本发明属于医疗器械检测领域，涉及一种医疗器械极限浸提的方法，尤其涉及一种医疗器械遗传毒性检测前极限浸提的方法。
背景技术：
根据GB T 16886.1/ISO 10993-1医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验，遗传毒性评价已经成为与人体长期接触类器械临床前生物学安全性评价中必需进行的实验项目。生物医用材料及相关医疗器械的遗传毒性测试和评价方法主要有ISO 10993-3Biological evaluation of medical devices—Part 3Tests for genotoxicity,carcinogenicity和中国国家标准GB/T 16886.3医疗器械生物学评估第3部分：遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验。两种标准之间具有一致性。
根据标准GB/T 16886.12/ISO 10993-12医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品,医疗器械的传统浸提方式都是通过极性和非极性两种浸提介质在特定温度和时间后获得浸提液。最新2014版的ISO 10993-3标准根据生物医用材料及相关医疗器械的遗传毒性往往具有低剂量依然有危害性的特点基于传统的浸提方式提出了一种极限浸提的方法，从而可以将材料或者器械中所有可浸提物提取出来应用到试验体系中。
根据标准ISO 10993-3Biological evaluation of medical devices—Part 3Tests for genotoxicity,carcinogenicity附录A中提出的样品浸提方案，极限浸提的具体指导原则如下：样品经挥发性极性和非极性有机浸提介质浸提24小时后，将浸提液倒入玻璃梨形瓶中，在减压浓缩装置中30℃下挥发干有机溶剂，通过有机溶剂挥干后含有残渣的瓶子的质量减去瓶子的净重得到浸提残渣的质量，再用适合实验体系的溶剂溶解残渣至适宜浓度，然后用于实验。该指导原则对过程描述比较笼统，操作人员在检测过程中往往忽视玻璃梨形瓶理化性质不稳定的问题，导致样品中残渣质量计算产生偏差。极限浸提中涉及天平、减压浓缩装置等大型精密仪器，因此整个实验过程无法都在无菌环境下进行。然而，遗传毒性实验中使用细胞和细菌体外培养进行试验，需要保证样品的无菌性，否则会干扰到实验结果。但是标准提供的准则中并没有如何保持样品无菌的说明。
因此，提供一种准确、可操作且得到的样品无菌的医疗器械极限浸提方法具有重要意义。
技术实现要素：
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种医疗器械极限浸提的方法，使得极限浸提过程中对恒重的控制更为准确，且得到的样品无菌，检测结果更准确。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种医疗器械极限浸提的方法，所述方法包括将样品放入石英材质的梨形瓶中，再通过真空干燥的方式以达到恒重的目的，获得准确的质量。
遗传毒性评价已成为与人体长期接触类器械临床前生物学安全性评价必须进行的实验项目，生物医用材料及相关医疗器械的遗传毒性测试和评价方法主要为ISO 10993-3:2014Biological evaluation of medical devices—Part 3Tests for genotoxicity,carcinogenicity，但发明人在长期不断的实践过程中，发现该标准过于笼统，根据该标准进行检测的结果不稳定，通过反复验证探究，发现恒重过程存在极容易被忽略的问题，即玻璃材质的梨形瓶在常温条件下理化性质不稳定，自身质量会不断波动，无法达到恒重的要求(根据药典，恒重是指供试品连续两次干燥或炽灼后称重的差异在0.3mg以下的质量；干燥至恒重的第二次及以后各次称重均应在规定条件下继续干燥1小时后进行；炽灼至恒重的第二次称重应在继续炽灼30分钟后进行)，会对残渣质量的计算产生极大影响。常规恒重的方法是通过高温烘烤以消除器皿中的水分从而达到恒重的要求，然而极限浸提原则中要求浸提过程必须在30℃下进行，因为高温会对样品浸提后的残渣的理化性质产生影响，因此高温烘烤不适合于极限浸提中梨形瓶的恒重。目前，对于医疗器械极限浸提的具体可行的方案尚属空白，发明人将玻璃梨形瓶替换为石英梨形瓶，从而克服现有技术中隐含的技术问题，在评价生物相关材料时更加客观准确，结果更加稳定。
优选地，所述方法包括以下步骤：
(1)将石英梨形瓶真空干燥至恒重，称定，记录M1；
(2)将样品放入石英梨形瓶，浸提于有机溶剂中，恒温振荡；
(3)取出样品，对石英梨形瓶中的有机溶剂进行旋转蒸发至溶剂蒸干；
(4)将步骤(3)所得石英梨形瓶真空干燥至恒重，称定，记录M2。
优选地，步骤(1)所述真空干燥至恒重的具体方法为：将石英梨形瓶真空干燥0.5-1h，然后称定石英梨形瓶至0.1mg级别，记录质量m1，将第一次称定后的石英梨形瓶再次真空干燥0.5-1h后，置于相同仪器进行称定，记录质量m2，m1与m2差值的绝对值小于0.3mg即为恒重，选择m1和m2中较小的数值记为M1。
优选地，步骤(2)所述恒温振荡的温度为10-30℃，例如可以是10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃。
优选地，所述恒温振荡的时间为22-26h，例如可以是22h、23h、24h、25h或26h，优选为24h。
优选地，步骤(3)所述旋转蒸发的温度不大于30℃，优选为30℃。
优选地，步骤(4)所述真空干燥至恒重的具体方法为：将旋转蒸发后的石英梨形瓶真空干燥0.5-1h，然后称定石英梨形瓶至0.1mg级别，记录质量m3，将第一次称定后的石英梨形瓶再次真空干燥0.5-1h后，置于相同仪器进行称定，记录质量m4，m3与m4差值的绝对值小于0.3mg即为恒重，选择m3和m4中较小的数值记为M2。
本发明中涉及称定过程的均使用十万级天平或更高级别，称定结果须记录到小数点后四位，且称定时尽量减少称定空间内的空气流动以及其他可能影响天平准确性的活动。所述恒重的判定可按照中国药典2015版第四部中凡例第三十一项执行。
优选地，所述方法还包括除菌的步骤。
极限浸提中涉及天平、减压浓缩装置等大型精密仪器，因此整个实验过程无法都在无菌环境下进行。然而，遗传毒性实验中使用细胞和细菌体外培养进行试验，需要保证样品的无菌性，否则会干扰到实验结果。但是标准提供的准则中并没有如何保持样品无菌的说明。本发明通过选择合适的滤膜进行过滤除菌，保证了样品的无菌性。
优选地，所述除菌为过滤除菌。
优选地，所述过滤除菌采用0.22μm微孔滤膜进行过滤。
优选地，所述微孔滤膜不与样品残渣溶液发生反应，且对过滤液的吸收不超过1％。
优选地，所述真空干燥的干燥剂为硅胶。
本发明中真空干燥器中的干燥剂为硅胶，且真空干燥器各接缝处用凡士林密封，真空干燥器外接可耐有机试剂腐蚀的真空泵以保持真空。
优选地，所述方法包括如下步骤：
(1)将石英梨形瓶真空干燥0.5-1h，然后称定石英梨形瓶至0.1mg级别，记录质量m1，将第一次称定后的石英梨形瓶再次真空干燥0.5-1h后，置于相同仪器进行称定，记录质量m2，m1与m2差值的绝对值小于0.3mg即为恒重，选择m1和m2中较小的数值记为M1；
(2)将样品放入石英梨形瓶，浸提于有机溶剂中，10-30℃恒温振荡22-26h；
(3)取出样品，对石英梨形瓶中的有机溶剂进行旋转蒸发至溶剂蒸干，所述旋转蒸发的温度不大于30℃；
(4)将旋转蒸发后的石英梨形瓶真空干燥0.5-1h，然后称定石英梨形瓶至0.1mg级别，记录质量m3，将第一次称定后的石英梨形瓶再次真空干燥0.5-1h后，置于相同仪器进行称定，记录质量m4，m3与m4差值的绝对值小于0.3mg即为恒重，选择m3和m4中较小的数值记为M2，将残渣按照标准要求的浓度溶解到适宜实验体系的溶剂中，选择合适的0.22μm微孔滤膜过滤样品残渣溶液备用。
作为本发明的优选技术方案，所述方法具体包括如下步骤：
(1)将石英梨形瓶真空干燥1h，然后称定石英梨形瓶至0.1mg级别，记录质量m1，将第一次称定后的石英梨形瓶再次真空干燥1h后，置于相同仪器进行称定，记录质量m2，m1与m2差值的绝对值小于0.3mg即为恒重，选择m1和m2中较小的数值记为M1；
(2)将样品放入石英梨形瓶，浸提于有机溶剂中，30℃恒温振荡24h，所述浸提标准与ISO 10993-3:2014附录A中的A.3.3.3一致；
(3)取出样品，对石英梨形瓶中的有机溶剂进行旋转蒸发至溶剂蒸干，所述旋转蒸发的温度不大于30℃；
(4)将旋转蒸发后的石英梨形瓶真空干燥1h，然后称定石英梨形瓶至0.1mg级别，记录质量m3，将第一次称定后的石英梨形瓶再次真空干燥1h后，置于相同仪器进行称定，记录质量m4，m3与m4差值的绝对值小于0.3mg即为恒重，选择m3和m4中较小的数值记为M2，由M1和M2计算残渣的质量和浸提物的百分比判定是否使用样品残渣进行试验，判定标准与ISO10993-3:2014附录A中的A3.3.4一致，将残渣按照标准要求的浓度溶解到适宜实验体系的溶剂中，标准为ISO 10993-3:2014附录A中的A.3.3.2，选择合适的0.22μm微孔滤膜过滤样品残渣溶液备用，所述微孔滤膜不与样品残渣溶液发生反应，且对过滤液的吸收不超过1％；
其中，步骤(1)和步骤(4)中所述真空干燥的干燥剂为硅胶。
本发明中，在获得M1和M2值的前提下，可以计算残渣的质量和浸提物的百分比判定是否使用样品残渣进行试验，残渣质量为(M2-M1)的值，浸提物的百分比计算公式为(M2-M1)/M3，其中M3为待测样品在浸提前的质量。样品残渣可以用于后续实验的标准为：若M3<0.5g，则浸提物百分比需要≥1％；若M3>0.5g，则浸提物百分比需要≥0.5％。
具体操作过程中，用于医疗器械遗传毒性评价的样品极限浸提方法可以按照如下步骤进行：
(1)取两个石英梨形瓶洗净、晾干，分别编号，放入真空干燥器中保持真空干燥一个小时，然后分别在十万级天平上称取质量，记录下石英梨形瓶的质量；
(2)将两个石英梨形瓶继续放入真空干燥器中保持真空干燥一个小时，然后分别再在相同的十万级天平上称取质量，再记录下石英梨形瓶的质量，如与前次称定质量相差都不超过0.3mg，视为恒重，取恒重前后两次称定的较小值记录石英梨形瓶的净重；
(3)将两份样品放入恒重后的石英梨形瓶中，按照0.1g/mL的比例在石英梨形瓶中分别加入丙酮和甲醇以淹没样品。梨形瓶盖塞，放入恒温振荡箱里在30℃下以100r/min的转速振荡浸提24h；
(4)振荡浸提结束后，弃去梨形瓶中剩余的样品。将梨形瓶接入旋转蒸发仪，30℃下旋转蒸发梨形瓶中的浸提液；
(5)待梨形瓶中肉眼观察不到浸提液时，停止旋转蒸发，取下梨形瓶放入真空干燥器中真空干燥一个小时，然后在十万级天平上称量，记录下石英梨形瓶的质量；
(6)将两个石英梨形瓶继续放入真空干燥器中保持真空干燥一个小时，然后分别再在相同的十万级天平上称量，记录下石英梨形瓶的质量，与前次称定质量相差都不超过0.3mg视为恒重。按照恒重前后两次称定的较小值记录旋转蒸发后石英梨形瓶的质量。由此计算可得丙酮和甲醇浸提样品后的残渣量以及浸提物的百分比；
(7)根据标准ISO 10993-3:2014Biological evaluation of medical devices—Part 3Tests for genotoxicity,carcinogenicity附录A规定，若有机溶剂浸提样品后的残渣量满足浸提物百分比要求，就可以用于后续的遗传毒性试验。将残渣用符合后续试验体系的溶剂溶解到适宜的浓度。选择不会与溶剂或者残渣发生反应的液相用0.22μm滤膜过滤样品残渣溶液备用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明解决了实际操作ISO 10993-3:2014Biological evaluation of medical devices—Part 3Tests for genotoxicity,carcinogenicity附录A中极限浸提原则中所面临的问题，选用石英材料，克服了传统玻璃梨形瓶理化性质不稳定的缺点。采用真空干燥器干燥的方式，具有干燥过程中样品理化性质不受影响的优点。为满足实验需要，最后步骤采用过滤除菌的方式以保证浸提液无菌，具有操作简单、除菌彻底等特点。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1
一种用于医疗器械遗传毒性评价的样品极限浸提的方法，包括以下步骤：
(1)采用山东省医疗器械产品质量检验中心提供的陶瓷作为试验样品；
(2)取两个石英梨形瓶洗净、晾干，编号1、2，放入真空干燥器中保持真空干燥一个小时，然后分别在十万级天平上称取质量，记录下质量分别为89.5267g和100.4190g；
(3)将两个石英梨形瓶继续放入真空干燥器中保持真空干燥一个小时，然后分别再在相同的十万级天平上称取质量，记录下编号1、2的石英梨形瓶质量分别为89.5265g和100.4187g，与前次称定质量相差都不超过0.3mg，视为恒重，编号1、2石英瓶的净重按照恒重前后两次称定的较小值记为89.5265g和100.4187g；
(4)将两个质量分别为5.4g和5.3g的样品放入恒重后编号1、2的石英梨形瓶中，按照0.1g/mL的比例在编号1、2的石英梨形瓶中分别加入丙酮和甲醇以淹没样品。梨形瓶盖塞，放入恒温振荡箱里在30℃下以100r/min的转速振荡浸提24h；
(5)振荡浸提结束后，弃去梨形瓶中剩余的样品。将梨形瓶接入旋转蒸发仪，30℃下旋转蒸发梨形瓶中的浸提液；
(6)待梨形瓶中肉眼观察不到浸提液时，停止旋转蒸发，取下梨形瓶放入真空干燥器中真空干燥一个小时，然后在十万级天平上称取质量，记录下编号1、2的石英梨形瓶质量分别为89.5341g和100.4192g；
(7)将两个石英梨形瓶继续放入真空干燥器中保持真空干燥一个小时，然后分别再在相同的十万级天平上称取质量，记录下编号1、2的石英梨形瓶质量分别为89.5340g和100.4194g，与前次称定质量相差都不超过0.3mg，视为恒重，编号1、2含有残渣的石英瓶的质量按照恒重前后两次称定的较小值记为89.5340g和100.4192g。由此计算可得丙酮和甲醇浸提样品后的残渣量分别为75mg和0.5mg，浸提物的百分比分别为1.39％和0.01％；
(8)根据标准ISO 10993-3:2014Biological evaluation of medical devices—Part 3Tests for genotoxicity,carcinogenicity附录A规定，丙酮浸提样品后的残渣量满足浸提物百分比要求，可以用于后续的遗传毒性试验。将残渣按照后续试验要求用适宜的溶剂溶解到适宜的浓度。选择尼龙材质聚丙烯外壳的0.22μm针筒滤膜过滤样品残渣溶液备用。
对比例
(1)取两个玻璃梨形瓶洗净、晾干，编号1、2，放入真空干燥器中保持真空干燥一个小时，然后分别在十万级天平上称取质量，记录下质量分别为74.5813g和80.7485g；
(2)将两个玻璃梨形瓶继续放入真空干燥器中保持真空干燥一个小时，然后分别再在相同的十万级天平上称取质量，记录下编号1、2的石英梨形瓶质量分别为74.5800g和80.7467g，与前次称定质量相差都超过0.3mg，恒重失败。重复上述操作十次，编号1玻璃梨形瓶的重量依照时间顺序分别为74.5788g、74.5819g、74.5788g、74.5804g、74.5787g、74.5781g；74.5811g、74.5821g、74.5816g、74.5802g。编号2玻璃梨形瓶的重量依照时间顺序分别为80.7485g、80.7467g、80.7457g、80.7451g、80.7489g、80.7450g、80.7470g、80.7460g、80.7445g、80.7480g。
(3)对玻璃梨形瓶进行多次恒重操作但都无法达到恒重要求，故无法进行下一步实验。
综上所述，本发明提供了一种准确、可操作且得到的样品无菌的医疗器械极限浸提方法，将玻璃梨形瓶替换为石英梨形瓶，配合相应的干燥恒重方法，从而克服现有技术中隐含的技术问题，在评价生物相关材料时更加客观准确，结果更加稳定。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。