一种去泛素化酶的活性检测方法与流程

本发明属于去泛素化酶技术领域，具体涉及一种去泛素化酶的活性检测方法。

背景技术：

去泛素化酶是一类数量很大的蛋白酶，在许多筛选实验室中，目前使用二十年前建立的基于稳态荧光的测定方法测量去泛素化酶的活性。该方法使用的荧光底物，例如7-氨基-4-甲基香豆素标记泛素蛋白(ub-amc)，或罗丹明110标记泛素蛋白(ub-rho)。这些底物被各种去泛素化酶有效裂解或水解，释放出高度荧光的部分。该测定已用于各种去泛素化抑制剂筛选，例如用于鉴定usp1和usp7抑制剂。

有一个显著的缺点，特别是对于ub-amc，是它们易于受到许多小分子表现出的荧光所干扰；另外，由于这些底物中泛素与荧光基团的连接与生理条件下形成的泛素结合物中的异肽键结构差异较大，以至于很多去泛素化酶对它们的识别和处理速率非常慢，从而大大降低了该测量方法的灵敏度和实验数据的可靠性的问题，为此我们提出一种去泛素化酶的活性检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种去泛素化酶的活性检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种去泛素化酶的活性检测方法，包括以下步骤：

s1、将去泛素化酶，底物和反应缓冲液置于冰上解冻，将荧光素检测试剂置于室温，避光；

s2、配制含有10mmdtt的1x反应缓冲液，并以含有10mmdtt的1x反应缓冲液分别配制去泛素化酶工作溶液与底物工作溶液；

s3、在白色96孔板中，加入以下体积组分以获得20ul的总反应体积的混合液：a-10ul1x反应缓冲液；b-5ul去泛素化酶工作溶液；c-5ul底物工作溶液；

s4、将白色96孔板稍作离心使各组分溶液聚集到孔底充分混匀，将s3所得混合液反应置于室温孵育25-35分钟；

s5、在白色96孔板每孔中加入20ul荧光素检测试剂，然后将白色96孔板置于摇床上摇晃2分钟,之后将白色96孔板置于室温继续孵育30分钟；

s6、读盘，记录每孔的发光值。

优选的，所述底物为氨基荧光素标记泛素(ub-aml)，且所述底物浓度为0.6um。

优选的，所述s2中含有10mmdtt的1x反应缓冲液是在s1中解冻后的反应缓冲液的基础上进行稀释得到。

优选的，所述去泛素化酶包括半胱氨酸和金属蛋白酶类别的所有六个去泛素化酶家族。

优选的，所述s2中去泛素化酶工作溶液与底物工作溶液均通过将含有10mmdtt的1x反应缓冲液分别倒入盛有去泛素化酶与底物的玻璃器皿中制得。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明中，通过将氨基荧光素标记泛素(ub-aml)，作为去泛素化酶的底物，去泛素化的催化作用从底物中释放出一种叫做氨基荧光素(aml)的小分子，它在atp和mgcl2存在下与重组荧光素酶反应产生明亮的发光，与传统荧光分析法相比，本发明中的化学发光方法表现出更宽的线性范围，更高的灵敏度和更低的检测限，因此能获得更高可靠性的检测数据；在获得同等结果的前提下，通过氨基荧光素标记泛素(ub-aml)作为发光底物所需要的酶量，低于传统荧光法所需酶量几百甚至几千倍，从而极大的降低了高通量药物筛选的成本。

附图说明

图1为本发明的去泛素化酶的活性检测结果曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本发明提供一种技术方案：一种去泛素化酶的活性检测方法，包括以下步骤：

s1、将去泛素化酶，底物和反应缓冲液置于冰上解冻，将荧光素检测试剂置于室温，避光；

s2、配制含有10mmdtt的1x反应缓冲液，并以含有10mmdtt的1x反应缓冲液分别配制去泛素化酶工作溶液与底物工作溶液；

s3、在白色96孔板中，加入以下体积组分以获得20ul的总反应体积的混合液：a-10ul1x反应缓冲液；b-5ul去泛素化酶工作溶液；c-5ul底物工作溶液，如果做高通量筛选，需要将去泛素化酶与待筛选化合物预先孵育15分钟；

s4、将白色96孔板稍作离心使各组分溶液聚集到孔底充分混匀，将s3所得混合液反应置于室温孵育25分钟；

s5、在白色96孔板每孔中加入20ul荧光素检测试剂，然后将白色96孔板置于摇床上摇晃2分钟,之后将白色96孔板置于室温继续孵育30分钟；

s6、读盘，记录每孔的发光值。

其中，底物为氨基荧光素标记泛素(ub-aml)，且底物浓度为0.6um。

其中，s2中含有10mmdtt的1x反应缓冲液是在s1中解冻后的反应缓冲液的基础上进行稀释得到。

其中，去泛素化酶包括半胱氨酸和金属蛋白酶类别的所有六个去泛素化酶家族。

其中，s2中去泛素化酶工作溶液与底物工作溶液均通过将含有10mmdtt的1x反应缓冲液分别倒入盛有去泛素化酶与底物的玻璃器皿中制得。

实施例2

本发明提供一种技术方案：一种去泛素化酶的活性检测方法，包括以下步骤：

s1、将去泛素化酶，底物和反应缓冲液置于冰上解冻，将荧光素检测试剂置于室温，避光；

s2、配制含有10mmdtt的1x反应缓冲液，并以含有10mmdtt的1x反应缓冲液分别配制去泛素化酶工作溶液与底物工作溶液；

s3、在白色96孔板中，加入以下体积组分以获得20ul的总反应体积的混合液：a-10ul1x反应缓冲液；b-5ul去泛素化酶工作溶液；c-5ul底物工作溶液，如果做高通量筛选，需要将去泛素化酶与待筛选化合物预先孵育15分钟；

s4、将白色96孔板稍作离心使各组分溶液聚集到孔底充分混匀，将s3所得混合液反应置于室温孵育30分钟；

s5、在白色96孔板每孔中加入20ul荧光素检测试剂，然后将白色96孔板置于摇床上摇晃2分钟,之后将白色96孔板置于室温继续孵育30分钟；

s6、读盘，记录每孔的发光值。

其中，底物为氨基荧光素标记泛素(ub-aml)，且底物浓度为0.6um。

其中，s2中含有10mmdtt的1x反应缓冲液是在s1中解冻后的反应缓冲液的基础上进行稀释得到。

其中，去泛素化酶包括半胱氨酸和金属蛋白酶类别的所有六个去泛素化酶家族。

其中，s2中去泛素化酶工作溶液与底物工作溶液均通过将含有10mmdtt的1x反应缓冲液分别倒入盛有去泛素化酶与底物的玻璃器皿中制得。

实施例3

本发明提供一种技术方案：一种去泛素化酶的活性检测方法，包括以下步骤：

s1、将去泛素化酶，底物和反应缓冲液置于冰上解冻，将荧光素检测试剂置于室温，避光；

s2、配制含有10mmdtt的1x反应缓冲液，并以含有10mmdtt的1x反应缓冲液分别配制去泛素化酶工作溶液与底物工作溶液；

s3、在白色96孔板中，加入以下体积组分以获得20ul的总反应体积的混合液：a-10ul1x反应缓冲液；b-5ul去泛素化酶工作溶液；c-5ul底物工作溶液，如果做高通量筛选，需要将去泛素化酶与待筛选化合物预先孵育15分钟；

s4、将白色96孔板稍作离心使各组分溶液聚集到孔底充分混匀，将s3所得混合液反应置于室温孵育35分钟；

s5、在白色96孔板每孔中加入20ul荧光素检测试剂，然后将白色96孔板置于摇床上摇晃2分钟,之后将白色96孔板置于室温继续孵育30分钟；

s6、读盘，记录每孔的发光值。

其中，底物为氨基荧光素标记泛素(ub-aml)，且底物浓度为0.6um。

其中，s2中含有10mmdtt的1x反应缓冲液是在s1中解冻后的反应缓冲液的基础上进行稀释得到。

其中，去泛素化酶包括半胱氨酸和金属蛋白酶类别的所有六个去泛素化酶家族。

其中，s2中去泛素化酶工作溶液与底物工作溶液均通过将含有10mmdtt的1x反应缓冲液分别倒入盛有去泛素化酶与底物的玻璃器皿中制得。

按照实施例1,2,3所述的去泛素化酶的活性检测方法对不同酶量分别作活性检测，得到的发光强度均值如下表：

与本表对应的曲线图见图1；

由此可知本发明中的化学发光方法表现出更宽的线性范围，更高的灵敏度和更低的检测限，因此能获得更高可靠性的检测数据；在获得同等结果的前提下，将氨基荧光素标记泛素(ub-aml)，作为去泛素化酶的底物所需要的酶量，低于传统荧光法所需酶量几百甚至几千倍，从而极大的降低了高通量药物筛选的成本。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。