gacatatcattcaagtttctgacc第二隐孢子虫卵囊反向引物(r2)，ctgaaggagtaaggaacaacc贾第虫孢囊tpi基因：第一轮第一贾第虫孢囊正向引物(f3)，aataaatiatgcctgctcgtcg第一贾第虫孢囊反向引物(r3)，atggacitcctctgcctgctc第二轮第二贾第虫孢囊正向引物(f4)，cccttcatcggiggtaacttcaa第二贾第虫孢囊反向引物(r4)，gtggccaccacicccgtgcc表2扩增隐孢子虫卵囊18srrna基因的pcr循环参数表3扩增贾第虫孢囊tpi基因的pcr循环参数隐孢子虫卵囊检测结果如图1a-图1b所示，水样1，10～12，35～45泳道的扩增产物约为580bp，即为隐孢子虫卵囊18srrna基因，因此说明这些水样中含有隐孢子虫卵囊，而其他水样中则不含隐孢子虫卵囊。贾第虫孢囊检测结果如图2a-图2b所示，水样1～5，16，20，24～25，35，37～38，40泳道的扩增产物为530bp，即为贾第虫孢囊tpi基因，因此说明这些水样中含有贾第虫孢囊，而其他水样中则不含贾第虫孢囊。应该理解，本发明提供的采用絮凝技术富集水样中寄生虫卵(孢)囊的应用，不仅适用于隐孢子虫卵囊、贾第虫孢囊的检测还适用于卡耶塔环孢子虫、毕氏肠微孢子虫等其他寄生虫卵(孢)囊的检测。应该理解，本法实施例中不限于采用巢式pcr检测技术还可以是采用elisa，qpcr等其他技术。虽然絮凝剂在上述实施例中被限定为100ml的1mol/lcacl2水溶液和100ml的1mol/lnahco3水溶液，而氨基磺酸溶液被限定为10wt％，申请人还对50-150ml的0.5-1.5mol/lcacl2水溶液和50-150ml的0.5-1.5mol/lnahco3水溶液，以及8-12wt％的氨基磺酸溶液进行了实验，其同样可以实现对水样中的寄生虫卵(孢)囊的富集。因此，以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。序列表<110>华东理工大学<120>采用絮凝技术富集水样中寄生虫卵（孢）囊的方法及应用<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>上海生工生物股份有限公司<400>1cctatcagctttagacggtag21<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>上海生工生物股份有限公司<400>2tctaagaatttcacctctgactg23<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>上海生工生物股份有限公司<400>3gacatatcattcaagtttctgacc24<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>上海生工生物股份有限公司<400>4ctgaaggagtaaggaacaacc21<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>上海生工生物股份有限公司<400>5aataaattatgcctgctcgtcg22<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>上海生工生物股份有限公司<400>6atggacttcctctgcctgctc21<210>7<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>上海生工生物股份有限公司<400>7cccttcatcggtggtaacttcaa23<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>上海生工生物股份有限公司<400>8gtggccaccactcccgtgcc20当前第1页12