一种QuEChERS-三重四级杆串联质谱检测虾肉中4种硝基呋喃代谢物残留的方法与流程

本发明涉及兽药残留检测技术领域，具体涉及一种quechers-三重四级杆串联质谱检测虾肉中4种硝基呋喃代谢物残留的方法。

背景技术：

中国是全球对虾养殖的第一大生产国，近几年我国的出口虾类产品保持较快的增长幅度，但是遭到官方机构通报的情况也相对增加，尤其是硝基呋喃类药物残留超标最为普遍。硝基呋喃属于典型的合成广谱抗生素药物，广泛用于家畜家禽及水产品等动物的疾病预防和控制，研究表明该类药物具有致癌性和诱变性，包括中国在内的多个国家，明确禁止使用硝基呋喃类药物。但由于其价格低廉，药用性好，在全球范围内仍存在非法使用的现象。

目前，硝基呋喃类药物代谢物常用的分析检测法主要为液相色谱-串联质谱法(lc-ms)；lc-ms法具有准确性高、检出限低、测定速度快、干扰少等优点。但是前处理技术发展较为缓慢，若样品前处理提取不好，会对检测产生较大的干扰。目前，硝基呋喃类药物代谢物前处理主要为液液萃取法和固相萃取法，这些方法不仅成本高，试剂消耗量大，容易造成环境污染，而且操作繁琐。国家标准《农业部783号公告-1-2006》采用乙酸乙酯液液萃取操作过程中呋喃类成分受ph值变化的影响较大；同时对于虾肉等蛋白质含量较高的样品在萃取后容易发生乳化现象，需要再除蛋白，使前处理的操作更加繁琐复杂。

技术实现要素：

(一)解决的技术问题

本发明提供一种quechers-三重四级杆串联质谱检测虾肉中4种硝基呋喃代谢物残留的方法以改进的quechers法对样品进行提取净化，结合三重四级杆串联质谱检测虾肉中4种硝基呋喃代谢物残留，具有快速简便，环保廉价的特点。

(二)技术方案

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种quechers-三重四级杆串联质谱检测虾肉中4种硝基呋喃代谢物残留的方法，包括以下步骤：

一种quechers-三重四级杆串联质谱检测虾肉中4种硝基呋喃代谢物残留的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)配制标准品

称取四种标准品及其内标10mg置10ml容量瓶中，分别用甲醇溶解稀释定容；再分别准确移取适量的单一标准储备液与用甲醇稀释成浓度为100ng/ml的混合标准溶液，及100ng/ml混合内标工作溶液；

(2)样品前处理

样品充分均质匀浆，称取2g，置于50ml洁净的离心管中，加入20μl混合内标工作溶液，加入0.2mol/l盐酸5ml和0.05mol/l和2-硝基苯甲醛0.15ml避光保存16h；16h后取出，再加入5％甲酸乙腈5ml，振荡数秒，加入nacl4g，涡旋混匀样品，8000r/min离心5min，取含psa50mg、c18100mg的上清液于净化管中，涡旋混匀样品，10000r/min离心1min，取1ml过0.22μm滤膜，上机分析；

(3)标准工作曲线配置

分别准确吸取100ng/ml混合标准溶液置于5、10、20、50、100、500μl于50ml离心管中，除不加样品外按步骤(2)测定；

(4)色谱条件

色谱柱:acquityuplcbehc18柱(2.1mm*100mm，1.7μm)；柱温：35℃；流速：0.3ml/min；进样量：5μl；流动相a：乙酸胺0.005mol/l；流动相b：甲醇；按下表条件进行梯度洗脱

(5)质谱条件

离子源：esi+；离子源温度：350℃；毛细管电压：4000v；鞘气压力：30psi；辅助气压力：10psi；蒸发器温度：300℃；质谱扫描离子信息：

*为定量离子。

(三)有益效果

相比现有技术，本发明提供的一种quechers-三重四级杆串联质谱检测虾肉中4种硝基呋喃代谢物残留的方法具有以下优点：

(1)本发明以改进的quechers净化代替了传统的液液萃取，克服了液液萃取中ph和蛋白易乳化的影响，不仅能够有效去除虾肉基质中的其他杂质，且回收率、重复性、灵敏度和检出限均满足国标的要求，具有快速，简便，高效，廉价和环保等特点。

(2)在硝基呋喃类代谢物提取溶剂的选择中，本专利对比了乙腈、乙酸乙酯、含水乙腈以及含酸乙腈溶液，结果发现使用乙酸乙酯、含水乙腈提取液浑浊，这是因为乙酸乙酯极性较小，导致极性大的物质不易提取，而极性小的油脂和脂肪被共萃出来；而用含一定比例水的乙腈和纯乙腈作为提取剂时，因样品溶液中蛋白质含量较高，容易发生乳化现象；硝基呋喃类代谢物均易溶于弱酸性溶液，本发明使用含5％甲酸的乙腈溶液作为提取溶剂，有效去除蛋白质，回收率也可满足分析要求；

(3)本发明以5％甲酸的乙腈溶液对虾肉样品进行提取，以改进的quechers法(含psa50mg、c18100mg)进行净化，psa可以去除有机酸，色素，金属离子和酚类等，c18主要吸附油脂等弱极性杂质。本发明对比了国家标准《农业部783号公告-1-2006》乙酸乙酯液液萃取法，实验表明，两种方法均能达到较好的回收率，但采用乙酸乙酯液液萃取操作过程中呋喃类成分受ph值变化的影响较大，在ph值6-7的水溶液和乙酸乙酯才可以达到比较好的分离萃取效果，操作更加繁琐复杂，而本发明更简便快速，环保廉价。

附图说明

图1为虾肉中硝基呋喃代谢物amoz检测的线性曲线示意图；

图2为虾肉中硝基呋喃代谢物ahd检测的线性曲线示意图；

图3为虾肉中硝基呋喃代谢物aoz检测的线性曲线示意图；

图4为虾肉中硝基呋喃代谢物sem检测的线性曲线示意图；

图5为虾肉中4种硝基呋喃代谢物残留分离图谱及信噪比示意图。

具体实施方式

下面将结合附图和本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供的一种quechers-三重四级杆串联质谱检测虾肉中4种硝基呋喃代谢物残留的方法，步骤如下：

呋喃唑酮代谢物(aoz)、呋喃它酮代谢物(amoz)、呋喃西林代谢物(sem)、呋喃妥因代谢物(ahd)、aoz-d4、amoz-d5、ahd-13c3和sem-13c15n2，德国witega公司(纯度均大于等于98％)。

甲酸、甲醇、乙腈(色谱纯，德国sigma公司)；2-硝基苯甲醛、nacl(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；十八烷基键合硅胶吸附剂(c18)、n-丙基乙二胺吸附剂(psa)(日本岛津公司)。

ikams3digital旋涡混匀器数显型、ikat18digitalpackage2数显型高速均质机(德国ika公司)；高速冷冻离心机gl-20g-ii(上海安亭科学仪器厂)；锐思捷unique+uv实验室多功能纯水-超纯水系统(厦门锐思捷科学仪器有限公司)；戴安u3000超高液相色谱-赛默飞tsqquantumultra三重四极杆液质联用仪(美国thermo公司)。

(1)配制标准品

称取四种标准品及其内标10mg置10ml容量瓶中，分别用甲醇溶解稀释定容；再分别准确移取适量的单一标准储备液与用甲醇稀释成浓度为100ng/ml的混合标准溶液，及100ng/ml混合内标工作溶液；

(2)样品前处理

样品充分均质匀浆，称取2g，置于50ml洁净的离心管中，加入20μl混合内标工作溶液，加入0.2mol/l盐酸5ml和0.05mol/l和2-硝基苯甲醛0.15ml避光保存16h；16h后取出，再加入5％甲酸乙腈5ml，振荡数秒，加入nacl4g，涡旋混匀样品，8000r/min离心5min，取含psa50mg、c18100mg的上清液于净化管中，涡旋混匀样品，10000r/min离心1min，取1ml过0.22μm滤膜，上机分析；

(3)标准工作曲线配置

分别准确吸取100ng/ml混合标准溶液5、10、20、50、100、500μl置于50ml离心管中，除不加样品外按步骤(2)测定；

色谱条件

(4)色谱条件

色谱柱:acquityuplcbehc18柱(2.1mm*100mm，1.7μm)；柱温：35℃；流速：0.3ml/min；进样量：5μl；流动相a：乙酸胺0.005mol/l；流动相b：甲醇。按下表条件进行梯度洗脱：

(5)质谱条件

离子源：esi+；离子源温度：350℃；毛细管电压：4000v；鞘气压力：30psi；辅助气压力：10psi；蒸发器温度：300℃；质谱扫描离子信息：

*为定量离子。

采用内标法定量，所得标准曲线的回归方程、相关系数和线性范围见图1、图2、图3和图4所示，其中，图1为虾肉中硝基呋喃代谢物amoz检测的线性曲线示意图、图2为虾肉中硝基呋喃代谢物ahd检测的线性曲线示意图、图3为虾肉中硝基呋喃代谢物aoz检测的线性曲线示意图、图4为虾肉中硝基呋喃代谢物sem检测的线性曲线示意图，可见对照品的曲线方程相关系数r²都＞0.99，硝基呋喃四种代谢物在0.5、1、2、5、10和50ng/ml溶度范围内具有良好的线性关系。

在溶度0.5ng/ml下，sem、aoz、ahd和amoz分离图谱及信噪比见图5所示，图5为虾肉中4种硝基呋喃代谢物残留分离图谱及信噪比示意图；

同时，以3倍信噪比时相应浓度确定检测低限，以10倍信噪比时相应浓度确定定量低限，检测低限与定量限如下表

可见，本发明对四种硝基呋喃代谢物的检测限为0.039～0.063μg/kg；定量限为0.132～0.208μg/kg；说明该方法灵敏度高。

以阴性样品虾肉作为测试对象，分别加标0.5μg/kg和5μg/kg，同时做平行试验(n＝3)，测定回收率及rsd如下表

结果显示，在两个加标浓度条件下四种硝基呋喃代谢物的回收率在72.00％～92.85％，相对标准偏差rsd(n＝3)，在1.23％～7.96％。测定结果符合药物残留检测分析的要求。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。