一种艾本那肽前体中三乙胺残留的GC检测方法与流程

本发明涉及艾本那肽前体中三乙胺残留的检测方法。

背景技术：

glp-1是一种人体内存在的肽激素，通过环磷酸腺苷或其他细胞内信号传导机制与其他调节系统协同发挥作用，诱导胰岛素分泌、刺激胰岛素生物合成、抑制胰高血糖素分泌、延迟胃排空、并且减少摄食量，同时对胰腺产生滋养作用。

作为glp-1类似物，exendin-4可通过glp-1受体诱导产生与glp-1类似的生理学作用，但比glp-1更加强效，作用持续时间更长。

艾本那肽前体是一种经过合成修饰的exendin-4，通过与重组人血白蛋白相结合，避免了快速降解和快速肾清除，因此延长了作用持续时间，并具有与exendin-4类似的生理作用和作用机制。

在艾本那肽前体的纯化过程中，使用三乙胺作为流动相。三乙胺对发育有影响，具有生殖毒性，故需对艾本那肽前体中的三乙胺残留进行控制。

由于艾本那肽前体使用三氟乙酸进行沉淀，造成艾本那肽前体的水溶液成酸性。三乙胺与三氟乙酸成盐，造成三乙胺无法准确检出。

技术实现要素：

本发明提供一种仅通过普通的高效气相色谱仪便可实现艾本那肽前体中三乙胺残留检测的方法。

为实现本发明目的，这种艾本那肽前体中三乙胺残留的gc检测方法其特征在于包括以下步骤：

a.溶液制备

①对照品贮备溶液：将三乙胺加入0.08m～0.1m氢氧化钠水溶液制得浓度为9～11mg/ml的三乙胺对照品贮备溶液，备用；

②对照品溶液：取三乙胺对照品贮备溶液加入0.08m～0.1m氢氧化钠水溶液制得浓度为0.9～1.1mg/ml的三乙胺对照品溶液，备用；

③系统适用性溶液：在艾本那肽前体0.1g中加入5ml三乙胺对照品溶液溶解后摇匀，备用；

④供试品溶液：在艾本那肽前体0.1g中加入0.08m～0.1m的氢氧化钠水溶液5ml溶解后摇匀，备用；

b.gc检测色谱条件

色谱柱：采用6%氰丙基-苯基-甲基聚硅氧烷为填充剂的色谱柱；内径为0.20～0.53mm，柱长25～75m，膜厚1.12～3μm；

柱温：35～45℃；

载气：氮气；

流速：2.5～3.5ml/min；

检测器：fid；

进样口温度：120～180℃；

分流比：20:1～30:1；

检测器温度240℃～280℃；

顶空条件：顶空平衡温度75℃～85℃；

顶空平衡时间：25～35min；

升温程序：40℃保持6～10min后以10～20℃/min升温至100℃，保持1～3min后再以20～40℃/min升温℃，升温至180℃后保持1～3min；最后以30℃/min升至240℃,维持7～9min；

c.对空白溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液进行气相色谱仪检测。

本发明色谱条件的选择

1、色谱柱的选择

本发明分别选择hp-5、db-624、hp-50三种气相色谱柱，用hp-5色谱柱时检测时间55分钟，用hp-50色谱柱时色谱峰分叉。通过比较，用6%氰丙基-苯基-甲基聚硅氧烷为填充剂的色谱柱效果最好，三乙胺的拖尾因子、准确度及耐用性等最佳。

2、柱温的选择

选择6%氰丙基-苯基-甲基聚硅氧烷为填充剂的色谱柱进行三乙胺检测最佳温度使用范围35～180℃。

3、顶空平衡温度的选择

本发明使用的溶剂为0.08m～0.1m氢氧化钠水溶液，顶空平衡温度最佳温度使用范围为75℃～85℃。

本发明方法学的建立

1、专属性试验

将0.08m～0.1m氢氧化钠水溶液空白溶剂、系统适用性溶液分别顶空加热后，依次注入气相色谱仪，记录色谱图，谱图显示溶剂对检测无干扰，三乙胺与相邻杂质间的分离度大于1.5。

2、线性范围

精密量取三乙胺对照储备液各1、2.5、4、5、6、7.5ml，分别置于6个50ml容量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀后各精密量取5ml，分别置于20ml顶空瓶中，压盖，顶空加热后注入气相色谱仪，记录色谱图。以峰面积（a）为纵坐标，浓度（c）为横坐标进行线性回归，回归方程a=54561c−1372.6，r²=0.9982（n=6），结果表明三乙胺在0.2048～1.5362mg/ml范围内具有良好的线性关系。

3、耐用性试验

3.1不同色谱柱

选择三根不同批号的色谱柱进行系统适用性试验并对艾本那肽前体进行测定，系统适用性试验均符合要求，三乙胺测定结果一致，结果见表1，从考察结果可知，不同批号的色谱柱均满足测定要求。

表1艾本那肽前体中三乙胺含量测定不同色谱柱考察结果

db-624色谱柱为美国agilent公司产品，填充剂为6%氰丙基-苯基-甲基聚硅氧烷。

3.2不同色谱条件考察

适当改变艾本那肽前体中三乙胺含量测定时的色谱条件，进行系统适用性试验并对艾本那肽前体进行测定，系统适用性试验均符合要求，三乙胺测定结果一致，确认的色谱条件的耐用性范围及三乙胺测定结果见表2、表3。

表2三乙胺检查色谱条件的耐用性

表3艾本那肽前体中三乙胺不同色谱条件的测定结果

4、准确度

取供试品艾本那肽前体0.1g，精密称定后，置于20ml顶空瓶中，精密加入5ml对照溶液溶解后，压盖，摇匀。平行制备6份，分别顶空加热，注入气相色谱仪，记录色谱图。计算三乙胺的回收率，三乙胺回收率范围是94.31～100.24%，回收率rsd（n=6）2.08%，结果见表4。

表4准确度结果

5、定量限

取三乙胺对照品贮备液适量，加入0.08m～0.1m的氢氧化钠水溶液稀释到2ppm的浓度后，精密量取5ml，置于20ml顶空瓶中压盖，摇匀。顶空加热，注入气相色谱仪，记录色谱图，此时信噪比s/n为1626，峰面积rsd%（n=6）为5.2%。此时进样浓度2ppm（相当于主成分艾本那肽前体质量含量的0.01%），满足三乙胺检测要求。

结果显示，采用6%氰丙基-苯基-甲基聚硅氧烷为填充剂的气相色谱柱按上述条件测定艾本那肽前体中三乙胺的含量，经验证方法准确可行。

本发明具有以下有益效果：

（1）加入氢氧化钠使供试品溶液略显碱性，可满足检测要求，样品检测时间短，单针样品运行时间约26min，操作简便可靠，对色谱柱及仪器要求低，既适用于实验室的检测，更适用于企业大规模生产的产品质量控制，对于产品中控等能较快得到检测结果。

（2）本发明方法专属性强，准确度回收率在94.31%～100.24%之间，线性系数r²为0.9982，可准确测定酸性样品中三乙胺含量。

（3）本发明方法定量限为2ppm，检测更灵敏，且远低于限度值，可有效的检测艾本那肽前体中三乙胺残留量，可应用于需要进行酸性样品中三乙胺残留检测的产品。

附图说明

图1为本发明检测艾本那肽前体中三乙胺的空白溶剂色图谱。

图2为本发明检测艾本那肽前体中三乙胺的系统适用性溶液色图谱。

图3为本发明检测艾本那肽前体中三乙胺的对照品溶液色谱图。

图4为本发明检测艾本那肽前体中三乙胺的供试品溶液色谱图。

具体实施方式

以下实施例有助于本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。

实施例1：

艾本那肽前体中三乙胺含量的测定包括以下步骤：

a.溶液制备

①对照品贮备溶液：取三乙胺约1g至100ml容量瓶中加入0.08m的氢氧化钠水溶液制得浓度为9～11mg/ml的三乙胺对照品贮备溶液，备用；

②对照品溶液：取上述三乙胺对照品储备溶液10ml至100ml容量瓶中加入0.08m的氢氧化钠水溶液，定容，摇匀，制得浓度为0.9～1.1mg/ml的三乙胺对照品溶液，备用；

③系统适用性溶液：取艾本那肽前体0.1g加入5ml三乙胺对照品溶液溶解后摇匀，备用；

④供试品溶液：取艾本那肽前体供试品0.1g，精密加入0.08m的氢氧化钠水溶液5ml溶解后摇匀，备用；

b.gc检测色谱条件

色谱仪：采用agilent7890型气相色谱仪；

色谱柱：采用6%氰丙基-苯基-甲基聚硅氧烷为填充剂的色谱柱；内径为0.53mm，柱长30m，膜厚3μm；

色谱条件：

色谱仪：agilent7890型气相色谱仪；

柱温：40℃；

载气：氮气；

流速：3.0ml/min；

检测器：fid；

进样口温度：150℃；

分流比：25:1；

检测器温度260℃；

顶空条件：顶空平衡温度80℃；

顶空平衡时间：30min；

色谱柱升温程序：40℃保持8min后以20℃/min升温至100℃，保持1min；再以30℃/min升温至180℃后保持2min，最后以30℃/min升至240℃后维持8min；

c.将空白溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液分别进行气相色谱仪检测。

d.测定结果

①系统适用性结果

三乙胺保留时间为10.192min，拖尾因子1.40，理论塔板数72493，与相邻色谱峰的分离度为68.07。

将0.08m～0.1m氢氧化钠水溶液空白溶剂注入气相色谱仪，记录色谱图如图1所示，从图1可看出，0.08m～0.1m的氢氧化钠水溶液对艾本那肽前体中三乙胺的检测无影响。

将系统适用性溶液注入气相色谱仪，记录色谱图如图2所示，从图2可看出，三乙胺与相邻杂质间的分离度大于1.5，杂质对艾本那肽前体中三乙胺的检测无影响。

②供试样品试验

取上述供试品溶液及对照品溶液分别注入气相色谱仪，记录色谱图如图3、4所示，从图3可看出，三乙胺色谱峰峰型良好，保留时间与系统适用性溶液中一致，可用于艾本那肽前体中三乙胺的检测；从图4可看出，供试品中未检出三乙胺，可见在艾本那肽前体制备过程中，三乙胺已去除干净，符合遗传毒性杂质限度的要求。

e.计算结果

其中：m对：三乙胺对照品的质量（mg）；

v对：三乙胺对照品溶液的稀释体积（ml）；

p对：三乙胺对照品的纯度（99.99%）；

a供：供试品溶液中三乙胺的色谱峰面积；

m供：供试品艾本那肽前体的质量（mg）；

v供：供试品艾本那肽前体溶液的稀释体积（ml）；

a对：对照品中三乙胺的色谱峰面积。

艾本那肽前体中：

=0，

艾本那肽前体中三乙胺残留未检出。

实施例2：

a.溶液制备

①对照品贮备溶液：取三乙胺约1g至100ml容量瓶中加入0.1m的氢氧化钠水溶液制得浓度为9～11mg/ml的三乙胺对照品贮备溶液，备用；

②对照品溶液：取上述三乙胺对照品储备溶液10ml至100ml容量瓶中加入0.1m的氢氧化钠水溶液，定容，摇匀，制得浓度为0.9～1.1mg/ml的三乙胺对照品溶液，备用；

③系统适用性溶液：取艾本那肽前体0.1g加入5ml三乙胺对照品溶液溶解后摇匀，备用；

④供试品溶液：取艾本那肽前体供试品0.1g，精密加入0.1m的氢氧化钠水溶液5ml溶解后摇匀，备用；

b.gc检测色谱条件

色谱仪：采用agilent7890型气相色谱仪；

色谱柱：采用6%氰丙基-苯基-甲基聚硅氧烷为填充剂的色谱柱；内径为0.53mm，柱长30m，膜厚3μm；

色谱条件：

色谱仪：agilent7890型气相色谱仪；

柱温：40℃；

载气：氮气；

流速：3.0ml/min；

检测器：fid；

进样口温度：150℃；

分流比：25:1；

检测器温度260℃；

顶空条件：顶空平衡温度80℃；

顶空平衡时间：30min；

色谱柱升温程序：40℃保持8min后以20℃/min升温至100℃，保持1min；再以30℃/min升温至180℃后保持2min，最后以30℃/min升至240℃后维持8min。

c.样品检测及结果

照上述方法进行气相检测空白溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液检测，结果见表5。

表5艾本那肽前体检测结果(0.1m的氢氧化钠水溶液)

从表5中可看出，改变样品溶解用溶剂，对三乙胺的检出无显著影响，系统适用性溶液中三乙胺峰面积为61873与对照品溶液中三乙胺峰面积61370非常接近，表示三乙胺回收率良好。供试品中三乙胺未检出。

实施例3：

a.溶液制备

①对照品贮备溶液：取三乙胺约1g至100ml容量瓶中加入0.08m的氢氧化钠水溶液制得浓度为9～11mg/ml的三乙胺对照品贮备溶液，备用；

②对照品溶液：取上述三乙胺对照品储备溶液10ml至100ml容量瓶中加入0.08m的氢氧化钠水溶液，定容，摇匀，制得浓度为0.9～1.1mg/ml的三乙胺对照品溶液，备用；

③系统适用性溶液：取艾本那肽前体0.1g加入5ml三乙胺对照品溶液溶解后摇匀，备用；

④供试品溶液：取艾本那肽前体供试品0.1g，精密加入0.08m的氢氧化钠水溶液5ml溶解后摇匀，备用；

b.gc检测色谱条件

色谱仪：采用agilent7890型气相色谱仪；

色谱柱：采用6%氰丙基-苯基-甲基聚硅氧烷为填充剂的色谱柱；内径为0.53mm，柱长30m，膜厚3μm；

色谱条件：

色谱仪：agilent7890型气相色谱仪；

柱温：40℃；

载气：氮气；

流速：3.5ml/min；

检测器：fid；

进样口温度：150℃；

分流比：25:1；

检测器温度260℃；

顶空条件：顶空平衡温度80℃；

顶空平衡时间：30min；

色谱柱升温程序：40℃保持8min后以20℃/min升温至100℃，保持1min；再以30℃/min升温至180℃后保持2min，最后以30℃/min升至240℃后维持8min。

c.样品检测及结果

照上述方法进行气相检测空白溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液检测，结果见表6。

表6艾本那肽前体检测结果（流速：3.5ml/min）

从表6中可看出，系统适用性溶液中三乙胺与其他杂质的最小分离度为62.15（分离度＞1.5），拖尾因子在0.8～2.0之间，均符合规定。表明适当变动色谱条件不影响艾本那肽前体中三乙胺的检测。