一种人体尿液中多种有机酸的定量检测方法与流程

本发明涉及生化检测技术领域，尤其涉及一种同步定量检测人体尿液中多种有机酸含量的方法。

背景技术：

有机酸是身体基本代谢过程中产生的一大类化合物。它们来自膳食蛋白质，脂肪和碳水化合物，被身体用于产生细胞能量并提供细胞功能所必需的营养。尿液有机酸测试选择的代谢物，可以作为异常代谢的重要诊断指标。代谢失衡是一种常见且普遍的疾病，可能是许多慢性疾病的基础，例如疲劳，胃肠功能障碍，肌肉/关节问题，情绪障碍和头痛。这些疾病通常对长期治疗和持续改善有抵抗力。有机酸分析传统上可以用于早期检测/排除或监测代谢障碍。尿液样本可用于评估肠道，肝脏和神经系统健康以及能量代谢和营养缺乏。

蛋白质、脂肪和碳水化合物，作为人体主要的食物被用于产生细胞能量并提供细胞功能所必需的营养。但食物中同时也应该包括其它必要的营养素，只有在这些必要营养素的帮助下食物才能转化为能量和营养被人体吸收。当食物代谢时，某些必要营养素的缺乏会导致能量生成和营养吸收的通路受阻，同时产生的有机酸代谢产物就会排入尿液中。因此通过尿液中有机酸的测定可以评估个体能量代谢情况和特定的营养素是否缺乏。对于测量的许多有机酸，尿中异常高的水平通常表明特定的代谢通路被阻碍，该代谢通路所必需的营养素水平较低。尿液有机酸测试有助于理解营养素代谢的执行方式，并确定代谢周期可能存在不平衡的地方。举例说明，b族维生素，特别是b1(硫胺素)，b3(烟酸)和b5(泛酸)，为所有体细胞的能量通路提供必需的辅助因子。当食物被代谢时，在需要维生素b参与的步骤中形成特定化合物。这些步骤发生在碳水化合物代谢中，其中形成丙酮酸和乳酸。这些化合物水平升高的说明这个反应的辅助酶活力低，因此需要增加b族维生素，特别是硫胺素和泛酸。在增加这些必需营养素的摄入后，反应的通路重新被打通，细胞的能量产生效率恢复。几乎身体系统的每个环节都需要酶辅助因子，这些辅助因子如维生素或矿物质的缺乏会广泛影响的身体功能，包括免疫，内分泌，肌肉骨骼和代谢系统。对于测量的许多有机酸，尿中异常高的水平通常表明分解该化合物所需的营养素水平较低。在此基础上，功能性评估特定营养素的需求，创建个性化治疗方案是改善患者症状的最佳选择。

因此，本研究开发一种尿液中多种有机酸代谢产物的定量检测方法。该方法具有检测灵敏度高、重复性好、检测速度快，检测批量大的优点，能高效的对有机酸代谢产物进行精确的定量检测，具有良好的科研和商业应用前景。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种高效液相色谱联用串联质谱技术检测人体尿液中多种有机酸代谢产物的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

步骤1、尿液与内标液混合后通过有机溶剂将目标有机酸萃取纯化，氮气吹干后溶于水中，然后用强阴离子交换柱纯化，有机溶剂洗脱后氮气吹干，溶于水中得到待测样本；

步骤2、将上述待测样本通过液相色谱与质谱联用检测，得到有机酸的种类和含量。

进一步的，上述步骤1中萃取所用的有机溶剂包括乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷和叔丁基甲醚，优选的有机萃取溶剂为乙酸乙酯。更进一步的，所述的有机萃取溶剂为乙酸乙酯。

进一步的，上述步骤1中强阴离子交换柱的洗脱溶剂为甲醇或丙酮(加2％甲酸)。

进一步的，上述步骤2中具体包括以下步骤：

步骤a：称取有机酸标准品，用甲醇溶解，得到不同浓度的标准液；

步骤b:量取上述甲醇定容后的内标液，将其分别加入步骤a得到的标准液中，用超纯水定容后离心，取上清液作为待测标准液；

步骤c：将步骤b得到的待测标准液和步骤1得到的待测样本通过液质联用检测，得到有机酸代谢产物的种类及含量。

进一步的，所述有机酸代谢产物包括乙二酸、辛二酸、乙基丙二酸、乳酸、丙酮酸、β-羟基丁酸、柠檬酸，顺式乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、α-酮异戊酸、α-酮异己酸、α-酮-β-甲基戊酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、羟甲基戊二酸、黄尿酸、β-羟基异戊酸和甲基丙二酸。

采用有机溶剂萃取和强阴离子交换柱纯化处理人体尿液中的上述有机酸代谢产物，利用高效液相色谱将20种有机酸代谢产物分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为x轴，标准品与内标物的峰面积比为y轴，建立校准曲线，计算上述有机酸代谢产物的含量。

进一步的，上述步骤c液质联用检测的液相色谱条件为：

色谱柱为键合相色谱柱，进样量为5-50μl，流动相包括a和b，其中a为水溶液，b为混合溶液，流动相的流速为0.1-2.0ml/min；流动相的梯度(以体积百分比计)：

0-1min,a:30-100％,b:70-0％；

1.1-5min,a:10-60％,b:90-60％；

5.1-9min,a:0-50％,b:100-50％；

9.1-11min,a:50-100％,b:50-0％；

11.1min,a:30-100％,b:70-0％。

更进一步的，上述键合相色谱柱为c18或c8等键合相色谱柱，规格为50-150mm×2.1-4.6mm,1.8-5μm。

更进一步的，液相色谱条件中，流动相a为1-10mmol/l的乙酸铵水溶液+0.1％-1％甲酸的纯水，流动相b为乙腈甲醇的混合溶液，乙腈和甲醇的质量比为9-1:1-9。

进一步的，上述液质联用检测的质谱条件为：esi离子源，负离子mrm扫描，雾化气流速为5-10l/min，气帘气流速为5-20l/min，离子源电压为2000-4500v，离子源温度为200-400℃。

进一步的，在电喷雾负离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，目标物的离子对监测如下：乙二酸(m/z145.2—83.1)、辛二酸(m/z173.2—111.2)、乙基丙二酸(m/z131.1—87.1)、乳酸(m/z89.1—43.1)、丙酮酸(m/z87.1—43.1)、β-羟基丁酸(m/z103.1—59.1)、柠檬酸(m/z191.1—87.1)、顺式乌头酸(m/z173.1—85.1)、异柠檬酸(m/z191.1—73.1)、α-酮戊二酸(m/z145.1—101.1)、α-酮异戊酸(m/z115.1—115.1)、α-酮异己酸(m/z129.2—129.2)、α-酮-β-甲基戊酸(m/z129.2—129.2)、琥珀酸(m/z117.1—73.0)、富马酸(m/z115.1—71.0)、苹果酸(m/z133.1—115.0)、羟甲基戊二酸(m/z117.1—59.0)、黄尿酸(m/z204.2—160.1)、β-羟基异戊酸(m/z117.1—73.1)和甲基丙二酸(m/z117.1—73.1)。内标：d3-甲基丙二酸(m/z120.1—73.1)、d3-乙基丙二酸(m/z134.1—87.1)、d4-柠檬酸(m/z195.1—87.1)。

与已有技术相比，本发明的优势在于以下3点。

1、本发明提供的人体尿液中有机酸代谢产物的检测方法将人体尿液与内标液混合后对混合液依次进行有机溶剂萃取和强阴离子柱纯化后进行液质联用的分析。有机溶剂萃取后通过强阴离子柱纯化可以使目标有机酸代谢产物充分溶出并可以提高检测效率，从而可以真实的反应待测样品中有机酸代谢产物的种类和含量，使得检测结果的准确性、重复性和稳定性大大提高。与其它样本处理方法相比，本检测中杂质干扰大大减小，峰型对称，定量检测结果更加稳定可靠，批间检测误差小，准确率高。

2、本发明提供的人体尿液中有机酸代谢产物的检测方法适用于所有有机酸代谢产物的同步批量检测。这些有机酸代谢产物成分结构复杂，同时进行快速分离鉴定具有很大的技术难度。本发明提供的液相分离及质谱检测的方法不需要对目标产物进行衍生处理，可以高效准确的对所有目标产物进行定性定量分析，满足大批量实验室检测的需要，具有较高的应用价值。

3、本发明提供的人体尿液中有机酸代谢产物的检测方法具有灵敏度高、精确度高、重复性好以及检测速度快的优点，适用于功能性评估特定营养素的需求，在此基础上创建个性化治疗方案是改善患者症状的最佳选择。

附图说明

附图1：三种样本处理方法定量检测比较。a-f6组图中从上至下：①样本经过有机溶剂萃取后未经离子交换柱纯化直接上样；②样本未经有机溶剂萃取，通过离子交换柱纯化后上样；③样本经过有机溶剂萃取并经离子交换柱纯化后上样。经有机溶剂萃取并经离子交换柱纯化后的样本定量检测目标产物的峰型对称，无分叉包谷现象，定量准确。(a：顺乌头酸；b：异柠檬酸和柠檬酸；c：α-酮异戊酸；d：α-酮戊二酸；e：α-酮-β-甲基戊酸和α-酮异已酸；f：己二酸)。

附图2：尿液样本中所有20种有机酸代谢产物定量检测的离子流图。本方法定量准确，基线平稳，批次之间结果误差小，方法稳定性、精准性高。(左列从上到下为：乙二酸、辛二酸、乙基丙二酸、丙酮酸、乳酸、β-羟基丁酸、柠檬酸与异柠檬酸、顺式乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸；右列从上到下为：琥珀酸、富马酸、苹果酸、羟甲基戊二酸、α-酮异戊酸、α-酮异己酸与α-酮-β-甲基戊酸、黄尿酸、β-羟基异戊酸和甲基丙二酸)。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好的理解本发明。本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，但不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例都属于本发明保护的范围。

实施例1。

研究实验的样本来自于四川省华西医院内分泌代谢科2019年1月至2月部分就诊志愿者的尿液样本。

样品处理。

同一尿液样本取3份，各取100μl。分别进行样本处理。其中样本处理分别如下。

①：100μl尿液与内标液混合，加入100μl乙酸乙酯萃取，氮气吹干后溶于水中，0.22μm滤膜过滤后进样。

②：100μl尿液与内标液混合，加入活化后的强阴离子交换柱中，甲醇(2％甲酸)洗脱2次，每次1ml，共计2ml洗脱液，加热60℃的条件下用氮吹仪挥发干，溶于水中，0.22μm滤膜过滤后进样。

③：100μl尿液与内标液混合，加入100μl乙酸乙酯萃取，氮气吹干后溶于水中，加入活化后的强阴离子交换柱中，甲醇(2％甲酸)洗脱2次，每次1ml，共计2ml洗脱液，加热60℃的条件下用氮吹仪挥发干，溶于水中，0.22μm滤膜过滤后进样。

仪器：api4000三重四级杆质谱仪(appliedbiosystem公司)；agilent液相色谱系统(配自动进样器)；十万分之一天平；色谱柱(c18)；氮吹仪；高速台式冷冻离心机；冻干机；固相萃取柱；可调移液器；玻璃仪器、烧杯、量筒等。

试剂耗材：色谱纯甲醇；乙腈；甲酸；乙酸铵；乙酸乙酯；氨水。

标准品：乙二酸、辛二酸、乙基丙二酸、乳酸、丙酮酸、β-羟基丁酸、柠檬酸，顺式乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、α-酮异戊酸、α-酮异己酸、α-酮-β-甲基戊酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、羟甲基戊二酸、黄尿酸、β-羟基异戊酸和甲基丙二酸，内标d3-甲基丙二酸、d3-乙基丙二酸、d4-柠檬酸购于sigma-aldrich。

方法

色谱条件：流动相a：0.5％v/v甲酸+5mm乙酸铵水溶液；流动相b：0.5％v/v甲酸甲醇溶液。色谱柱型号：，采用梯度洗脱方式。流速为0.3ml/min，柱温为45℃，进样量为10μl。

质谱条件：电喷雾电离负离子检测模式，采用多反应监测的扫描模式。喷雾电压为4kv；碰撞气为；离子源雾化气为；加热辅助气为；去溶剂温度为。监测的目标物如下：乙二酸(m/z145.2—83.1)、辛二酸(m/z173.2—111.2)、乙基丙二酸(m/z131.1—87.1)、乳酸(m/z89.1—43.1)、丙酮酸(m/z87.1—43.1)、β-羟基丁酸(m/z103.1—59.1)、柠檬酸(m/z191.1—87.1)、顺式乌头酸(m/z173.1—85.1)、异柠檬酸(m/z191.1—73.1)、α-酮戊二酸(m/z145.1—101.1)、α-酮异戊酸(m/z115.1—115.1)、α-酮异己酸(m/z129.2—129.2)、α-酮-β-甲基戊酸(m/z129.2—129.2)、琥珀酸(m/z117.1—73.0)、富马酸(m/z115.1—71.0)、苹果酸(m/z133.1—115.0)、羟甲基戊二酸(m/z117.1—59.0)、黄尿酸(m/z204.2—160.1)、β-羟基异戊酸(m/z117.1—73.1)和甲基丙二酸(m/z117.1—73.1)。内标：d3-甲基丙二酸(m/z120.1—73.1)、d3-乙基丙二酸(m/z134.1—87.1)、d4-柠檬酸(m/z195.1—87.1)。

分别对各个目标的去簇电压，碰撞电压等条件进行系统优化，以达到最佳的稳定性和灵敏度。

标准品配制：分别准确称取标准品从10mg到400mg，分别置于10ml的容量瓶中，加入甲醇溶液，配制成浓度分别为1-100mg/ml的标准品母液；分别从以上标准品母液中移取10μl加入同一离心管中，再加入甲醇800ml，得到浓度为10-1000μg/ml混合标准品溶液，然后用甲醇将浓度等倍逐级稀释6个梯度；配制成成梯度的混合标准液。

称取内标品，加入完全溶解得到浓度为4mg/ml的内标溶液。然后用甲醇将内标溶液的浓度稀释至100ug/ml，配制得到内标工作溶液。

①样本经过有机溶剂萃取后未经离子交换柱纯化直接上样；②样本未经有机溶剂萃取，通过离子交换柱纯化后上样；③样本经过有机溶剂萃取并经离子交换柱纯化后上样。

数据分析结果表明：①样本虽然经过有机溶剂萃取，由于没有经过离子交换柱纯化，样本中有很多杂质干扰。在目标产物出峰的位置存在杂质峰的影响，造成基线不稳。尤其是含量较低的目标产物峰型不对称，定量分析结果不准确。②样本直接通过离子交换柱的纯化，但未经过有机溶剂萃取，同样存在大量杂质干扰。表现为目标产物峰型分叉或有包谷，造成定量不准确，批次之间检测数据误差大。③样本首先通过有机溶剂萃取提取目标产物，然后经过离子交换柱纯化浓缩，排除尿液中的大量干扰物质。参见附图1。目标产物的峰型对称，无分叉包谷现象，定量准确，批次之间结果误差小，方法稳定性、精准性高。

实施例2。

方法学研究实验的样本来自于四川省华西医院内分泌代谢科2019年1月至2月部分就诊志愿者的尿液样本。

样品处理。

100μl尿液中加入100μl乙酸乙酯萃取，氮气吹干后溶于水中，然后与内标液混合，加入活化后的强阴离子柱中，甲醇(2％甲酸)洗脱2次，每次1ml，共计2ml洗脱液，加热60℃的条件下用氮吹仪挥发干，溶于水中，0.22μm滤膜过滤后进样。

本实施例中试剂和仪器设备同实施例1。

本实施例中色谱条件和质谱检测条件同实施例1。

方法验证。

①专属性。

取0.5ml空白基质2份，分2组处理：

1.保留空白；

2.加入10μl含有20个有机酸标准品的混标工作液(10-1000ug/ml),以及10μl内标溶液(100ug/ml)

2组样品涡旋混匀10s，放置30min。之后进行萃取和过柱纯化。滤膜过滤后进样分析。

比较两组色谱图，分析尿液中内源性物质对被测化合物和内标的干扰。

专属性验证结果表明在标准品出峰位置，空白基质样品均未出现明显干扰峰。20种有机酸的标准品和尿液样品的峰型对称，在低浓度时基本没有杂峰干扰。

②基质标准曲线。

取系列浓度基质标准曲线样品，从低浓度到高浓度连续进样，每个浓度2次进样进行分析。以被测物em浓度为横坐标，被测物与内标物峰面积比值为纵坐标，采用线性回归，得到回归方程和相关系数。

校准曲线：采用内标定量法，利用软件以标准品与内标物的浓度比为x轴，标准品与内标物峰面积比为y轴，建立校准曲线，计算唾液中待测物的浓度。各个目标产物在各自的浓度范围内的线性拟合方程线性良好，拟合系数大于0.99，满足定量的要求。见下表。

③最低定量限。

取空白基质0.5ml，加入一定量混标工作液(0.125-25ug/ml)和内标工作液各10μl，进行样本前处理。进样进行分析，同一浓度平行处理6份。代入基质标准曲线，计算浓度的精密度小于25％，回收率在100±30％之间时，该浓度为最低定量限。某一浓度的信噪比大于3，定为最低检出限。实验结果显示，回收率在81％-119％之间，精密度在8％-15％之间，各有机酸最低定量限同上表中线性范围最低范围。

④基质效应。

分2组处理样品：

1.取甲醇0.5ml，按照质控样品的3个浓度，高中低分别加入混标工作液和内标工作液各10μl，进行样本前处理。进样进行分析；

2.取空白基质0.5ml，按照质控样品的3个浓度，高中低分别加入混标工作液和内标工作液各10μl，进行样本前处理。进样进行分析。每个浓度选取3份不同来源空白基质。

计算：将第2组得到的标准品峰面积分别除以第1组所得的相应标准品峰面积(×100％)，即得各标准品的基质效应。要求基质效应在85％-115％，且基质加标和甲醇溶液加标均应满足rsd＜20％。

实验结果表明，20个有机酸的基质效应范围为86％-112％，能够满足方法验证要求。

⑤准确度和精密度。

选质控高中低和lloq浓度进行准确度和精密度考察。样品采用空白基质配制。同一天每一样品连续分析6次，测定准确度和日内精密度。

每日重新配制4个浓度样品，每日连续进样2次，连续3天测定，分析日间精密度。标曲需同时进行测定。

精密度的rsd＜15％，准确度在100±25％范围内。lloq的准确度放宽到±30％，rsd≤20％。

实验结果表明，20个有机酸的准确度在80％-121％之间，批内精密度在5％-12％之间，日间精密度在10％-15％之间。最低定量限准确度在79％-121％之间，批内精密度在9％-13％之间，日间精密度＜20％。

稳定性。

①日内稳定性。

4℃放置24小时稳定性。

高中低浓度质控样品，前处理后，4℃下放置24小时，0、4、8、24小时分别进样测定，每样每次测定2针。计算测得浓度的回收率和rsd值。

放置时间应超过单个批次样品分析所需时间；要求rsd＜15％，准确度在100±15％范围内。

实验结果表明，被测的20种有机酸4℃放置24小时是稳定的。4次测定的准确度范围为85％-111％，rsd在10％-14％之间。

样品稳定性试验。

尿液样本室温和4℃放置下的稳定性测试。

取尿液样本，分别于室温和4℃条件下放置0、24和72小时后按本发明所述方法分别测定所有20种有机酸的含量。要求与0点测定值相比，准确度在100±25％范围内，认为该时间点靶标物稳定。

结果显示样本放置于室温和4℃下24小时，20个有机酸均保持稳定。而当在室温和4℃下放置72小时后，部分有机酸如乙二酸、柠檬酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、α-酮异戊酸、α-酮异己酸、α-酮-β-甲基戊酸不能满足合格条件，表明室温和4℃放置超过72小时待测物不能保持稳定。

尿液样本冷冻条件下的稳定性测试。

取尿液样本，分别于冷冻条件下(-20℃)放置0、3、7、14、30、60、90天后，按本发明所述方法测定所有20种有机酸的含量。要求与0点测定值相比，准确度在100±25％范围内，认为该时间点靶标物稳定。

结果显示样本放置于-20℃下60天内，20个有机酸均保持稳定。而当在-20℃下放置90天后，部分有机酸如乙二酸、柠檬酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、α-酮异戊酸、α-酮异己酸、α-酮-β-甲基戊酸、黄尿酸、丙酮酸、琥珀酸、富马酸等不能满足合格条件，表明-20℃放置超过90天待测物不能保持稳定。

实施例3。

实验的样本来自于四川省华西医院内分泌代谢科2019年1月至2月部分就诊志愿者的尿液样本。

本实施例中样本处理同实施例2。

本实施例中试剂和仪器设备同实施例1。

本实施例中色谱条件和质谱检测条件同实施例1。

尿液样品检测20种有机酸离子流图，见附图2。

测定结果及数据统计：