本发明涉及一种关节克痹丸中苍术素的含量测定方法，属于中药质量检测
技术领域：
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背景技术：
：关节克痹丸具有祛风散寒、活络止痛之功效。用于关节炎、四肢酸痛、伸展不利等症。现代药理实验证明关节克痹丸具有解痉作用对兔回肠具有明显的解痉作用；同时具有镇痛、镇静和抗炎作用：药理研究表明，关节克痹丸能明显延长小鼠热板法造成的动物疼痛反应时间，表明其明显镇痛作用。苍术素具有抗炎、抗菌、抗病毒等作用，现代药理研究表明，黄芩苷关节克痹丸中中药的有效成分中的一种，对黄芩苷进行含量测定显的尤为重要。但是，现有的关节克痹丸的质量检测方法并没有对苍术素成分的含量进行测定，为进一步完善关节克痹丸的质量检测标准，以确保其药品质量，建立关节克痹丸中苍术素的含量测定项目非常必要。技术实现要素：本发明的目的在于，提供一种关节克痹丸中苍术素的含量测定方法，该方法专属性强、精密度高、重复性好、回收率高、稳定性高、测量结果准确，达到了有效控制药物质量的目的，确保了产品质量的稳定以及临床用药的安全、有效。为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：一种关节克痹丸中苍术素的含量检测方法，它是以苍术素对照品为对照，以甲醇:水/0.01％～5％磷酸水溶液/0.01％～5％冰醋酸/0.01％～0.5％甲酸水溶液＝50～70：50～30或者乙腈:水/0.01％～5％磷酸水溶液/0.01％～5％冰醋酸/0.01％～0.5％甲酸水溶液＝20～50:80～50为流动相的高效液相色谱法。上述的关节克痹丸中苍术素的含量测定方法，其特征在于，照高效液相色谱法、按下述步骤进行测定：(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇:水/0.01％～5％磷酸水溶液/0.01％～5％冰醋酸/0.01％～0.5％甲酸水溶液＝50～70:50～30或者乙腈:水/0.01％～5％磷酸水溶液/0.01％～5％冰醋酸/0.01％～0.5％甲酸水溶液＝20～50:80～50为流动相；柱温为20～40℃；检测波长为230～270nm；流速为0.5～1.5ml·min-1；理论板数按苍术素计算应不低于5000；(2)对照品溶液的制备：取苍术素对照品适量，精密称定，加甲醇制成1ml含0.1mg的溶液，备用；(3)供试品溶液的制备：采用下述方法①-⑤中的任一种：①精密称取关节克痹丸2.0g，精密加入甲醇100ml，称定重量，超声或回流提取30～60min，待冷却后，用甲醇补足重量，过滤，取续滤液即得；②精密称取关节克痹丸2.0g，用适量石油醚索氏提取30min，残渣挥干后，精密加入甲醇100ml，称定重量，超声或回流提取30～60min，待冷却后，用甲醇补足重量，过滤，取续滤液即得；③精密称取关节克痹丸2.0g，精密加入70％～80％的乙醇100ml，称定重量，超声提取lh，用乙醇补足重量，滤过；精密量取续滤液50ml，减压浓缩至干，残渣加适量水使溶解，上大孔吸附树脂柱，静置吸附30min，依次用水、40％乙醇、70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，浓缩至干，用甲醇溶解并转移至50ml的量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；④精密称取关节克痹丸2.0g，精密加入甲醇100ml，称定重量，超声或回流提取1h，用甲醇补足重量，滤过；精密量取续滤液50ml，浓缩至干，残留物用0.3％氢氧化钠溶液溶解后，加稀盐酸调至ph5～6，然后用乙酸乙酯或水饱和的正丁醇萃取四次，合并有机层，减压蒸干，残渣用甲醇定容至50ml，摇匀，即得；⑤精密称取关节克痹丸2.0g，精密加入甲醇100ml，称定重量，超声或回流提取1h，用甲醇补足重量，滤过；精密量取续滤液50ml，浓缩至干，残渣加适量温水溶解，用水饱和的正丁醇提取4次，充分提取后，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水10ml使溶解，通过大孔吸附树脂柱，以水50ml洗脱，弃去水液，再用40％乙醇洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。上述的关节克痹丸中苍术素的的含量测定方法，其特征在于：所述的流动相为乙腈:0.5％磷酸水溶液＝40:60。上述的关节克痹丸中苍术素的含量测定方法，其特征在于：步骤(1)中的检测波长为254nm；流速为0.8～1.0ml/min；柱温为35℃。为确保本发明含量测定方法科学、合理、可行，申请人进行了一系列试验研究和考察。一、仪器与试药(见表1)表1二、方法与结果1、色谱条件的选择1.1柱温选择采用不同柱温进行实验，寻找最佳柱温。结果见表2。表2柱温(℃)253550观察结果分离度差分离度良好溶剂粘度大由表2可知，应选择35℃作为柱温，此温度容易控制，且在低压下有利于降低溶剂的粘度，从而降低柱压。1.2流速选择采用不同流速进行实验，寻找最佳流速范围。结果见表3。表3由表3可知，设置流速在0.8～1.0ml/min内最好。1.3流动相选择采用不同流动相进行uv检测，寻找最佳流动相。结果见表4。表4流动相色谱峰乙腈:0.5％磷酸水溶液＝40:60产生鬼峰少，峰形好，分离度高甲醇:水＝30:70峰形差，分离度低甲醇:0.05％冰醋酸＝60:40峰形较好，分离度较高甲醇:0.05％磷酸水溶液＝40:60峰形稍差，分离度低乙腈:水＝60:40峰形差，分离度低乙腈:0.05％冰醋酸＝30:70峰形较好，分离度高由上表可知，选用乙腈:0.5％磷酸水溶液＝40:60作为流动相，其得到的色谱峰效果最好。2、对照品溶液的制备取苍术素对照品适量，精密称定，加甲醇制成1ml含0.1mg的溶液，备用。3、供试品溶液的制备可采用下述方法①-⑤中的任一种进行制备：①精密称取关节克痹丸中苍术素2.0g，精密加入甲醇100ml，称定重量，超声或回流提取30～60min，待冷却后，用甲醇补足重量，过滤，取续滤液即得；②精密称取关节克痹丸中苍术素2.0g，用适量石油醚索氏提取30min，残渣挥干后，精密加入甲醇100ml，称定重量，超声或回流提取30～60min，待冷却后，用甲醇补足重量，过滤，取续滤液即得；③精密称取关节克痹丸中苍术素2.0g，精密加入70％～80％的乙醇100ml，称定重量，超声提取lh，用乙醇补足重量，滤过；精密量取续滤液50ml，减压浓缩至干，残渣加适量水使溶解，上大孔吸附树脂柱，静置吸附30min，依次用水、40％乙醇、70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，浓缩至干，用甲醇溶解并转移至50ml的量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；④精密称取关节克痹丸中苍术素2.0g，精密加入甲醇100ml，称定重量，超声或回流提取1h，用甲醇补足重量，滤过；精密量取续滤液50ml，浓缩至干，残留物用0.3％氢氧化钠溶液溶解后，加稀盐酸调至ph5～6，然后用乙酸乙酯或水饱和的正丁醇萃取四次，合并有机层，减压蒸干，残渣用甲醇定容至50ml，摇匀，即得；⑤精密称取关节克痹丸中苍术素2.0g，精密加入甲醇100ml，称定重量，超声或回流提取1h，用甲醇补足重量，滤过；精密量取续滤液50ml，浓缩至干，残渣加适量温水溶解，用水饱和的正丁醇提取4次，充分提取后，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水10ml使溶解，通过大孔吸附树脂柱，以水50ml洗脱，弃去水液，再用40％乙醇洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。申请人比较了上述5种供试品制备方法，实验结果见表5。表5由上表可知，前两种方法虽然操作简便，苍术素提取率高，但苍术素纯度很低。后三种方法步骤虽稍显繁琐，苍术素提取率稍低、但纯度高，在很大程度上消除了杂质对检测结果的影响。4、检测波长的选择在230～270nm对苍术素对照品溶液进行光谱扫描，其最大吸收波长为254nm，因此选用254nm为检测波长。5、标准曲线的制备取对照品溶液0.25ml、0.5ml、1ml、2ml、4ml于10ml容量瓶中，加甲醇稀释，定容，各进样10μl，以不同浓度的苍术素对照品溶液相应的峰面积对浓度绘制标准曲线，计算得回归方程为y＝2.42×105x-1.93×105，r＝0.9998，其中，y为峰面积，x为苍术素对照品溶液浓度，苍术素在2.5～40μg/ml呈良好线性关系。6、精密度实验照对照品溶液的制备项下方法制得对照品溶液，取对照品溶液10μl，重复进样6次，计算得苍术素峰面积rsd为1.06％，表明该方法精密度良好。7、稳定性实验照供试品溶液的制备项下方法制得供试品溶液，精密吸取同一供试品溶液，室温下分别于0、2、4、8、12、24h各吸10μl，共进样6次，计算得苍术素峰面积的rsd为1.37％，表明处理后的溶液在室温下24h内稳定，稳定性良好。8、重复性实验照供试品溶液的制备项下方法制得供试品溶液，取同一样品溶液6份，各进样10μl，计算得峰面积的rsd为1.47％，表明重复性良好。9、加样回收率实验精密称取已知含量的关节克痹丸粉末6份，分别精密加入苍术素对照品，按供试品溶液的制备方法制备，并进样测定，测定结果见表6，计算其平均回收率为97.26％，rsd为0.81％，回收率高，表明本方法可行。表6加样回收率实验结果10、样品含量测定取5批关节克痹丸适量，精密称定，分别按对照品溶液的制备项、供试品溶液的制备项下方法进行制备，按线性关系的考察项下含量测定(供试品溶液、对照品溶液分别进样10μl)，计算出苍术素的含量，结果见表7。表7样品含量测定结果(n＝5)样品批号平均含量(mg/g)201808013.396201808023.398201808033.389201808043.387201808053.395与现有技术相比，本发明通过高效液相色谱法对关节克痹丸中苍术素成分的含量进行测定，所述方法的专属性强、精密度高、重复性好、回收率高、稳定性高、测量结果准确，达到了有效控制药物质量的目的，确保了产品质量的稳定以及临床用药的安全、有效。具体实施方式本发明实施例1：一种关节克痹丸中苍术素的含量测定方法如下：(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈:0.5％磷酸水溶液＝40:60为流动相；检测波长为254nm，流速为1.0ml/min，柱温为35℃；理论板数按苍术素峰计算应不低于5000；(2)对照品溶液的制备：取苍术素对照品适量，精密称定，加甲醇制成1ml含0.1mg的溶液，备用；(3)供试品溶液的制备：精密称取关节克痹丸2.0g，精密加入70％的乙醇100ml，称定重量，超声提取lh，用乙醇补足重量，滤过；精密量取续滤液50ml，减压浓缩至干，残渣加适量水使溶解，上大孔吸附树脂柱，静置吸附30min，依次用水、40％乙醇、70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，浓缩至干，用甲醇溶解并转移至50ml的量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。本发明实施例2：一种关节克痹丸中苍术素的含量测定方法如下：(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈：水＝40：60为流动相；检测波长为254nm，流速为1.0ml/min，柱温为35℃；理论板数按苍术素峰计算应不低于5000；(2)对照品溶液的制备：取苍术素对照品适量，精密称定，加甲醇制成1ml含0.1mg的溶液，备用；(3)供试品溶液的制备：精密称取关节克痹丸2.0g，精密加入甲醇100ml，称定重量，超声或回流提取1h，用甲醇补足重量，滤过；精密量取续滤液50ml，浓缩至干，残留物用0.3％氢氧化钠溶液溶解后，加稀盐酸调至ph5～6，然后用乙酸乙酯或水饱和的正丁醇萃取四次，合并有机层，减压蒸干，残渣用甲醇定容至50ml，摇匀，即得；(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。本发明实施例3：一种关节克痹丸中苍术素的含量测定方法如下：(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇:0.05％冰醋酸＝60:40为流动相；柱温为40℃；检测波长为270nm；流速为1.5ml·min-1；理论板数按苍术素计算应不低于5000；(2)对照品溶液的制备：取苍术素对照品适量，精密称定，加甲醇制成1ml含0.1mg的溶液，备用；(3)供试品溶液的制备：精密称取关节克痹丸2.0g，精密加入甲醇100ml，称定重量，超声或回流提取1h，用甲醇补足重量，滤过；精密量取续滤液50ml，浓缩至干，残渣加适量温水溶解，用水饱和的正丁醇提取4次，充分提取后，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水10ml使溶解，通过大孔吸附树脂柱，以水50ml洗脱，弃去水液，再用40％乙醇洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。本发明实施例4：一种关节克痹丸中苍术素的含量测定方法如下：(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇:水＝70:30为流动相；柱温为20℃；检测波长为230nm；流速为0.5ml·min-1；理论板数按苍术素计算应不低于5000；(2)对照品溶液的制备：取苍术素对照品适量，精密称定，加甲醇制成1ml含0.1mg的溶液，备用；(3)供试品溶液的制备：精密称取关节克痹丸2.0g，精密加入甲醇100ml，称定重量，超声或回流提取30～60min，待冷却后，用甲醇补足重量，过滤，取续滤液即得；(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。本发明实施例5：一种关节克痹丸中苍术素的含量测定方法如下：(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇:0.5％磷酸水溶液＝50:50为流动相；柱温为30℃；检测波长为240nm；流速为0.8ml·min-1；理论板数按苍术素峰计算应不低于5000；(2)对照品溶液的制备：取苍术素对照品适量，精密称定，加甲醇制成1ml含0.1mg的溶液，备用；(3)供试品溶液的制备：精密称取关节克痹丸2.0g，用适量石油醚索氏提取30min，残渣挥干后，精密加入甲醇100ml，称定重量，超声或回流提取30～60min，待冷却后，用甲醇补足重量，过滤，取续滤液即得；(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。本发明实施例6：一种关节克痹丸中苍术素的含量测定方法如下：(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇:0.05％甲酸水溶液＝60:40为流动相；柱温为20℃；检测波长为260nm；流速为1.5ml·min-1；理论板数按苍术素计算应不低于5000；(2)对照品溶液的制备：取苍术素对照品适量，精密称定，加甲醇制成1ml含0.1mg的溶液，备用；(3)供试品溶液的制备：精密称取关节克痹丸2.0g，精密加入80％的乙醇100ml，称定重量，超声提取lh，用乙醇补足重量，滤过；精密量取续滤液50ml，减压浓缩至干，残渣加适量水使溶解，上大孔吸附树脂柱，静置吸附30min，依次用水、40％乙醇、70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，浓缩至干，用甲醇溶解并转移至50ml的量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。本发明实施例7：一种关节克痹丸中苍术素的含量测定方法如下：(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈:0.05％甲酸水溶液＝30:70为流动相；柱温为40℃；检测波长为254nm；流速为1.0ml·min-1；理论板数按苍术素峰计算应不低于5000；(2)对照品溶液的制备：取苍术素对照品适量，精密称定，加甲醇制成1ml含0.1mg的溶液，备用；(3)供试品溶液的制备：精密称取关节克痹丸2.0g，精密加入75％的乙醇100ml，称定重量，超声提取lh，用乙醇补足重量，滤过；精密量取续滤液50ml，减压浓缩至干，残渣加适量水使溶解，上大孔吸附树脂柱，静置吸附30min，依次用水、40％乙醇、70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，浓缩至干，用甲醇溶解并转移至50ml的量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。本发明实施例8：一种关节克痹丸中苍术素的含量测定方法如下：(1)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇:0.5％冰醋酸＝60:40为流动相；柱温为35℃；检测波长为260nm；流速为0.8ml·min-1；理论板数按苍术素峰计算应不低于5000；(2)对照品溶液的制备：取苍术素对照品适量，精密称定，加甲醇制成1ml含0.1mg的溶液，备用；(3)供试品溶液的制备：精密称取苍术素2.0g，精密加入甲醇100ml，称定重量，超声或回流提取1h，用甲醇补足重量，滤过；精密量取续滤液50ml，浓缩至干，残渣加适量温水溶解，用水饱和的正丁醇提取4次，充分提取后，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤3次，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水10ml使溶解，通过大孔吸附树脂柱，以水50ml洗脱，弃去水液，再用40％乙醇洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。上述实施例中的所有条件参数的任意组合，均可得到一致的含量测定结果。当前第1页1 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