一种基于ICP-MS快速测定厌氧氨氧化污泥活性的方法与流程

本发明涉及一种基于电感耦合等离子体质谱法快速测定厌氧氨氧化污泥活性的方法，适用于市政污水、工业废水等厌氧氨氧化生物脱氮工程。

背景技术：

随着我国经济的快速发展，由氮磷引起的水体富营养化问题日益严重，导致城市河湖及水库水体环境质量日益恶化。污水处理厂作为氮磷削减的重要组成单元，是实现水体环境不被进一步破坏的重要保证。据统计，2010年我国各城市共有污水处理厂2630座，污水的日处理量可达到1.22亿m³，城市污水处理率已达到73％。但是城市污水处理是一种高能耗的产业之一，处理每吨污水电耗约为0.2～0.3kwh/m³，总能耗约占全社会用电量的0.3％。另外，当前我国城市污水处理厂普遍面临进水碳源不足的问题，常常需要投加大量的化学药剂(如甲醇、乙酸钠等碳源)强化反硝化脱氮。随着国家对排放标准的进一步提高，污水处理厂的能耗占比和化学药剂的投加也会不断提高。高能耗造成污水处理运营成本高，同时也加剧了我国现阶段的能源危机。因此，节能降耗是污水处理行业迫切需要解决的问题。

近年来，新型生物脱氮工艺厌氧氨氧化法的出现，弥补了传统硝化-反硝化工艺的缺陷，提高了脱氮效率和经济性。厌氧氨氧化(anammox)作为一种以nh4⁺为电子供体，no2^-为电子受体，依靠无机碳源自养，最终产生n2的生化反应(式1)，相比传统的硝化反硝化工艺具有很大的优势，如无需碳源，节省62.5％曝气量和50％耗碱量，污泥产率低，氮素去除效率高等，是迄今为止最经济高效的污水脱氮工艺。因此厌氧氨氧化工艺是实现我国污水处理厂节能降耗的重要技术手段。

nh4⁺+1.32no2^-+0.066hco3^-+0.13h⁺→0.066ch2o0.5n0.15+1.02n2

+0.26no3^-+2.03h2o(式1)

然而，厌氧氨氧化菌属慢速生长型自养微生物，细胞产率低(0.08～0.11gvss/gnh4⁺-n)，世代时间长达10～25天，对环境条件敏感，富集培养困难。由于接种物缺乏和富集培养难，导致厌氧氨氧化工艺启动十分缓慢，世界上第一个生产性装置的启动时间长达3.5年，使其工程应用面临巨大的挑战。接种厌氧产甲烷污泥后，厌氧氨氧化工艺整个启动过程一般分为菌体水解期、活性迟滞期、活性提高期和稳定运行期四个阶段。在每个阶段，工作人员都需要时刻关注反应器内厌氧氨氧化污泥的活性，以便对工艺流程进行及时调整。此外，厌氧氨氧化反应器顺利启动后，为了污水的有效处理和达标排放，污水处理厂管理和操作人员需要时刻监控和及时判断影响厌氧氨氧化过程异常的原因，以便对工厂设施进行必要的调整，保证厌氧氨氧化过程的正常运行，保证污水的达标排放。

厌氧氨氧化污泥活性直接反应厌氧氨氧化反应器的运行状况，是厌氧氨氧化生物脱氮过程监控的良好指标。但是，目前用于表征厌氧氨氧化污泥活性的方法较少，主要采用基于生物指标的方法检测，如污泥脱氢酶活性dha和比厌氧氨氧化活性(specificanammoxactivaty，saa)等。但目前这两种检测方法操作复杂，操作人员需要一定的专业技能，检测时间过长，而且因不同时期所采污泥样品含水率差异导致测得的生化数据可比性较差。因此，针对厌氧氨氧化工艺脱氮效果和污水处理厂设备工作效率的常规检测，建立一种简单、快捷、高效、精确的厌氧氨氧化污泥活性检测方法显得尤为重要。

在厌氧氨氧化活性污泥中，由于厌氧氨氧化菌含有丰富的血红素(heme),当其成为优势菌群时，成熟的厌氧氨氧化污泥呈现深红色。血红素是厌氧氨氧化菌将no2^-和nh4⁺转化为n2的关键酶的重要辅基，其中羟胺氧化酶(hao)含有14～26个血红素，联氨氧化酶(hzo)含有8～16个血红素，联氨水解酶(hzs)含有1个血红素的细胞色素c。

目前，血红素的传统测定方法主要以吡啶血红素分光光度法为主。在碱性条件下，血色素结合的蛋白质的氮配位体被吡啶代替，由于吡啶血红素具有特征光谱，通过分光光度计扫描分别获取550nm(波峰)和535nm(波谷)处的吸光值，通过式2计算血红素浓度。然而吡啶血红素分光光度法在测定过程中容易受其它成分干扰，主要干扰因素是血红素颜色不稳定，容易被氧化发生褐变，导致测定值一般有偏离。此外，吡啶血红素分光光度法所用试剂具有很强的生物毒性，对实验原料的收集、保存条件具有明显的限制，不适用于常规生产测定。专利cn107356567a公开了一种从厌氧氨氧化污泥中提取和测定亚铁血红素的方法，采用荧光光度计测定提取液中亚铁血红素的荧光强度，并根据标准曲线计算得出样品溶液的血红素浓度。该方法的灵敏度比吡啶血红素分光光度法高，可用于微量甚至痕量血红素的定量分析，但由于荧光的光强不高导致呈线性情况不理想，并且荧光持续的时间较短，容易受干扰离子的影响。

hemec(mmol/l)＝(abs550-abs535)/23.97(式2)

血红素由卟啉和一分子铁构成铁卟啉化合物，分子式c34h30fen4o4，相对分子质量为614.48(图1)。铁原子位于卟啉环的中央，具有共轭结构，性质稳定。因此，本发明为了解决现有技术中的问题，通过电感耦合等离子体质谱仪(icp-ms)测出厌氧氨氧化污泥血红素提取液中铁的浓度，从而推算出相当的血红素量。普遍认为，血红素浓度与厌氧氨氧化污泥的脱氮性能呈正相关关系，能直接反应厌氧氨氧化污泥的活性，故可通过测得厌氧氨氧化污泥血红素的浓度来表征厌氧氨氧化污泥的活性。本方法建立了一种简单、高效、安全无污染的厌氧氨氧化污泥活性检测方法，适用于厌氧氨氧化工艺脱氮效果和污水处理厂设备工作效率的常规检测。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决现有技术中厌氧氨氧化污泥活性检测中存在的准确性不高、耗时过长等问题，并提供了一种厌氧氨氧化污泥活性的快速检测方法，开发了一种基于电感耦合等离子体质谱仪测定污泥血红素提取液中铁元素浓度来表征厌氧氨氧化污泥活性的手段。icp-ms自动化程度高，样品分析速度快(2～3分钟/样品)，可快速准确定量厌氧氨氧化污泥的活性，厌氧氨氧化污泥活性可用于监控厌氧氨氧化生物脱氮工艺运行的状况、判断厌氧氨氧化反应器发生异常的原因，并能及时采取正确的工程控制措施，保证脱氮工艺的正常有效运行。

为达到上述目的，本发明具体采用的技术方案如下：

一种基于icp-ms快速测定厌氧氨氧化污泥活性的方法，其包括以下步骤：

p1.采集待测定的厌氧氨氧化污泥样品；

p2.针对采集所得厌氧氨氧化污泥样品，定量取泥水混合液置于离心管中，加入edta溶液解析污泥外表面吸附的铁离子，离心去除上清液得到无杂质污泥；

p3.定量称取所述的无杂质污泥，并加入醋酸盐缓冲液充分搅拌匀浆后，用醋酸盐缓冲液准确定容；所得悬浮溶液用超声波细胞破碎仪进行厌氧氨氧化细菌超声破碎，然后离心所得上清液即为血红素溶液；

p4.采用电感耦合等离子体质谱法测定血红素提取液中元素铁的浓度，然后根据铁浓度与拟合曲线计算污泥样品中的比厌氧氨氧化活性saa，以表征厌氧氨氧化污泥活性。

作为优选，步骤p1中未及时测量的样品存放于离心管中，置于4℃冰箱中保存。

作为优选，步骤p2所述离心的离心力为6000～8000rpm，离心时间为10～15min。

作为优选，步骤p2中每次取泥水混合液50ml，置于100ml离心管中，加入0.05mol/ledta溶液20ml解析污泥外表面吸附的铁离子。

作为优选，步骤p3所述醋酸盐缓冲液配制方法：取醋酸铵125g，加水125ml溶解后，加7mol/l盐酸溶液190ml，用2mol/l盐酸溶液或5mol/l氨溶液准确调节ph值至3.5，用水稀释至500ml。

进一步的，所述醋酸盐缓冲液配制过程中，通过电位滴定法确定2mol/l盐酸溶液或5mol/l氨溶液的滴定终点。

作为优选，步骤p3中,每次准确称取2.0g厌氧氨氧化污泥置于50ml烧杯中，加入20mlph3.5的醋酸盐缓冲液，用玻璃棒充分搅拌匀浆后用醋酸盐缓冲液准确定容至50ml。

作为优选，步骤p3所述离心的离心力为15000rpm，离心时间为20min。

作为优选，步骤p3所述超声波细胞破碎仪功率为900～1000w，工作时长30秒。

作为优选，步骤p4所述的拟合曲线为厌氧氨氧化污泥的血红素提取液中铁含量与比厌氧氨氧化活性saa的拟合曲线，且拟合曲线的形式为f＝y0+a*exp(b*x)，其中f表示比厌氧氨氧化活性saa，x表示厌氧氨氧化污泥的血红素提取液中铁含量，y0、a、b分别为拟合参数。

优选地，icp-ms法测定血红素溶液中元素铁的浓度的测定步骤如下：

p4-1.确定电感耦合等离子体质谱仪(其例如agilent的型号为7500aicp-ms仪)的工作条件

p4-2.铁标准溶液的配制：将1000μg/ml铁标准应用液用0.1mol/l硝酸溶液稀释成10μg/ml，再分别稀释成0、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00μg/ml的标准系列。放入50ml离心管中，4℃冰箱保存。

p4-3.铁标准曲线的测定：样品测试管中加入标准系列的储备液各4ml，将测试管放入自动采样盘，编辑采样序列后点击采样按钮进行自动采样分析。待所有标准样品测试完成后，仪器自动计算出拟合的标准曲线。

p4-4.样品溶液的测定：样品测定方法跟步骤同p4-3标准溶液，待样品测试完成后仪器根据拟合的标准曲线计算出样品中铁元素的浓度。

所述基于电感耦合等离子体质谱快速测定厌氧氨氧化污泥活性的方法较传统生物表征污泥活性方法相比，具有如下优点：

本发明提供的基于电感耦合等离子体质谱快速测定厌氧氨氧化污泥活性的方法能成功从厌氧氨氧化污泥颗粒中提取血红素，通过超声波细胞破碎仪对污泥进行细胞破碎后用醋酸盐缓冲液提取，高速离心下得到血红素溶液，提取简单快捷，效果稳定，解决了目前微生物体内血红素含量低、提取困难等诸多问题。电感耦合等离子体质谱法具有极低的检出限和宽达七个数量级的线性动态范围，能够准确测定溶液中痕量铁元素含量，具有分析快速，抗干扰能力强等诸多优点。本方法通过icp-ms测定血红素中铁元素的含量，从而准确推算出相当的血红素含量，克服了传统吡啶血红素分光光度法在测定过程中血红素容易被氧化发生褐变而导致测定值偏离、所用试剂具有极强的生物毒性、对实验原料的收集保存条件苛刻等弊端，且测定结果比较可靠，完全可以满足日常科研和生产中厌氧氨氧化污泥血红素含量的测定。

进一步，普遍认为，血红素浓度与厌氧氨氧化污泥的脱氮性能呈正相关关系，能直接反应厌氧氨氧化污泥的活性。本发明首次将电感耦合等离子体质谱(icp-ms)用于快速检测厌氧氨氧化污泥活性，通过测定样品中厌氧氨氧化污泥的血红素浓度，探索出一种简单快速的精确定量厌氧氨氧化污泥活性的方法。该方法和目前的生物学方法(dha和saa)比较，克服了现有方法操作复杂、检测时间过长等不足，特点是快速(可以在1小时内完成)，检测结果准确。厌氧氨氧化污泥活性可用于监控厌氧氨氧化生物脱氮工艺运行的状况、判断厌氧氨氧化反应器发生异常的原因，并能及时采取正确的工程控制措施，保证脱氮工艺的正常有效运行。

附图说明

图1为血红素分子结构示意图；

图2为厌氧氨氧化污泥的血红素提取液中铁含量与污泥脱氢酶活性dha和比厌氧氨氧化活性saa的拟合曲线。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

本发明所述的一种基于电感耦合等离子体质谱法快速测定厌氧氨氧化污泥活性的方法，其具体步骤：

p1.污水处理厂厌氧氨氧化污泥样品采集和保藏：在厌氧氨氧化反应器取样口进行采样，样品存入广口玻璃瓶中。未及时测量的样品存放于离心管中，置于4℃冰箱中保存。

p2.污泥样品泥水分离：针对采集所得厌氧氨氧化污泥，取泥水混合液50ml，置于100ml离心管中，加入0.05mol/ledta溶液20ml解析污泥外表面吸附的铁离子，于6000～8000rpm下离心10～15min，去除上清液得到无杂质污泥。

p3.污泥血红素提取：准确称取2.0g厌氧氨氧化污泥置于50ml烧杯中，加入20ml醋酸盐缓冲液(ph3.5)，用玻璃棒充分搅拌匀浆后用醋酸盐缓冲液准确定容至50ml。所得悬浮溶液用超声波细胞破碎仪进行厌氧氨氧化细菌超声破碎(超声波细胞破碎仪功率为900～1000w，工作时长30秒)，然后在15000rpm的条件下离心20min，所得上清液即为血红素溶液。

其中，醋酸盐缓冲液(ph3.5)配制方法如下：取醋酸铵125g，加水125ml溶解后，加7mol/l盐酸溶液190ml，用2mol/l盐酸溶液或5mol/l氨溶液准确调节ph值至3.5(采用电位滴定法确定滴定终点)，用水稀释至500ml。icp-ms进样系统采用石英雾化器，耐酸不耐碱，故用醋酸盐缓冲液提取的血红素溶液可直接用于icp-ms测定。

p4.测定血红素溶液中元素铁的浓度(icp-ms法)：

采用电感耦合等离子体质谱法测定血红素提取液中元素铁的浓度，然后根据铁浓度与拟合曲线计算污泥样品中的比厌氧氨氧化活性saa，以表征厌氧氨氧化污泥活性。

电感耦合等离子体质谱法是20世纪80年代发展起来的新的分析测试技术，具有极低的检出限和宽达七个数量级的线性动态范围，能够准确测定溶液中痕量铁元素含量，具有分析快速，抗干扰能力强等诸多优点。本发明中，icp-ms法测定血红素溶液中元素铁的浓度的具体步骤如下：

p4-1.确定电感耦合等离子体质谱仪(其例如agilent的型号为7500aicp-ms仪)的工作条件

p4-2.铁标准溶液的配制：将1000μg/ml铁标准应用液用0.1mol/l硝酸溶液稀释成10μg/ml，再分别稀释成0、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00μg/ml的标准系列。放入50ml离心管中，4℃冰箱保存。

p4-3.铁标准曲线的测定：样品测试管中加入标准系列的储备液各4ml，将测试管放入自动采样盘，编辑采样序列后点击采样按钮进行自动采样分析。待所有标准样品测试完成后，仪器自动计算出拟合的标准曲线。

p4-4.样品溶液的测定：样品测定方法跟步骤同p4-3标准溶液，待样品测试完成后仪器根据拟合的铁标准曲线计算出样品中铁元素的浓度。

p4-5.污泥样品比厌氧氨氧化活性计算：血红素提取液中元素铁的浓度与污泥样品中的比厌氧氨氧化活性saa存在相关关系，因此可以预先建立厌氧氨氧化污泥的血红素提取液中铁含量与比厌氧氨氧化活性saa的拟合曲线，即saa-铁浓度拟合曲线，然后根据测得的铁浓度以及saa-铁浓度拟合曲线计算污泥样品中的saa，以此表征厌氧氨氧化污泥活性。

saa-铁浓度拟合曲线的形式为指数方程f＝y0+a*exp(b*x)，其中f表示比厌氧氨氧化活性saa，x表示厌氧氨氧化污泥的血红素提取液中铁含量，y0、a、b分别为拟合参数，可以通过样本参数拟合获得。

下面对上述基于电感耦合等离子体质谱法快速测定厌氧氨氧化污泥活性的方法的可靠性进行检测：

准确称取经105℃干燥至恒重的血红素标准品(casno15489-90-4，sigma-aldrich公司)10.00mg，用0.1mol/l氢氧化钠充分溶解并定容至100ml容量瓶中作为标准品储备液。吸取此储备液10ml加于100ml容量瓶中，加入0.1mol/l氢氧化钠定容至刻度，摇匀，配成10μg/ml的标准使用液。再利用0.1mol/l氢氧化钠将标准使用液分别稀释成0.0μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/ml、6.0μg/ml、8.0μg/ml浓度的标准供试溶液。

吡啶分光光度法：取标准供试溶液4ml，一组加入0.5ml吡啶溶液形成氧化血红素，另一组加入0.5ml吡啶溶液及3mg连二亚硫酸钠晶体形成还原血红素，最后用0.1mol/l氢氧化钠定容至5ml，分别于535nm和550nm处测定氧化血红素跟还原血红素的吸光值，最后以还原血红素与氧化血红素的吸光度差值绘制血红素浓度-吸光度标准曲线。

荧光光谱法：取0.5ml标准供试溶液，分别加入5ml饱和草酸溶液(2mol/l)，100℃下加热30min后用荧光光谱仪测定。光谱仪激发波长为240nm，在660nm处记录标准溶液的荧光强度，最后以血红素的荧光强度绘制血红素浓度-荧光强度标准曲线。

电感耦合等离子体质谱法：取4ml标准供试溶液，加入0.5ml硝酸溶液(1mol/l)调节ph值后用去离子水定容至5ml，然后放入自动进样器进行铁元素含量icp-ms测定，最后以测得的铁含量绘制血红素浓度-铁浓度标准曲线。

为了确定污水中干扰物质对血红素测定的影响，采用污水处理厂原水水样，经过0.45μm滤膜过滤，分三组每组6个样品，每个样品取4ml污水，加入4ml醋酸盐缓冲液(ph3.5)，每组分别加入0、0.15、0.3、0.55、0.8、1ml血红素标准储备液(100μg/ml)，然后用氢氧化钠/硝酸调整适宜ph值并用水定容至10ml。分别采用以上三种方法测定样品中的血红素浓度，重复三次测定结果见表1。从表中数据可知，本发明中所使用电感耦合等离子体质谱法测定血红素的方法是可靠的，准确性优于吡啶分光光度法和荧光光谱法。在以后的检测中，均可使用icp-ms来测定厌氧氨氧化污泥中的血红素含量。

表1三种方法测定原污水中添加血红素的回收率

下面将上述基于电感耦合等离子体质谱法快速测定厌氧氨氧化污泥活性的方法应用至实施例中，对实际样品进行检测，以便于本领域技术人员更好地理解其效果。

实施例

对某实验室中新接种厌氧氨氧化污泥的egsb反应器不同时期的厌氧氨氧化污泥进行采样分析，取样时间为反应器接种后第0、28、65、102、120和156天(记为t1，t2，t3，t4，t5，t6)。根据上述实验方案，用icp-ms测定各个时期所取厌氧氨氧化污泥血红素溶液的铁元素浓度，从而计算出相当的血红素含量(表3)。agilent7500a型icp-ms，包括四级杆，屏蔽炬(shieldtorch)和高盐雾化器；雾化室为低记忆效应的石英双通道型，并用piltier半导体控温于2±0.1℃，消除样品引入时产生的大量水蒸汽，提高icp功率利用于样品基体的效率，经优化后的参数总结于表2。

表2icp-ms仪器操作参数

污泥的生物性指标是反映污泥活性的最有效手段，为了进一步验证上述方法所测得的血红素提取液中铁含量跟污泥活性的相关性，分别测得不同时期厌氧氨氧化污泥的脱氢酶活性dha(朱南文等，1996)和比厌氧氨氧化活性saa(dapena-moraetal,2007)，取三次重复测定的平均值所得数据如下(表3)。由表3可知，厌氧氨氧化反应器egsb中污泥的血红素提取液铁含量、生物属性dha和saa随培养时间的变化一致，从接种0天到102天，三者都呈上升趋势，表明反应器内厌氧氨氧化过程趋于成熟稳定。102天后改变外界环境条件(提高溶解氧do，增加废水cod)，使得反应器内厌氧氨氧化菌生长受到胁迫，污泥血红素提取液铁含量、dha和saa都随之降低，反应器在一个多月后才慢慢恢复脱氮功能。

对表3数据进行指数拟合统计分析发现，在厌氧氨氧化反应器启动及运行过程中血红素提取液铁含量与saa和dha之间显著相关(图2)，其拟合方程f＝y0+a*exp(b*x)的系数和相关性系数r²见图2，方程中f表示saa或dha，x表示厌氧氨氧化污泥的血红素提取液中铁含量，y0、a、b分别为拟合参数。通过本实验所得结论，为及时了解厌氧氨氧化反应器启动及运行过程中污泥性能变化，可以通过测定厌氧氨氧化污泥血红素提取液中铁浓度来表征，其数值与传统生物指标dha、saa具有显著的相关性(r²>0.99)，因icp-ms测定提取液中铁含量具有分析快速、测定准确、抗干扰能力强等诸多优点，本发明对于监测厌氧氨氧化污泥活性不失为一种简单快速的新方法。

表3不同培养时期厌氧氨氧化污泥的血红素提取液中铁含量跟污泥dha和saa的变化

*表示血红素含量是基于icp-ms测定的提取液铁元素浓度计算所得.

以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制。凡采用等同变换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。