一种红细胞中游离铁含量测定方法与流程

本发明涉及血液金属元素含量测定技术领域，特别涉及一种红细胞中游离铁含量测定方法。

背景技术：

铁元素是人体含量最高的微量元素，几乎分布于全身的各个器官。人体内的铁大部分以血红蛋白的形式存在于血液红细胞中，剩余部分以肌红蛋白、铁蛋白等形式存在。铁在血液中的存在形式包括与血红蛋白结合的血红素铁、与运铁蛋白结合的血清铁等结合铁和游离铁。检测血液中铁的含量对于疾病诊断、掌握机体健康状况等具有重要意义。例如，慢性溶血性贫血患者的血清铁含量高于正常水平；机体在存在恶性肿瘤、肝硬化、阻塞性黄疸等疾病时，血清铁含量则低于正常水平。

铁是组成血红蛋白不可缺少的元素，血红细胞中铁的含量与其携氧能力直接相关。当人体受到环境污染物胁迫等外来刺激时，机体可能会产生一系列反应，导致红细胞中血红蛋白的铁元素被释放出来，从结合态转变成游离态，从而引起红细胞携氧能力下降，危害人体健康。因此，进一步检测血液红细胞中的游离铁含量同样有着重要意义。

目前，关于血红细胞游离铁含量的检测技术鲜有报道，已有检测血液中铁含量的方法主要针对全血或者血清：(1)分光光度法。该方法在血液样品中加入适当的试剂与铁离子络合，将络合态的铁离子与血液样品分离后加入显色剂使用紫外可见分光光度计测定吸光度，再通过标准曲线计算出铁的含量。这种方法虽然较常用，但检测的灵敏度和线性范围较低。(2)火焰原子吸收分光光度法。该方法将血液样品用酸直接消解或者直接灼烧干灰化，配置成一定体积的溶液，通过原子吸收分光光度计测定吸光度并计算得到铁含量。该方法虽然灵敏度较高，但不能很好地分离出血液中的游离铁。此外，薄层色谱法﹑电量滴定和氧化还原滴定法﹑原子发射光谱法等方法也被用于血液铁含量的检测，但也具有检出限﹑灵敏度较差，抗其他金属元素干扰能力弱，专一性不强等缺点。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的缺陷，提供了一种红细胞中游离铁含量测定方法，能有效地解决上述现有技术存在的问题。

为了实现以上发明目的，本发明采取的技术方案如下：

一种红细胞中游离铁含量测定方法

步骤1：标准溶液配制

铁标准储备液配置：准确称取0.8631g硫酸铁铵，加水溶解，加1.00ml硫酸溶液(1+3)，移入100ml容量瓶，加水定容至刻度，混匀。此铁溶液质量浓度为1000mg/l。

铁标准中间液配置：准确吸取铁标准储备液10ml于100ml容量瓶中，加硝酸溶液(5+95)定容至刻度，混匀。此铁溶液质量浓度为100mg/l。

铁标准系列溶液：分别准确吸取铁标准中间液(100mg/l)0ml、0.100ml、0.200ml、0.300ml、0.400ml、0.500ml于100ml容量瓶中，加硝酸溶液(5+95)定容至刻度，混匀。此铁标准系列溶液中铁的质量浓度分别为0mg/l、0.100mg/l、0.200mg/l、0.300mg/l、0.400mg/l、0.500mg/l。

步骤2：样品试液的制备

抽取一定量的血液样品放入预先抗凝的离心管中，加入3ml生理盐水，轻轻震荡后离心力400×g离心五分钟，弃上清液，重复3次；向离心管中加入去离子水至5ml，得到溶血液。相对离心力2000×g，将溶血液离心20分钟，吸取上清液3ml，相同条件下离心20分钟，取上清液2.4ml至超滤管中，相对离心力3500×g离心20分钟。收集1.6ml滤液，加入1.0ml硝酸和0.25ml过氧化氢，置于水浴锅95℃消解3h，去除有机物等其他干扰因素。所用超滤离心管过滤器材质为苯乙烯共聚物/丁二烯，滤膜为ultracel低粘合性再生纤维素膜，滤出液管为聚丙烯，滤出液盖子及衬里为聚乙烯。

步骤3：空白样品的制备

在比色管中加入1.6ml水，加入1.0ml硝酸和0.25ml过氧化氢，置于水浴锅95℃消解3h。

步骤4：测定

在选定的工作参数下，采用火焰原子吸收光谱仪测定标准溶液，绘制出工作曲线；测定空白样品及样品试液的吸光度，扣除空白样品的吸光度以消除试剂干扰，根据工作曲线可计算出样品中游离铁的含量。

作为优选，步骤2中红细胞最佳溶血时间为12h。

作为优选，步骤2中所述超滤管为孔径30kd的超滤管。

作为优选，步骤4选定的工作参数为：波长248.3nm，狭缝0.2nm，灯电流10ma，燃烧头高度3mm，空气流量9l/min，乙炔流量2l/min。

作为优选，所述测定方法重复测定3次以上取平均值以提高准确度。

与现有技术相比本发明的优点在于：提供了一种血液红细胞样品中游离铁的分离检测方法，样品处理过程简单，灵敏度高，线性范围宽，专一性强，满足了科研实验中的需求。

该方法也可用于血清、全血中游离铁的测定。对于血清，取样分离出血清后，直接进行分离步骤即可；对于全血，取样加入去离子水制得溶血液后再进行分离步骤。

附图说明

图1为本发明实施例1样品经不同孔径的超滤管过滤后铁含量的比较；

图2为本发明实施例1dbp(邻苯二甲酸二丁酯)染毒条件下sd大鼠血红细胞游离铁含量的测定结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图并举实施例，对本发明做进一步详细说明。

一种红细胞中游离铁含量测定方法，包括以下步骤：

步骤1：标准溶液配制

铁标准储备液配置：准确称取0.8631g硫酸铁铵，加水溶解，加1.00ml硫酸溶液(1+3)，移入100ml容量瓶，加水定容至刻度，混匀。此铁溶液质量浓度为1000mg/l。

铁标准中间液配置：准确吸取铁标准储备液(1000mg/l)10ml于100ml容量瓶中，加硝酸溶液(5+95)定容至刻度，混匀。此铁溶液质量浓度为100mg/l。

铁标准系列溶液：分别准确吸取铁标准中间液(100mg/l)0ml、0.100ml、0.200ml、0.300ml、0.400ml、0.500ml于100ml容量瓶中，加硝酸溶液(5+95)定容至刻度，混匀。此铁标准系列溶液中铁的质量浓度分别为0mg/l、0.100mg/l、0.200mg/l、0.300mg/l、0.400mg/l、0.500mg/l。

步骤2：样品试液的制备

抽取一定量的血液样品放入预先抗凝的离心管中，加入3ml生理盐水，轻轻震荡后以相对离心力400×g离心五分钟，弃上清液，重复操作3次；向离心管中加入去离子水至5ml，得到溶血液。以相对离心力2000×g，将溶血液离心20分钟，吸取上清液3ml，继续在相同条件下离心20分钟，再取上清液2.4ml，将两次离心得到的上清液移至超滤管中，以相对离心力3500×g离心20分钟。收集1.6ml滤液，加入1.0ml硝酸和0.25ml过氧化氢，置于水浴锅95℃消解3h。

步骤3：空白样品的制备

在比色管中加入1.6ml水，加入1.0ml硝酸和0.25ml过氧化氢，置于水浴锅95℃消解3h。

步骤4：测定

在选定的工作参数下(见表1)，采用火焰原子吸收光谱仪测定标准溶液，绘制出工作曲线；测定空白样品及样品试液的吸光度，扣除空白样品的吸光度以消除试剂干扰，根据工作曲线可计算出样品中游离铁的含量。

表1火焰原子吸收光谱仪的工作参数

本发明涉及操作步骤的关键在于尽量减少超滤离心过程中铁的损失，以便测出合理有效的结果。因此，有必要对操作条件进行优化，保证超滤效果。

最佳溶血时间的确定

在沉积红细胞中加入去离子水，红细胞吸水涨破得到溶血液，用离心机离心后，得到红色透明的上清液和极少量的沉淀物(破碎的细胞膜)。不同溶血时间可能会产生不同的溶血效果，从而影响离心后上清液的澄清程度，进而影响超滤离心的效果。为了避免超滤过程中的铁损失影响测量结果，通过观察溶液性状﹑离心效果和超滤效果确定最佳溶血时间。结果见表2。

表2不同溶血时间后溶血液的离心处理效果

由表2可知，随着溶血时间延长，离心后的沉淀物量不断增多，减轻了超滤时对能通过的上清液量的影响，超滤效果越来越好。但随着溶血时间继续增加，溶血液逐渐变成黑褐色，且上清液变粘稠，通过离心无法将其与沉淀物分开，影响超滤效果。通过分析最终确定红细胞最佳溶血时间为12h。

超滤管孔径的确定

本发明利用超滤离心管截留溶血液中的血红蛋白及其他大分子蛋白，回收过滤液用于测定游离铁的含量。通常超滤管应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3，考虑到血红蛋白的分子量为64kd，我们选取常见的四种超滤管(截留分子量分别为3kd、10kd、30kd和50kd)，对其超滤效果进行比较。在相同条件下处理样品，经过不同超滤管超滤后，用火焰原子吸收光谱仪测量吸光度，根据标准曲线计算得到样品溶液中铁离子的浓度，结果如图1所示。

四种超滤管中，孔径为50kd的超滤管效果最好，但50kd与血红蛋白分子量64kd接近，且滤液带有淡黄色，故不选择此管。孔径为3kd的超滤管过滤性能最低，且很容易堵塞。孔径为10kd和30kd的超滤管过滤效果相差不大，但考虑到铁元素从血红蛋白释放后，有可能和一些小分子蛋白结合，故最终选择孔径为30kd的超滤管。

相对离心力和离心方式的确定

(1)直接使用超滤离心管：将溶血液直接加入到超滤离心管中，并尝试分别用6000×g、8000×g等相对离心力离心十分钟，发现超滤管被堵塞，效果不佳。

(2)通过先使用普通离心管离心再使用超滤离心管离心，降低相对离心力，增加离心时间等措施优化离心步骤，发现采用以下流程时能有效避免超滤管被堵塞，实现较好的离心效果：先采用普通离心管2000×g相对离心力离心20分钟，取上清液；继续采用普通离心管相对离心力2000×g离心20分钟，取上清液；将两次上清液样品加入超滤离心管中，以相对离心力3500×g离心20分钟。

实施例1

研究表明，dbp(邻苯二甲酸二丁酯)能引起血红细胞的铁释放。将本发明方法用于测定dbp引起sd大鼠血液红细胞铁释放的实验中：

取雄性sd大鼠，适应性喂养7天后，按随机数字表法分成2组，包括溶剂对照组(玉米油)、dbp组(2.4g/kg)，每组3只，实验过程中大鼠可自由饮水进食。对各组大鼠进行灌胃染毒，持续时间3h。

染毒结束后，将sd大鼠固定，从尾静脉取得0.5ml全血至预先抗凝的离心管中，加入3ml生理盐水，震荡后以相对离心力400×g离心5分钟，吸去上清液，重复操作三次；加入去离子水定容至5ml得到溶血液。为了保证溶血效果，静置12h后再进行下一步处理。

将溶血液以相对离心力2000×g离心20分钟，然后吸取上清液3ml，继续以相对离心力2000×g离心20分钟，再取上清液2.4ml，将两次离心得到的上清液移至超滤离心管中，以相对离心力3500×g离心20分钟。收集1.6ml滤液，加入1.0ml硝酸和0.25ml过氧化氢，置于水浴锅95℃消解3h。

将消解样品定容至6ml，用火焰原子吸收光谱仪进行测定，扣除空白后根据标准曲线计算得到样品中铁离子的浓度，结果如图2所示。与对照组相比，dbp染毒组测得了非常明显的铁释放(红细胞游离铁含量明显增加)，表明了本方法的可行性和先进性。

本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的实施方法，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。