用于结核潜伏感染诊断的试剂盒及蛋白芯片的制作方法

本发明属于生物医学
技术领域：
，特别涉及一种用于结核潜伏感染诊断的试剂盒及蛋白芯片。
背景技术：
：结核病是继艾滋病之后由单一病原体引起的死亡人数最多的传染病，造成结核病疫情严重主要的原因之一是缺乏有效的早期诊断技术。结核菌感染后并不是全部人都会发病，一部分人群会转归为潜伏感染状态，即结核潜伏感染者。这部分人群在体内持续存在结核菌，但由于机体免疫力对结核菌的控制，并没有临床表现。当机体免疫力下降后，潜伏在机体内的结核菌就会“死灰复燃”，在体内结核菌会再复制，最后转变为结核病人。潜伏感染者一生中有10％的机会转变为结核病人。在中国约四分之一的人口感染了结核菌，如果能对这部分人群进行观察或者干预，能大大的降低结核病的发生。但是目前结核感染还缺乏特异性的诊断方法，临床上有抗体和细胞免疫检测，细胞免疫检查包括ppd皮试和igra技术。ppd皮试比较简便，但是与bcg有交叉反应，假阳性率比较高，特别是在中国广泛接种卡介苗(bcg)的情况下，其使用效率明显受限。igra技术检测的是结核特异性ifng的表达，虽然特异性明显提高，但是目前该方法相对比较费事和费时，价格都相对较贵，严重的限制了临床上的推广和使用。因此，有必要提供一种高灵敏度、高特异性的用于结核潜伏感染者诊断的方法和产品。技术实现要素：基于此，本发明的目的在于提供一种高灵敏度、高特异性的用于结核潜伏感染者诊断的试剂盒。为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：检测白细胞介素-6、肿瘤坏死因子受体ii、表皮调节素和干扰素诱导蛋白10的试剂在制备用于结核潜伏感染诊断的试剂盒中的应用。一种用于结核潜伏感染诊断的试剂盒，包含有能够定量检测白细胞介素-6、肿瘤坏死因子受体ii、表皮调节素和干扰素诱导蛋白10的试剂。本发明还提供一种用于结核潜伏感染诊断的蛋白芯片，具体技术方案如下：一种用于结核潜伏感染诊断的蛋白芯片，包含有：基片和固定在所述基片上的捕获抗体；所述捕获抗体包括：针对白细胞介素-6的特异性抗体、针对肿瘤坏死因子受体ii的特异性抗体、针对表皮调节素的特异性抗体和针对干扰素诱导蛋白10的特异性抗体；所述基片为包被有活性环氧基团的基片。本发明还提供了一种用于结核潜伏感染诊断的蛋白芯片的制备方法，具体技术方案如下：一种用于结核潜伏感染诊断的蛋白芯片的制备方法，包括以下步骤：在蛋白芯片的基片上包被活性环氧基团；将捕获抗体固定于所述蛋白芯片的基片上；所述捕获抗体包括：针对白细胞介素-6的特异性抗体、针对肿瘤坏死因子受体ii的特异性抗体、针对表皮调节素的特异性抗体和针对干扰素诱导蛋白10的特异性抗体。基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：本发明的发明人发现，通过检测白细胞介素-6、肿瘤坏死因子受体ii、表皮调节素和干扰素诱导蛋白10这四种蛋白的表达水平，能够将结核潜伏感染者和健康人群区分开来，并具有较高的灵敏度和特异性。将这四种蛋白对应的特异性抗体固定于基片上，制备成蛋白芯片，能够同时检测四种蛋白的表达水平，而且具有样本需求量低、简单、快捷的优点。在结核潜伏感染的分子生物学研究和临床检测中的应用，有利于结核潜伏感染的早期诊断，能够更准确的发现结核潜伏感染者。附图说明图1为蛋白芯片的点样区域分布示意图。具体实施方式为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本发明的一种用于结核潜伏感染诊断的蛋白芯片，包含有：基片和固定在所述基片上的捕获抗体；所述捕获抗体包括：针对白细胞介素-6的特异性抗体、针对肿瘤坏死因子受体ii的特异性抗体、针对表皮调节素的特异性抗体和针对干扰素诱导蛋白10的特异性抗体。可选地，所述蛋白芯片上还包含有阳性对照。优选地，所述阳性对照为固定在所述基片上的小牛igg。优选地，所述阳性对照可以是不同浓度的小牛igg。更优选的，所述小牛igg为生物素标记的小牛igg。优选地，所述基片为包被有活性环氧基团的基片。活性环氧基团包被的玻片可以更有效地吸附包被抗体在芯片的表面，并且使抗体的稳定性增加。优选地，所述基片上包括有若干个互不干扰的点样区域。更优选地，所述若干个互不干扰的点样区域由可拆卸型框架分离得到。点样前采用特定的框架结构，优化了芯片点阵，使得样本可批量检测，操作简便，样本用量小，互不交叉污染。进一步优选地，所述基板上包括有16～32个互不干扰的点样小区。如图1所示，每个点样小区内点样有针对白细胞介素-6的特异性抗体、针对肿瘤坏死因子受体ii的特异性抗体、针对表皮调节素的特异性抗体和针对干扰素诱导蛋白10的特异性抗体和两种不同浓度的阳性对照小牛igg。具体地，每种特异性抗体重复点样4次，两种不同浓度的阳性对照小牛igg也重复点样4次。在其他一些实施方式中，重复点样的次数可以根据需要合理设定，例如重复点样3～10次。本发明的一种用于结核潜伏感染诊断的蛋白芯片的制备方法，包括以下步骤：将捕获抗体固定于蛋白芯片的基片上；所述捕获抗体包括：针对白细胞介素-6的特异性抗体、针对肿瘤坏死因子受体ii的特异性抗体、针对表皮调节素的特异性抗体和针对干扰素诱导蛋白10的特异性抗体。优选地，所述捕获抗体固定于蛋白芯片的基片上包括以下步骤：将100-1000pl捕获抗体的溶液点样于所述基片上，室温下静置过夜后，真空干燥1-4小时；所述捕获抗体的溶液中含有0.02-20ng捕获抗体和0.01-10g/100ml的牛白蛋白。其中，室温的过夜静置有利于抗体更有效地固定在玻片上。优选地，真空干燥时间为1.5-2.5小时。更优选地，所述点样的条件为：温度70-75f、湿度40-45％。这样的点样条件下，可以改善点样的形态，使抗体在玻片上的分布更加均匀。进一步地，真空抽气干燥后，用抗水蒸气的塑料小袋抽气密封并于0-8℃保存。优选地，于(4±0.5)℃保存。用这种方法所保存的芯片使得抗体更有效地固定在芯片表面，并有效地增加芯片保存的稳定性。优选地，所述蛋白芯片的基片上包括有若干互不干扰的点样区域，由孔可拆卸型框架分隔得到。优选地，所述制备方法还包括：将阳性对照的捕获抗体固定于所述蛋白芯片的基片上，所述阳性对照捕获抗体为小牛igg。优选地，所述阳性对照可以是不同浓度的小牛igg。更优选的，所述小牛igg为生物素标记的小牛igg。优选地，本发明采用不同浓度的双阳性对照。同时使用两者的不同强度信号来标准化不同的微阵列，可以明显地改善芯片的敏感度和重复性。更优选地，所述双阳性对照用于标准化微阵列的方法为：先计算出每个微阵列的阳性对照信号值pos＝(posl+4×pos2)/2；其中pos1为第一浓度的阳性对照的信号值，pos2为第二浓度的阳性对照的信号值；然后再用阳性对照信号值pos对所有的数据进行标准化处理：校正值＝原先值×(样品平均信号值posave)/阳性对照信号值pos。本发明的一种用于结核潜伏感染诊断的蛋白芯片试剂盒，包含有：如上所述的蛋白芯片或由如上所述的制备方法制备得到的蛋白芯片，和检测抗体；所述检测抗体包括：针对白细胞介素-6的特异性抗体、针对肿瘤坏死因子受体ii的特异性抗体、针对表皮调节素的特异性抗体和针对干扰素诱导蛋白10的特异性抗体；其中，针对同一蛋白质的检测抗体与捕获抗体分别识别蛋白质的不同表位。优选地，所述检测抗体带有生物素、hrp或胶体金标记。优选地，所述试剂盒还包含有：蛋白标准品和/或荧光素cy3标记的链霉亲和素。更优选地，所述蛋白标准品为白细胞介素-6、肿瘤坏死因子受体ii、表皮调节素和干扰素诱导蛋白10的混合物。其中，本发明的具体实施例中，全自动点样仪为德国scienion公司生产的产品；蛋白芯片的基片采用标准组织玻片，玻片为美国康宁公司产品。在其他一些实施方式中，也可以采用其它可行的点样仪器和基片。实施例1与结合潜伏感染相关的蛋白质分别取性激素结合球蛋白(shbg)、白细胞介素-2(il-2)、白细胞介素-6(il-6)、白细胞介素-8(il-8)、肿瘤坏死因子受体ii(tnfrii)、表皮调节素(epiregulin)、干扰素诱导蛋白10(ip-10),丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpina3)、肿瘤坏死因子a(tnfa)蛋白标准品，梯度稀释后，通过现有技术中的荧光法测定其荧光值，得到标准曲线荧光信号值及对应浓度，如表1所示。表1蛋白标准品标准曲线荧光信号值及对应浓度由上表数据，将浓度与荧光信号强度分别作对数转换，绘制标准曲线，计算得线性回归方程，其中x为log(标准品浓度)，y为log(荧光信号强度)，具体如表2。表2蛋白标准品标准曲线回归方程r2shbgy＝41.91x-8946.50.97il2y＝1.4909x-1135.80.95il-6y＝0.9522x+2.18170.97il8y＝96.374x-23570.99tnfriiy＝0.883x+1.85710.98epireguliny＝0.7995x-0.54050.99ip-10y＝0.7323x+3.2570.93serpina3y＝1.2738x-5829.20.95tnfay＝3.3867x-135.10.98分别收集临床上确诊为健康者和潜伏性结核感染患者的外周血血清，其中健康者(hc)63例，潜伏性结核患者(ltbi)21例，通过现有技术中的荧光法分别测定血清中的shbg、il-2、il-6、il-8、tnfrii、epiregulin、ip-10,serpina3、tnfa的含量。并根据上述线性回归方程计算得到的浓度，如表3所示。表3分别计算健康者和潜伏性结核患者的shbg、il-2、il-6、il-8、tnfrii、epiregulin、ip-10,serpina3、tnfa表达量的平均值，计算p值，如表4所示。表4健康者和潜伏性结核患者各蛋白表达量的平均值可见，健康者和潜伏性结核患者的shbg、il2、il-6、tnfrii、epiregulin、ip-10、serpina3、tnfa表达量具有生物学差异。用于检测shbg、il2、il-6、il8、tnfrii、epiregulin、ip-10、serpina3和tnfa细胞因子的各组抗体配对检测实验结果如下：表5如表5所示，shbg包被抗体与tnfrii和ip-10抗体有交叉反应；tnfa与serpina3和epiregulin有交叉反应，il8抗体与结合潜伏感染的相关性较低，且抗体对间没能配对成功，均不适用于联合应用检测。综上所述，最终选用白细胞介素-6(il-6)、肿瘤坏死因子受体ii(tnfrii)、表皮调节素(epiregulin)、干扰素诱导蛋白10(ip-10)这四组抗体对组成芯片用于检测。实施例2用于结核潜伏感染诊断的蛋白芯片试剂盒的制备为了检测样品中是否存在本发明中的4种蛋白，制备固定有针对于如下4种蛋白的特异性抗体的玻片：白细胞介素-6(il-6)、肿瘤坏死因子受体ii(tnfrii)、表皮调节素(epiregulin)、干扰素诱导蛋白10(ip-10)。1、抗体的来源采用针对白细胞介素-6(il-6)、肿瘤坏死因子受体ii(tnfrii)、表皮调节素(epiregulin)、干扰素诱导蛋白10(ip-10)的特异性蛋白相对应的捕获抗体和检测抗体的用途、来源、浓度均在表6详细说明。其中，捕获抗体和检测抗体分别识别蛋白质的不同表位。对检测抗体进行生物素标记，具体方法如下：将待标记的检测抗体在大量的1×pbs缓冲液(1毫升抗体在1升的pbs)中透析三次，每次至少6小时。测定抗体浓度后按每毫克抗体加入80微克生物素dmso溶液，混匀，在室温下反应4小时。用pbs溶液对生物素标记的抗体进行透析，去除游离的生物素并标定生物素标记的检测抗体浓度。表6特异性抗体名称，抗体的用途、来源、浓度信息2、蛋白芯片的制备与保存(1)、捕获抗体的点样浓度确定：将捕获抗体在不同的缓冲液中(无菌水，pbs缓冲液，含不同浓度牛白蛋白的pbs，含不同浓度甘油的pbs缓冲液等)以2×的浓度稀释，用非接触性点样仪点在芯片表面，然后用夹心elisa方法比较它的活性和稳定性。实验表明，用含有0.01-10g/100ml牛白蛋白pbs缓冲液稀释捕获抗体具有最好的线性率和稳定性。(2)、点样的条件控制：在室温下把捕获抗体直接点在玻片表面时，捕获抗体的点容易产生空心点，而且不同抗体点活性差异较大，并且在最后生成的图像往往发现会有拖尾现象。本发明控制点样温度为70-75f，湿度为40-45％时所点的抗体点具有最好的形状，并且发现将点样好的玻片放于室温条件下静置过夜，第二天真空抽气干燥2小时，然后把整张芯片用不透气的小袋封装，用这种方法制备的玻片捕获抗体具有最佳的活性并且可以在4℃至少稳定六个月以上。(3)、点样：将100-1000pl的含0.02-2ng的特异性的抗体的pbs缓冲液(含有0.01-10g/100ml牛白蛋白)，采用上述点样条件，用全自动点样仪点样于玻片上。生物素标记的牛igg作为阳性对照。每种抗体在每个芯片中都有4次的重复和两种不同浓度的阳性对照在每个芯片中都有4次的重复。将点样好的玻片放于室温条件下静置过夜，然后在干燥器中抽气干燥2小时。干燥后的玻片装上配套的16孔框架把一张玻片分割成16个互不干扰的小区。用粘性膜封闭框架后，把整张芯片用不透气的小袋封装后于2℃到8℃保存备用。3、检测的蛋白标准品的来源:采用针对表7中所列重组蛋白质的名称及来源均在表2详细说明：表7蛋白标准品中重组蛋白的名称，来源重组蛋白名称来源货号白细胞介素-6(il-6)raybiotech230-00011肿瘤坏死因子受体ii(tnfrii)raybiotech228-20264表皮调节素(epiregulin)raybiotech230-10130干扰素诱导蛋白10(ip-10)raybiotech230-00211将以上各个重组蛋白质用含0.1％小牛白蛋白的磷酸缓冲液稀释后按照一定的量混合在一起，分装后用冷冻干燥法干燥并于-80℃保存。实施例3用蛋白芯片定量检测的血上清中4种蛋白表达水平1、外周血上清的收集1.1肝素抗凝静脉血250ml，2000转/分离心5分钟，抽取上清，备用。2、玻片芯片的完全干燥将玻片芯片从盒子中取出来，在室温平衡20-30min后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1-2小时。3、蛋白标准品的梯度稀释3.1添加500μl的样品稀释液(ph值为7.2，含有5％质量百分比的右旋糖酐、1％质量百分比的甘氨酸、5mm的tris缓冲液)到标准品混合物的小管中，重新溶解标准品。打开小管前，先快速地离心，轻轻地上下抽打溶解粉末，标记这个小管为std1。3.2分别标记6个干净的离心管为std2、std3到std7，添加200μl的样品稀释液到每个小管中。3.3抽取100μl的std1加入到std2中轻轻混合，然后从std2中抽取100μl加入到std3中，如此梯度稀释至std7。3.4抽取100μl的样品稀释液到另一个新的离心管中，标记为cntrl，作为阴性对照。注：因为每种蛋白的起始浓度是不同的，所以std1到std7的梯度稀释后，每个蛋白系列浓度是不同的。本实施例中，梯度重组蛋白稀释液的浓度如表8所示。表8经梯度稀释后用于做标准曲线的重组蛋白标准品的浓度如下所示蛋白名称对照std1std2std3std4std5std6std7单位il-602000667222742583pg/mltnfrii040000133334444148149416555pg/mlepiregulin0400000133333444441481549381646549pg/mlip-10010000333311113701234114pg/ml4、芯片操作流程4.1每个孔中加100μl的样品稀释液，室温摇床上孵育30分钟，封闭定量蛋白芯片。4.2抽去每个孔中的样品稀释液，添加100μl的标准液和样品到孔中，在摇床上4℃过夜孵育。样本为静脉采血后自然析出的血清，使用前用样品用稀释液1:1稀释。4.3清洗抽去每个孔中的标准品或样品，1×洗液i清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液i，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗液i。抽去每个孔中的1×洗液i，加入1×洗液ii清洗2次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液ii，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗液ii。4.4检测抗体混合液的孵育离心检测抗体混合液小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的检测抗体到每个孔中，室温摇床上孵育2小时。4.5清洗抽去每个孔中的检测抗体，1×洗液i清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液i，每次清洗要抽干净洗液，然后加入1×洗液ii清洗2次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液ii，每次清洗要抽干净洗液。4.6cy3-链霉亲和素的孵育离心cy3-链霉亲和素小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的cy3-链霉亲和素到每个孔中，用铝箔纸包住玻片避光孵育，室温摇床上孵育1个小时。4.7清洗抽去每个孔中的cy3-链霉亲和素，1×洗液i清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液i，每次清洗要抽干净洗液。4.8荧光检测i)将玻片框架拆掉，小心不要用手接触到玻片印制抗体的一面。2)将玻片放置在玻片清洗管中，添加约30ml的1×洗液i，能整个覆盖住玻片，在室温摇床上震荡15min，弃去1×洗液i，添加约30ml的1×洗液ii，在室温摇床上震荡5min。3)去除玻片的残留洗液。将玻片放置在玻片清洗管/干燥管中，不盖盖子，在1000rpm离心3min。4)采用激光扫描仪例如innopsys扫描信号，采用cy3或者绿色通道(激发频率＝532nm)。4.9芯片的数据提取以及用分析软件来进行数据分析。1)用mapix软件来读取生物芯片的荧光值。芯片的微阵列参数用3(行)×8(列)，点的直径用120μm。2)读数后选用的数值为除掉地方背景的中间值读数(f532median-localbackground)。用特定的定量芯片计算软件qah-cust-sw来做每个重组蛋白的标准曲线。在计算不同样血上清中不同蛋白的浓度前使用每个芯片上相同的两个阳性对照点做参照系进行数据的标准化处理。两个阳性对照的信号值大约相差4倍。标准化处理步骤如下：先计算出每个微阵列的阳性对照信号值pos＝(posl+4×pos2)/2；其中pos1为第一浓度的阳性对照的信号值，pos2为第二浓度的阳性对照的信号值；然后再用阳性对照信号值pos对所有的数据进行标准化处理：校正值＝(原先值×样品平均信号值posave)/阳性对照信号值pos。样品平均信号值posave为微阵列内所有样品的平均信号值。实施例4对实施例3定量检测血的上清中4种蛋白的实验数据处理1、通过标准曲线计算每个样本中4种蛋白的浓度以一次临床血清样品实验结果为例，八个标准样品的荧光读数分别如表9所示。表9三倍梯度稀释的标准品突光读数(f532median-localbackground)以epiregulin为例，根据表8和表9的信息得知epiregulin的蛋白浓度和荧光信号间的关系如下表所示。表10epiregulin的蛋白浓度和荧光信号间的关系由表10绘制标准曲线，计算得r2＝0.8589。回归方程为y＝0.3176x+12020被测1号样品(1-1)，信号强度为4255，计算出epiregulin含量为13371.388pg/ml。2、检测结果的判断各样本中的蛋白的浓度检测根据上述的方式处理数据后，得到的每个样本中4个蛋白的检测浓度，通过r语言算法包kernlab，建立机器学习模型支持向量机(svm)，并判读该样本的类型。判读样本的类型。判断标准为：当r>0.23时，则判断为结核感染。反之，则为健康对照。实施例5分辨结核潜伏感染的敏感性和特异性为了检验试剂盒检测在分辨结核潜伏感染者的效能，采用本发明实施例2制备的试剂盒检测了不同的临床样品，判断其在分辨结核潜伏感染的敏感性和特异性。分别收集临床上确诊为健康对照hc(63例)和潜伏性结核感染患者ltbi(21例)，分收集外周血血清，分别利用试剂盒检测4个蛋白的表达水平，检测方法和数据处理方法参见实施例3-实施例4。代入svm模型后计算出各样本的结果及判断结果，结果数值大于0.23诊断为ltbi。结果显示利用本试剂盒检测63例hc中，57例判断为hc，真阳性率为90％，说明本发现的蛋白芯片检测方法很好的敏感性；检测的21例ltbi中，20例判断为ltbi，假阳性率为5.24％，说明本发现的蛋白芯片检测方法很好的特异性。表11不同类型临床样本检测结果综上所述，本发明公开了一种用结核潜伏感染诊断的蛋白芯片试剂盒。该试剂盒使用标准组织玻片作为表面载体，可以在玻片表面完成多重夹心elisa的反应。开发的结核潜伏感染诊断蛋白芯片诊断试剂盒可以在一张蛋白芯片上同时检测4种蛋白。该试剂盒检测4种蛋白的灵敏度和特异性可以达到单因子elisa的水平。并将4种蛋白组合，研发得到了一种灵敏度高、特异性好的可以用于诊断结核潜伏感染者的蛋白芯片诊断试剂盒。这种试剂盒适用于从人外周血中检测多个特异性蛋白的表达，从而用于结核潜伏感染的早期诊断及健康人群的筛查。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12