一种颈舒颗粒的质量检测方法与流程
本发明涉及医药发明领域，具体涉及一种颈舒颗粒的质量检测方法。
背景技术：
颈舒颗粒是一种经典的中药成方制剂，收录于《中华人民共和国药典(2015版)一部》中，其由三七、当归、川芎、红花、天麻、肉桂、人工牛黄组成，具有明确的治疗神经根型颈椎病的作用。
近年来，随着颈椎病的增多，颈舒颗粒的功效已广泛被患者熟知并使用，尽管临床应用广泛，但一直以来对其有效成分缺乏系统研究，其质量缺乏有效的控制标准，阻碍了颈舒颗粒的深入开发利用。
国药集团精方(安徽)药业股份有限公司为解决颈舒颗粒有效控制标准的问题，在根据《中华人民共和国药典(2015版)一部》中所述颈舒颗粒的现有含量测定方法的基础上进行大量的研究，以三七和人工牛黄为检测指标，照高效液相色谱法(通则0512)测定。
三七：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以水为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为203nm。理论板数按人参皂苷rg1峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备：取人参皂苷rg1对照品及人参皂苷rb1对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含0.1mg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备：取装量差异项下的本品，混匀，取适量，研细，取约0.5g，精密称定，加乙醚20ml，摇匀，放置12小时，滤过，弃去滤液，滤纸及滤渣挥去乙醚，精密加入甲醇10ml，称定重量，超声处理(功率250w，频率50khz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品每袋含三七以人参皂苷rg1(c42h72o14)和人参皂苷rb1(c54h92o23)的总量计，不得少于15.0mg。
人工牛黄：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈～0.2％磷酸溶液(35：65)为流动相；检测波长为192nm。理论板数按胆酸峰计算应不低于2000。
对照品溶液的制备：取胆酸对照品适量，精密称定，加60％乙腈制成每1ml含0.3mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取装量差异项下的本品，混匀，取适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10ml，超声处理(功率250w，频率50khz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品每袋含人工牛黄以胆酸(c24h40o5)计，不得少于40.0mg。
现有方法仅包含了对三七、人工牛黄的检测，并未涉及天麻、肉桂等另外5种药材，也未完全覆盖三七的3种活性化学成分，即三七皂苷r1、人参皂苷rg1和人参皂苷rb1。因此，国药集团精方(安徽)药业股份有限公司建立了一种新的含量测定方法来更加科学合理地对颈舒颗粒进行检测和质控。
技术实现要素：
本发明的目的是为了建立一种颈舒颗粒的质量检测方法。
所述颈舒颗粒由三七、当归、川芎、红花、天麻、肉桂、人工牛黄组成，含量测定采用一次检测颈舒颗粒中7种化学成分的方法。
所述颈舒颗粒含量测定法包括：对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、色谱条件与系统适用性试验条件设定、测定。
所述对照品溶液的制备步骤：1)对照品贮备液的配制：分别精密称定天麻素、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、肉桂酸、桂皮醛、胆酸对照品适量，以适量甲醇溶解，用70％～90％甲醇水稀释至刻度，配制三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、胆酸对照品的贮备液浓度均为10mg/ml，天麻素、肉桂酸、桂皮醛对照品的贮备液浓度均为4mg/ml，即得；2)对照品系列溶液的配制：制备不同浓度的对照品混合溶液以绘制标准曲线，分别精密移取天麻素、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、肉桂酸、桂皮醛对照品贮备液各100μl，再精密移取胆酸对照品贮备液400μl，混匀，得到高浓度的混合对照品溶液；取该溶液按照一定的浓度倍数依次稀释，稀释剂为70％～90％甲醇水，最终得到7个混合对照品溶液；同样的方法以各对照品贮备液稀释制备出3个低、中、高不同浓度的质控样品，混匀，即得。各物质在标准曲线样品和质控样品中的浓度见表1。
表1各物质在标准曲线样品和质控样品中的浓度(μg/ml)
优选的，所述对照品溶液的制备步骤：1)对照品贮备液的配制：分别精密称定天麻素、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、肉桂酸、桂皮醛、胆酸对照品适量，以适量甲醇溶解，用75％～85％甲醇水稀释至刻度，配制三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、胆酸对照品的贮备液浓度均为10mg/ml，天麻素、肉桂酸、桂皮醛对照品的贮备液浓度均为4mg/ml，即得；2)对照品系列溶液的配制：制备不同浓度的对照品混合溶液以绘制标准曲线，分别精密移取天麻素、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、肉桂酸、桂皮醛对照品贮备液各100μl，再精密移取胆酸对照品贮备液400μl，混匀，得到高浓度的混合对照品溶液；取该溶液按照一定的浓度倍数依次稀释，稀释剂为75％～85％(v:v)甲醇水，最终得到7个混合对照品溶液；同样的方法以各对照品贮备液稀释制备出3个低、中、高不同浓度的质控样品，混匀，即得。各物质在标准曲线样品和质控样品中的浓度同表1。
进一步优选的，所述对照品溶液的制备步骤：1)对照品贮备液的配制：分别精密称定天麻素、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、肉桂酸、桂皮醛、胆酸对照品适量，以适量甲醇溶解，用80％甲醇水稀释至刻度，配制三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、胆酸对照品的贮备液浓度均为10mg/ml，天麻素、肉桂酸、桂皮醛对照品的贮备液浓度均为4mg/ml，即得；2)对照品系列溶液的配制：制备不同浓度的对照品混合溶液以绘制标准曲线，分别精密移取天麻素、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、肉桂酸、桂皮醛对照品贮备液各100μl，再精密移取胆酸对照品贮备液400μl，混匀，得到高浓度的混合对照品溶液；取该溶液按照一定的浓度倍数依次稀释，稀释剂为80％(v:v)甲醇水，最终得到7个混合对照品溶液；同样的方法以各对照品贮备液稀释制备出3个低、中、高不同浓度的质控样品，混匀，即得。各物质在标准曲线样品和质控样品中的浓度同表1。
所述供试品溶液的制备步骤：取颈舒颗粒适量，研磨成细粉，粉末过60目筛，精密称取过筛后的粉末3～8g，置于锥形瓶中，加入20～40ml的甲醇，称定重量，以功率250w、频率50khz超声20～40min后放冷至室温，用甲醇补足重量，13000r/min离心5～10min，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
优选的，所述供试品溶液的制备步骤：取颈舒颗粒适量，研磨成细粉，粉末过60目筛，精密称取过筛后的粉末4～7g，置于锥形瓶中，加入25～35ml的甲醇，称定重量，以功率250w，频率50khz超声25～35min后放冷至室温，用甲醇补足重量，13000r/min离心6～9min，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
进一步优选的，所述供试品溶液的制备步骤：取颈舒颗粒适量，研磨成细粉，粉末过60目筛，精密称取过筛后的粉末6g，置于锥形瓶中，加入30ml的甲醇，称定重量，以功率250w，频率50khz超声30min后放冷至室温，用甲醇补足重量，13000r/min离心8min，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
所述色谱条件与系统适用性试验条件为：使用
所述流动相按照梯度洗脱梯度为：
优选的，所述色谱条件与系统适用性试验条件为：使用
所述流动相按照梯度洗脱梯度为：
进一步优选的，所述色谱条件与系统适用性试验条件为：使用
所述流动相按照梯度洗脱梯度为：
所述含量测定方法包括以下步骤：
1)对照品溶液的制备方法；2)供试品溶液的制备方法：3)色谱条件与系统适用性试验：使用
4)测定法：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本发明具有以下优点：
1、按本发明检测方法学验证:本发明含量采用一次检测颈舒颗粒中天麻素、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、肉桂酸、桂皮醛和胆酸共7种化学成分，克服了现有技术未对成分检测的全覆盖性、且操作繁杂的技术问题，进一步提高了检测效率及良好的控制了产品的质量。
2、本方法通过紫外检测器扫描，该方法在相应浓度范围内线性良好，平均加样回收率在101.33％～103.09％，rsd值均小于5.0％。
3、本发明具有操作简便、分析快速、结果准确、分离效果好、高灵敏度的优点。
4、本发明检测天麻素、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、肉桂酸、桂皮醛、胆酸的峰面积的rsd分别为2.38％、1.76％、2.85％、2.36％、1.49％、1.13％和1.66％，表明供试品溶液在24h内稳定。
附图说明：
图1:颈舒颗粒溶液中肉桂酸实测样品图
图2：sd大鼠给药后血浆中肉桂酸实测样品图
图3：lc-ms/ms法测定大鼠血浆中肉桂酸标准曲线图
图4：193nm吸收波长下的空白溶剂的hplc图
图5：193nmstd6混合对照品溶液的hplc图(1.天麻素2.三七皂苷r13.人参皂苷rg14.人参皂苷rb15.胆酸)
图6：193nm颈舒颗粒的hplc图(1.天麻素2.三七皂苷r13.人参皂苷rg14.人参皂苷rb15.胆酸)
图7：260nm吸收波长下的空白溶剂的hplc图
图8：260nmstd6混合对照品溶液的hplc图(1.肉桂酸2.桂皮醛)
图9：260nm颈舒颗粒的hplc图(1.肉桂酸2.桂皮醛)
具体实施方式：
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本实施例所用的原料和设备均为本技术领域常规市购的原料和设备。
以下各实施例中涉及的仪器以及试剂包括但不限于：
设备：ultimate3000液相色谱系统(包括四元泵、自动进样器、dad检测器，美国戴安公司)；电子天平(cp225d，德国赛多利斯公司)；超声波清洗机(220v/50hz，上海三友超音设备有限公司)；离心机(heraeusfresco21小型高速冷冻离心机，美国赛默飞世尔科技公司)。
试剂：甲酸(批号：l1609048，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，色谱纯)，甲醇、乙腈均为色谱纯，水为超纯水。
对照品：肉桂酸(批号：110786～200503)、胆酸(批号：100078～201415)购自中国食品药品检定研究院；天麻素(批号：b1723054)、三七皂苷r1(批号：c1601043)、人参皂苷rb1(批号：e1731014)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；桂皮醛(批号：2136)购自上海诗丹德生物技术有限公司；人参皂苷rg1(批号：dst170223～009)购自成都德思特生物技术有限公司。
供试品：颈舒颗粒(批号：160101、170924、170925、171010，国药集团精方(安徽)药业股份有限公司)
实施例1
对照品溶液的制备：1)对照品贮备液的制备：分别精密称定天麻素、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、肉桂酸、桂皮醛、胆酸对照品适量，以适量甲醇溶解，用70％甲醇水稀释至刻度，配制三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、胆酸对照品的贮备液浓度均为10mg/ml，天麻素、肉桂酸、桂皮醛对照品的贮备液浓度均为4mg/ml，即得；2)对照品系列溶液的配制：制备不同浓度的对照品混合溶液以绘制标准曲线，分别精密移取天麻素、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、肉桂酸、桂皮醛对照品贮备液各100μl，再精密移取胆酸对照品贮备液400μl，混匀，得到高浓度的混合对照品溶液；取该溶液按照一定的浓度倍数依次稀释，稀释剂为70％甲醇水，最终得到7个混合对照品溶液；同样的方法以各对照品贮备液稀释制备出3个低、中、高不同浓度的质控样品。各物质在标准曲线样品和质控样品中的浓度同表1。
供试品溶液的制备：取颈舒颗粒适量，研磨成细粉，粉末过60目筛，精密称取过筛后的粉末3g，置于锥形瓶中，加入20ml的甲醇，称定重量，以功率250w、频率50khz超声20min后放冷至室温，用甲醇补足重量，13000r/min离心5min，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
色谱条件与系统适用性试验条件为：使用
流动相按照梯度洗脱梯度为：
测定法：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例2
对照品溶液的制备：1)对照品贮备液的制备：分别精密称定天麻素、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、肉桂酸、桂皮醛、胆酸对照品适量，以适量甲醇溶解，用80％甲醇水稀释至刻度，配制三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、胆酸对照品的贮备液浓度均为10mg/ml，天麻素、肉桂酸、桂皮醛对照品的贮备液浓度均为4mg/ml，即得；2)对照品系列溶液的配制：制备不同浓度的对照品混合溶液以绘制标准曲线，分别精密移取天麻素、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、肉桂酸、桂皮醛对照品贮备液各100μl，再精密移取胆酸对照品贮备液400μl，混匀，得到高浓度的混合对照品溶液；取该溶液按照一定的浓度倍数依次稀释，稀释剂为80％甲醇水，最终得到7个混合对照品溶液；同样的方法以各对照品贮备液稀释制备出3个低、中、高不同浓度的质控样品，各物质在标准曲线样品和质控样品中的浓度同表1。
供试品溶液的制备：取颈舒颗粒适量，研磨成细粉，粉末过60目筛，精密称取过筛后的粉末5g，置于锥形瓶中，加入30ml的甲醇，称定重量，以功率250w、频率50khz超声30min后放冷至室温，用甲醇补足重量，13000r/min离心8min，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
色谱条件与系统适用性试验条件为：使用
流动相按照梯度洗脱梯度为：
测定法：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例3
对照品溶液的制备：1)对照品贮备液的制备：分别精密称定天麻素、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、肉桂酸、桂皮醛、胆酸对照品适量，以适量甲醇溶解，用75％甲醇水稀释至刻度，配制三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、胆酸对照品的贮备液浓度均为10mg/ml，天麻素、肉桂酸、桂皮醛对照品的贮备液浓度均为4mg/ml，即得；2)对照品系列溶液的配制：制备不同浓度的对照品混合溶液以绘制标准曲线，分别精密移取天麻素、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、肉桂酸、桂皮醛对照品贮备液各100μl，再精密移取胆酸对照品贮备液400μl，混匀，得到高浓度的混合对照品溶液；取该溶液按照一定的浓度倍数依次稀释，稀释剂为75％甲醇水，最终得到7个混合对照品溶液；同样的方法以各对照品贮备液稀释制备出3个低、中、高不同浓度的质控样品，各物质在标准曲线样品和质控样品中的浓度同表1。
供试品溶液的制备：取颈舒颗粒适量，研磨成细粉，粉末过60目筛，精密称取过筛后的粉末4g，置于锥形瓶中，加入25ml的甲醇，称定重量，以功率250w、频率50khz超声25min后放冷至室温，用甲醇补足重量，13000r/min离心6min，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
色谱条件与系统适用性试验条件为：使用
流动相按照梯度洗脱梯度为：
测定法：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例4
对照品溶液的制备：1)对照品贮备液的制备：分别精密称定天麻素、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、肉桂酸、桂皮醛、胆酸对照品适量，以适量甲醇溶解，用78％甲醇水稀释至刻度，配制三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、胆酸对照品的贮备液浓度均为10mg/ml，天麻素、肉桂酸、桂皮醛对照品的贮备液浓度均为4mg/ml，即得；2)对照品系列溶液的配制：制备不同浓度的对照品混合溶液以绘制标准曲线，分别精密移取天麻素、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、肉桂酸、桂皮醛对照品贮备液各100μl，再精密移取胆酸对照品贮备液400μl，混匀，得到高浓度的混合对照品溶液；取该溶液按照一定的浓度倍数依次稀释，稀释剂为78％甲醇水，最终得到7个混合对照品溶液；同样的方法以各对照品贮备液稀释制备出3个低、中、高不同浓度的质控样品，各物质在标准曲线样品和质控样品中的浓度同表1。
供试品溶液的制备：取颈舒颗粒适量，研磨成细粉，粉末过60目筛，精密称取过筛后的粉末7g，置于锥形瓶中，加入35ml的甲醇，称定重量，以功率250w、频率50khz超声35min后放冷至室温，用甲醇补足重量，13000r/min离心9min，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
色谱条件与系统适用性试验条件为：使用
流动相按照梯度洗脱梯度为：
测定法：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例5
对照品溶液的制备：1)对照品贮备液的制备：分别精密称定天麻素、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、肉桂酸、桂皮醛、胆酸对照品适量，以适量甲醇溶解，用83％甲醇水稀释至刻度，配制三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、胆酸对照品的贮备液浓度均为10mg/ml，天麻素、肉桂酸、桂皮醛对照品的贮备液浓度均为4mg/ml，即得；2)对照品系列溶液的配制：制备不同浓度的对照品混合溶液以绘制标准曲线，分别精密移取天麻素、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、肉桂酸、桂皮醛对照品贮备液各100μl，再精密移取胆酸对照品贮备液400μl，混匀，得到高浓度的混合对照品溶液；取该溶液按照一定的浓度倍数依次稀释，稀释剂为82％甲醇水，最终得到7个混合对照品溶液；同样的方法以各对照品贮备液稀释制备出3个低、中、高不同浓度的质控样品，各物质在标准曲线样品和质控样品中的浓度同表1。
供试品溶液的制备：取颈舒颗粒适量，研磨成细粉，粉末过60目筛，精密称取过筛后的粉末7g，置于锥形瓶中，加入37ml的甲醇，称定重量，以功率250w、频率50khz超声37min后放冷至室温，用甲醇补足重量，13000r/min离心9min，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
色谱条件与系统适用性试验条件为：使用
流动相按照梯度洗脱梯度为：
测定法：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例6
对照品溶液的制备：1)对照品贮备液的制备：分别精密称定天麻素、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、肉桂酸、桂皮醛、胆酸对照品适量，以适量甲醇溶解，用85％甲醇水稀释至刻度，配制三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、胆酸对照品的贮备液浓度均为10mg/ml，天麻素、肉桂酸、桂皮醛对照品的贮备液浓度均为4mg/ml，即得；2)对照品系列溶液的配制：制备不同浓度的对照品混合溶液以绘制标准曲线，分别精密移取天麻素、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、肉桂酸、桂皮醛对照品贮备液各100μl，再精密移取胆酸对照品贮备液400μl，混匀，得到高浓度的混合对照品溶液；取该溶液按照一定的浓度倍数依次稀释，稀释剂为90％甲醇水，最终得到7个混合对照品溶液；同样的方法以各对照品贮备液稀释制备出3个低、中、高不同浓度的质控样品，各物质在标准曲线样品和质控样品中的浓度同表1。
供试品溶液的制备：取颈舒颗粒适量，研磨成细粉，粉末过60目筛，精密称取过筛后的粉末7g，置于锥形瓶中，加入38ml的甲醇，称定重量，以功率250w、频率50khz超声38min后放冷至室温，用甲醇补足重量，13000r/min离心9min，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
色谱条件与系统适用性试验条件为：使用
流动相按照梯度洗脱梯度为：
测定法：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例7
对照品溶液的制备：1)对照品贮备液的制备：分别精密称定天麻素、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、肉桂酸、桂皮醛、胆酸对照品适量，以适量甲醇溶解，用88％甲醇水稀释至刻度，配制三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、胆酸对照品的贮备液浓度均为10mg/ml，天麻素、肉桂酸、桂皮醛对照品的贮备液浓度均为4mg/ml，即得；2)对照品系列溶液的配制：制备不同浓度的对照品混合溶液以绘制标准曲线，分别精密移取天麻素、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、肉桂酸、桂皮醛对照品贮备液各100μl，再精密移取胆酸对照品贮备液400μl，混匀，得到高浓度的混合对照品溶液；取该溶液按照一定的浓度倍数依次稀释，稀释剂为88％甲醇水，最终得到7个混合对照品溶液；同样的方法以各对照品贮备液稀释制备出3个低、中、高不同浓度的质控样品，各物质在标准曲线样品和质控样品中的浓度同表1。
供试品溶液的制备：取颈舒颗粒适量，研磨成细粉，粉末过60目筛，精密称取过筛后的粉末8g，置于锥形瓶中，加入39ml的甲醇，称定重量，以功率250w、频率50khz超声39min后放冷至室温，用甲醇补足重量，13000r/min离心10min，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
色谱条件与系统适用性试验条件为：使用
流动相按照梯度洗脱梯度为：
测定法：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例8
对照品溶液的制备：1)对照品贮备液的制备：分别精密称定天麻素、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、肉桂酸、桂皮醛、胆酸对照品适量，以适量甲醇溶解，用90％甲醇水稀释至刻度，配制三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、胆酸对照品的贮备液浓度均为10mg/ml，天麻素、肉桂酸、桂皮醛对照品的贮备液浓度均为4mg/ml，即得；2)对照品系列溶液的配制：制备不同浓度的对照品混合溶液以绘制标准曲线，分别精密移取天麻素、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、肉桂酸、桂皮醛对照品贮备液各100μl，再精密移取胆酸对照品贮备液400μl，混匀，得到高浓度的混合对照品溶液；取该溶液按照一定的浓度倍数依次稀释，稀释剂为90％甲醇水，最终得到7个混合对照品溶液；同样的方法以各对照品贮备液稀释制备出3个低、中、高不同浓度的质控样品，各物质在标准曲线样品和质控样品中的浓度同表1。
供试品溶液的制备：取颈舒颗粒适量，研磨成细粉，粉末过60目筛，精密称取过筛后的粉末8g，置于锥形瓶中，加入40ml的甲醇，称定重量，以功率250w、频率50khz超声40min后放冷至室温，用甲醇补足重量，13000r/min离心10min，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
色谱条件与系统适用性试验条件为：使用
流动相按照梯度洗脱梯度为：
测定法：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实验例1：预实验：
为检验实验设计的科学性和可行性，发明人通过了预实验，为进一步的实验摸索条件。
1、实验材料
1.1仪器：超高效液相色谱-质谱联用系统(包含在线脱气机，超高压梯度泵，柱温箱，自动进样器，watersi-classuplc液相系统，xevotq-s质谱，unifi工作站)由美国沃特世公司生产；离心机(heraeusfresco21小型高速冷冻离心机)由美国赛默飞世尔科技公司生产；涡旋仪(eppendorfmixmate)由德国艾本德有限公司生产；电子天平(cp225d)由德国赛多利斯公司生产。
1.2试剂和药品：
肉桂酸(生产批号：110786-200503)购自中国食品药品检定研究院；
甲酸由日本东京株式会社生产，生产批号：vjpto-rk；
甲醇(生产批号：10934007806)为质谱纯，购自德国默克公司；
乙酸乙酯(生产批号：20180122)购自国药集团化学试剂有限公司；
盐酸(生产批号：20141229)购自国药集团化学试剂有限公司；
纯净水为市售屈臣氏蒸馏水；
大鼠空白血浆由实验室提供。
颈舒颗粒由国药集团精方(安徽)药业股份有限公司生产，生产批号：160106，规格：6g/袋。
1.3实验动物：sd大鼠6只，雌雄各半，体质量200～300g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。实验动物生产许可证号：scxk(沪)2017-0005；动物使用许可证号：syxk(沪)2014-0018。在恒温净化通风动物房饲养，自由进食与饮水，室温(25±2)℃，相对湿度50％～70％。
2、实验方法
2.1给药方法及样品采集：6只sd大鼠采取经口灌胃给药(600mg/kg)，分别于给药后5、10、15、30和45min，以及1、1.5、2、4、6、8和10h眼眶采血约100μl，用1％的肝素抗凝，低温(4℃)离心(8000r/min，8min)，取50μl上清液于对应离心管中，置于-80℃冰箱保存待测。
2.2对照品溶液配制
2.2.1对照品贮备液的配制：分别精密称定肉桂酸对照品适量，以适量甲醇溶解，80％(v∶v)甲醇稀释，配制对照品的贮备液浓度为1mg/ml。
2.2.2对照品系列溶液的配制：制备不同浓度的对照品溶液以绘制标准曲线。精密移取肉桂酸对照品贮备液10μl，用80％甲醇，定量至1ml，混匀后得到10μg/ml对照品溶液；取该溶液按照一定的浓度倍数依次稀释，稀释剂为80％甲醇，最终得到7个对照品工作溶液，浓度依次为100、200、500、1000、2000、5000和10000ng/ml(分别为标准1、2、3、4、5、6及7)。同样的方法以对照品贮备液稀释制备出3个高、中、低不同浓度的质控样品，稀释剂为80％甲醇，高(h)、中(m)、低(l)质控样品浓度依次为8000、1500、150ng/ml，最低定量限(lloq)样品浓度为100ng/ml。
2.3样品制备
2.3.1标准曲线样品和质控样品的制备：取对照品工作溶液5μl、内标溶液5μl、大鼠空白血浆50μl于1.5ml离心管中混匀，加入1mmol/l盐酸15μl，混匀后加入250μl乙酸乙酯，震荡3min。离心(13000r/min，8min)，取上清液，40℃下氮气吹干。用80％甲醇50μl复溶，超声5min，离心(13000r/min，5min)，取上清置于进样瓶内进行uplc-ms/ms分析。质控样品的制备方法与标准曲线样品制备方法相同。
2.3.2大鼠血浆样品处理方法：取给药后大鼠血浆50μl于1.5ml离心管中混匀，加入1mmol/l盐酸15μl，混匀后加入250μl乙酸乙酯，震荡3min。离心(13000r/min，8min)，取上清液，40℃下氮气吹干。用50μl80％甲醇复溶，超声5min，离心(13000r/min，5min)，取上清液置于进样瓶内进行uplc-ms/ms分析。
3、方法学验证
3.1色谱条件：分析柱为acquityuplcbehc18(1.7μm2.1×100mm)；流动相为甲醇-0.1％甲酸水，梯度洗脱；流速为0.2ml/min；进样量为5μl；柱温为35℃。流动相梯度见表2。
表2流动相梯度方法
3.2质谱条件：离子源为电喷雾离子化源(esi)；源温度为120℃，雾化气体温度为500℃；毛细管电压为3.2kv；检测方式为正离子检测；扫描方式为选择反应监测(mrm)。
3.3专属性：取6份不同来源的sd大鼠空白血浆，每份空白血浆做2个重复(不加分析物和内标)。另采集空白血浆后添加肉桂酸标曲工作液，按2.3.1方法处理，分别采用3.1和3.2进行uplc-ms/ms分析。
3.4线性：取2.3.1制备的标准曲线样品，分别采用3.1和3.2项下条件进行uplc-ms/ms分析，用峰面积内标法定量检测。
3.5精密度和准确度：按2.3.1方法配制定量下限、低、中及高4个浓度(分别为10、15、150和800ng/ml)的大鼠血浆质控样品各5份，分别采用3.1和3.2项下条件进行uplc-ms/ms分析。连续测定3个分析批。
3.6稳定性：考察肉桂酸在血浆样品处理前放置4h稳定性、冻融循环3次稳定性(-80℃)、进样器放置24h稳定性。按照样品制备项标准曲线样品和质控样品的制备方法配制低、高两个浓度(15、800ng/ml)的大鼠血浆质控样品均平行制备5份，按照上述三种不同的条件处理样品。
3.7基质效应和提取回收率：按照样品制备项标准曲线样品和质控样品的制备方法项下方法配制低、高两个浓度(15、800ng/ml)的大鼠血浆质控样品，平行制备6份，作为基质样品。
取对照品工作溶液5μl、内标溶液5μl、80％甲醇50μl混匀后，作为无基质样品进行uplc-ms/ms分析。低、高两个浓度(15、800ng/ml)样品均平行制备6份。
取大鼠空白血浆50μl于1.5ml离心管中混匀，按样品制备项下大鼠血浆样品处理方法操作取上清液置于进样瓶内进行uplc-ms/ms分析，作为提取基质样品。低、高两个浓度(15、800ng/ml)样品均平行制备6份。
3.8数据处理
采用das2.0软件的非房室模型计算大鼠给药后的药代动力学参数。达峰浓度(cmax)及达峰时间(tmax)均采用实测值；药时曲线下面积(auc)值采用梯形法计算：auc0-∞＝auc0-t+ct/ke，其中ct为最后一个可测得时间点的血药浓度，ke为消除速率常数；消除半衰期(t1/2)＝0.693/ke；平均滞留时间(mrt)＝药动学参数(aumc)/auc；清除率(cl)＝x0/auc0-∞(x0为给药剂量)；分布容积vz＝cl/ke。采用excel软件计算各样品血药浓度的平均值、标准差、精密度及准确度。
4、结果
4.1专属性
颈舒颗粒中肉桂酸的色谱图见图1。给药后大鼠血浆中肉桂酸的色谱图见图2。实验结果可见，大鼠血浆中的内源性物质均不干扰肉桂酸的测定。
4.2线性
以肉桂酸的峰面积对相应的浓度(c，x)进行加权线性回归，得到肉桂酸在大鼠血浆中的标准曲线，见图3。r2＞0.99，肉桂酸在10～1000ng/ml浓度范围内线性关系良好。
4.3精密度和准确度
根据每批随行标准曲线，计算血浆样品的测定浓度，根据测定结果计算批次内、批次间精密度和准确度。肉桂酸的精密度和准确度结果见表3。
表3颈舒颗粒中肉桂酸的批次内、批次间精密度和准确度
4.4稳定性
根据当日随行的标准曲线计算样品浓度，考察肉桂酸在血浆样品处理前放置4h稳定性、冻融循环3次稳定性(-80℃)、进样器放置24h稳定性，结果见表4。
表4颈舒颗粒中肉桂酸在大鼠血浆中稳定性的结果
5.预实验中与现有方法相比改进之处
现已有测定颈舒颗粒中肉桂酸和桂皮醛的高效液相色谱法，但现有方法流动相中使用的是5mmol/l的甲酸铵，虽然质谱响应值增大，但肉桂酸的色谱峰型不对称且有杂峰干扰测定。液液提取的溶剂考察过环己烷、甲基叔丁基醚、正己烷、乙醚：乙酸乙酯(1∶1)，结果质谱响应值都不如乙酸乙酯提取后样品的响应值高。由于肉桂酸是酸性化合物，在液液提取时需注意提取介质酸度的控制，因此经过考量，在本试验中改进为使用1mmol/l盐酸调节酸度。
实验例2：为证明本发明的科学性与合理性，进行了以下方法学实验研究：
方法一:
方法来源：根据《中华人民共和国药典(2015版)一部》以三七和人工牛黄为检测指标，照高效液相色谱法(通则0512)测定。
三七：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以水为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为203nm。理论板数按人参皂苷rg1峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备：取人参皂苷rg1对照品及人参皂苷rb1对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含0.1mg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备：取装量差异项下的本品，混匀，取适量，研细，取约0.5g，精密称定，加乙醚20ml，摇匀，放置12小时，滤过，弃去滤液，滤纸及滤渣挥去乙醚，精密加入甲醇10ml，称定重量，超声处理(功率250w，频率50khz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品每袋含三七以人参皂苷rg1(c42h72o14)和人参皂苷rb1(c54h92o23)的总量计，不得少于15.0mg。
人工牛黄：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈～0.2％磷酸溶液(35：65)为流动相；检测波长为192nm。理论板数按胆酸峰计算应不低于2000。
对照品溶液的制备：取胆酸对照品适量，精密称定，加60％乙腈制成每1ml含0.3mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取装量差异项下的本品，混匀，取适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10ml，超声处理(功率250w，频率50khz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品每袋含人工牛黄以胆酸(c24h40o5)计，不得少于40.0mg。
结论：现有方法仅包含了对三七、人工牛黄的检测，并未涉及天麻、肉桂等另外5种药材，也未完全覆盖三七的3种活性化学成分，即三七皂苷r1、人参皂苷rg1和人参皂苷rb1。因此，国药集团精方(安徽)药业股份有限公司建立了一种新的含量测定方法来更加科学合理地对颈舒颗粒进行检测和质控。
方法二
以下是本发明的方法学实验研究：
1材料
1.1仪器
ultimate3000液相色谱系统(包括四元泵、自动进样器、dad检测器，美国戴安公司)；电子天平(cp225d，德国赛多利斯公司)；超声波清洗机(220v/50hz，上海三友超音设备有限公司)；离心机(heraeusfresco21小型高速冷冻离心机，美国赛默飞世尔科技公司)。
1.2试剂
肉桂酸(批号：110786-200503)、胆酸(批号：100078-201415)购自中国食品药品检定研究院；天麻素(批号：b1723054)、三七皂苷r1(批号：c1601043)、人参皂苷rb1(批号：e1731014)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；桂皮醛(批号：2136)购自上海诗丹德生物技术有限公司；人参皂苷rg1(批号：dst170223-009)购自成都德思特生物技术有限公司。甲酸(批号：l1609048，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，色谱纯)，甲醇、乙腈均为色谱纯，水为超纯水。
1.3试药
颈舒颗粒(批号：160101、170924、170925、171010，国药集团精方(安徽)药业股份有限公司)。
2方法与结果
对照品溶液的制备：1)对照品贮备液的制备：分别称定天麻素、肉桂酸、桂皮醛对照品各0.5mg；三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1对照品各1.25mg；胆酸对照品5mg；以适量甲醇溶解，80％甲醇水稀释至20ml，混匀，即得；2)对照品系列溶液的配制：制备不同浓度的对照品混合溶液以绘制标准曲线，分别精密移取天麻素、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、肉桂酸、桂皮醛对照品贮备液各100μl，再精密移取胆酸对照品贮备液400μl，混匀，得到高浓度的混合对照品溶液；取该溶液按照一定的浓度倍数依次稀释，稀释剂为80％甲醇水，最终得到7个混合对照品溶液；同样的方法以各对照品贮备液稀释制备出3个低、中、高不同浓度的质控样品，各物质在标准曲线样品和质控样品中的浓度见表5。
表5各物质在标准曲线样品和质控样品中的浓度(μg/ml)
供试品溶液的制备：称取颈舒颗粒粉末6g，置于锥形瓶中，加入30ml的甲醇，称定重量，以功率250w、频率50khz超声30min后放冷至室温，用甲醇补足重量，13000r/min离心8min，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
色谱条件与系统适用性试验条件为：使用
流动相梯度洗脱程序
测定法：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
方法学考察
1.方法特异性试验
将空白溶剂80％甲醇水、std5混合对照品溶液、颈舒颗粒样品(批号：160101)，按照一次检测颈舒颗粒中7种化学成分的方法中的色谱条件与系统适用性试验条件为项下的色谱条件分别进样分析。选择260nm波长下的吸收数据作为肉桂酸和桂皮醛的定量依据，其余5种物质均用193nm波长下的吸收数据进行定量计算。结果如图4、图5、图6、图7、图8、图9所示，溶液中各成分不受空白溶剂的干扰，并且分离良好(分离度均大于1.5)，最低定量限信噪比均大于8(s/n≥8)，各物质的保留时间见表6。
表6七个化学成分的保留时间(min)
2.线性关系考察
取对照品标准曲线系列工作液，按照颈舒颗粒次检测7一检测色谱条件分别进样，记录峰面积。由峰面积(a)对溶液中各成分的质量浓度(c)进行加权线性回归，得到线性回归方程。结果见表7，7种对照品均在相应浓度范围内线性良好(r2均大于0.999)。
表77种物质的线性关系
3.精密度试验
取对照品系列溶液项下的3个不同浓度的质控样品，按照一次检测颈舒颗粒中7种化学成分的方法中的色谱条件分别连续进样5次，考察7种对照品峰面积的批内精密度和批间精密度，结果见表8。试验结果表明，各个对照品峰面积的rsd值均小于5.0％，方法的重复性较好。
表8质控样品中7种对照品峰面积的rsd值(％)(n＝5)
4.稳定性试验
取供试品溶液，在上述色谱条件下分别于配制后0、4、8、12和24h进样测定，考察7种对照品峰面积的稳定性。结果天麻素、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、肉桂酸、桂皮醛、胆酸的峰面积的rsd分别为2.38％、1.76％、2.85％、2.36％、1.49％、1.13％和1.66％，表明供试品溶液在24h内稳定。
5.加样回收率试验
精密称取研磨过筛后的颈舒颗粒(批号：160101)样品约3g，分别精密加入一定量的对照品，按照一次检测颈舒颗粒中7种化学成分的方法中的供试品溶液，制得低、中、高浓度(相当于供试品溶液浓度的50％、100％和150％)的质控溶液(n＝3)，上述所有样品均在一次检测颈舒颗粒中7种化学成分的方法中的色谱条件测定并计算回收率。这7种化合物的平均加样回收率在101.33％～103.09％，rsd值均小于5.0％，具体结果见表9。
表9颈舒颗粒中7中化学物质的加样回收率试验结果(n＝3)
6.样品含有量测定
精密称取研磨过筛后的颈舒颗粒样品(批号：160101、170924、170925、171010)约6g，平行做3份，按照一次检测颈舒颗粒中7种化学成分的方法中的供试品溶液，在一次检测颈舒颗粒中7种化学成分的方法中的色谱条件下分别进样分析，计算各个物质在颈舒颗粒中的含有量。颈舒颗粒中这7种化合物的平均含有量结果见表10。
表10颈舒颗粒中7种化学成分的平均含有量(mg/g)(每批n＝3，一共n＝12)
7、实验结论
1)本研究建立了一种颈舒颗粒新的高效液相色谱检测方法。
2)本研究初步建立了一种颈舒颗粒新的质量标准，以表10中7种化学成分平均值的60％为依据，则新的质量标准如表11所述。
表11颈舒颗粒新的质量标准(mg/g)(以平均值60％计)
结论：本发明对颈舒颗粒中天麻素、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、肉桂酸、桂皮醛和胆酸共7种化学成分一次检测的方法，本方法通过紫外检测器扫描，上述7种化合物均能被有效分离检测，且在相应浓度范围内线性良好，平均回收率在101.33％～103.09％，检测方法操作简便、准确，可以大幅改进颈舒颗粒的质量控制方法，克服现有技术未对成分检测的全覆盖性、操作繁杂性。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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