一种工业大麻花叶中大麻色烯（CBC）含量的测定方法与流程

本发明涉及检测技术领域，特别涉及一种工业大麻花叶中大麻色烯（cbc）含量的测定方法。

背景技术：

工业大麻是指四氢大麻酚（thc）含量低于0.3%的大麻，我国将工业大麻称为汉麻，是大麻科大麻属一年生草本植物，大麻中的主要活性成分是大麻素类化合物，目前已知天然大麻素有70种。

其中大麻色烯（以下简称cbc）是仅次于大麻二酚（cbd）和四氢大麻酚（thc）最为常见的大麻素，为非精神活性成分，具有良好的医用价值：cbc可作为抗生素，有良好的抗菌性能，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（mr-sa）显现出杀菌活性；cbc对部分酵母菌、丝状真菌、皮肤癣菌等各类真菌均有轻至中度的抗性；cbc自身有很好的抗炎作用，2010年研究发现，cbc结合thc使用，抗炎效果更好；cbc与thc以及其他大麻素共同作用后，cbc也显示了对抗乳腺癌的战斗力，cbc自己的抗肿瘤作用并不如cbd、thc和cbg明显，但结合在一起，就成为一个强大的抗肿瘤组合体；此外cbc还有抗抑郁和促进大脑细胞新生的作用，具有减少患老年痴呆症的风险等药用价值。

目前，工业大麻医用研究是新的热点，虽然目前针对cbc的研究较cbd少，但目前的研究已表明，cbc亦有较高的医用价值。而且在有些大麻植株内，cbc的含量高于cbd，故准确测定花叶原料中的大麻色烯含量十分重要。但目前尚未有权威的大麻色烯检测标准，因此开发一种能够准确测定工业大麻花叶中大麻色烯含量的检测方法十分必要。

技术实现要素：

本发明使用甲醇超声提取工业大麻花叶中的大麻色烯（cbc），用高效液相色谱仪检测，外标法进行定量，能够准确、快速的检测大麻花叶中的大麻色烯（cbc）含量。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

（1）本发明提供了一种工业大麻花叶中大麻色烯（cbc）含量的测定方法，包括如下步骤：

①将新鲜工业大麻花叶样品于烘箱中60℃下干燥12小时（至水分小于5%），粉碎机粉碎至20目，混匀待测。

②准确称取花叶样品于离心管中，加入有机溶剂，超声提取，然后离心收集上清液，滤渣重复超声提取一次，离心合并上清液，上清液浓缩定容过滤膜得到待测液。

③用高效液相色谱仪对待测液进行检测，高效液相色谱仪流动相为水和乙腈，等度洗脱。

④使用外标法定量：用cbc标准对照品配得系列对照品溶液，外标法测得大麻花叶待测液中cbc的含量。

（2）进一步的，步骤①中所述大麻花叶为9月采摘的成熟工业大麻的叶和花苞组合物。

（3）进一步的，步骤②中所述有机溶剂为色谱纯溶剂，为甲醇、乙醇、正己烷、乙酸乙酯中一种或两种混合物，有机溶剂所用体积量与花叶样品质量比为5~20:1。

（4）优选地，步骤②中所述有机溶剂为色谱纯甲醇，甲醇体积与大麻花叶质量比为10:1。

（5）进一步的，步骤②中所述超声时间为5min~30min。

（6）优选地，步骤②中所述超声时间为20min，超声功率为250w，工作频率为40khz。

（7）进一步的，步骤②中所述离心转速为5000~10000转/分钟，时间为5~10分钟。

（8）优选地，步骤②中所述离心转速为10000转/分钟，离心时间为5分钟。

（9）进一步的，步骤③中所述高效液相色谱仪品牌型号为安捷伦1260；所述流动相乙腈为色谱纯，水为去离子水，乙腈与水的比例为（60%~80%）：（20%~40%），等度洗脱，流速为0.8ml/min~1.2ml/min；所述高效液相色谱仪进样量为8ul~12ul；所述高效液相色谱仪柱温为20℃~40℃；所述高效液相色谱仪检测波长为210nm~230nm。

（10）优选地，步骤③乙腈与水的比例为65%：35%，流速为1ml/min；进样量为10ul；色谱柱为agilentzorbaxeclipseplusc18，柱温为30℃，检测波长为220nm。

（11）进一步的，步骤④中所述cbc标准对照品溶液购自美国sigma公司，浓度为1mg/ml的cbc标准品溶液分别用色谱纯甲醇稀释为1ug/ml、2ug/ml、4ug/ml、8ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、40ug/ml、100ug/ml的系列对照品溶液，在上述仪器条件下进高效液相色谱仪检测，以物质浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

本发明的优点：

①本发明用甲醇进行超声提取大麻花叶中的大麻色烯（cbc），实验操作简单，处理时间短，检测结果准确稳定。

②本发明用去离子水和乙腈作为流动相、等度洗脱，目标物峰形好、分离度好。本发明流动相使用纯水，无需配置缓冲盐，能够延长色谱柱等仪器部件的使用周期，仪器维护简单。

附图说明

图1大麻色烯（cbc）标准对照品色谱图。

图2大麻色烯（cbc）标准曲线。

图3实施例2大麻花叶样品色谱图。

图4实施例3大麻花叶样品色谱图。

图5实施例4大麻花叶样品色谱图。

具体实施方式

以下实施例仅是对本发明予以解释说明，并未对本发明的保护范围进行任何限制。对于本领域技术人员而言，凡未脱离本发明技术精神所作的同等实施方式或变更均在本发明的保护范围之内。

实施例1

（1）将新鲜工业大麻花叶样品于60℃下干燥12小时（水分小于5%），粉碎机粉碎至20目，混匀待测。

（2）准确称取花叶样品1.0g于离心管中，加入10ml甲醇，超声提取20分钟，然后用离心机10000转/分钟离心5分钟，转移上清液至浓缩瓶中，残渣用10ml甲醇重复超声提取一次，离心，合并上清液，用旋转蒸发仪（温度40℃）浓缩除去部分溶剂，浓缩液转移至10ml容量瓶中，甲醇定容，过0.22um有机滤膜得到待测液。

（3）高效液相色谱仪（安捷伦1260）仪器条件设置为：流动相色谱纯乙腈与去离子水的比例为65%：35%，等度洗脱，流速为1ml/min；进样量为10ul；色谱柱为agilentzorbaxeclipseplusc18，柱温为30℃；检测波长为220nm。

（4）系列对照品溶液配置：cbc标准品溶液购自美国sigma公司，浓度为1mg/ml的cbc标准品溶液分别用色谱纯甲醇稀释为1ug/ml、2ug/ml、4ug/ml、8ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、40ug/ml、100ug/ml的系列对照品溶液，以上述色谱条件进高效液相色谱仪检测，以物质浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

（5）外标法定量：在上述色谱条件下，待测样品用液相色谱进行检测，对照cbc标准对照品的对应保留时间，记录cbc的峰面积值，将峰面积带入外标曲线，即可得到待测液中cbc的浓度，进而计算得大麻花叶样品中cbc的含量。

注：色谱图为图3。

实施例2

（1）将新鲜工业大麻花叶样品于60℃下干燥12小时（水分小于5%），粉碎机粉碎至20目，混匀待测。

（2）准确称取花叶样品1.0g于离心管中，加入10ml乙醇，超声提取20分钟，然后用离心机10000转/分钟离心5分钟，转移上清液至浓缩瓶中，残渣用10ml乙醇重复超声提取一次，离心，合并上清液，用旋转蒸发仪（温度40℃）浓缩除去部分溶剂，浓缩液转移至10ml容量瓶中，乙醇定容，过0.22um有机滤膜得到待测液。

（3）高效液相色谱仪（安捷伦1260）仪器条件设置同实施例1。

（4）系列对照品溶液配置同实施例1。

（5）外标法定量同实施例1。

注：色谱图为图4。

实施例3

（1）将新鲜工业大麻花叶样品于60℃下干燥12小时（水分小于5%），粉碎机粉碎至20目，混匀待测。

（2）准确称取花叶样品1.0g于离心管中，加入10ml正己烷+乙酸乙酯混合液（体积比为9：1），超声提取20分钟，然后用离心机10000转/分钟离心5分钟，转移上清液至浓缩瓶中，残渣用10ml正己烷+乙酸乙酯混合液重复超声提取一次，离心，合并上清液，用旋转蒸发仪（温度40℃）浓缩除去部分溶剂，浓缩液转移至10ml容量瓶中，正己烷+乙酸乙酯混合液定容，过0.22um有机滤膜得到待测液。

（3）高效液相色谱仪（安捷伦1260）仪器条件设置同实施例1。

（4）系列对照品溶液配置同实施例1。

（5）外标法定量同实施例1。

注：色谱图为图5。

由图5可见而正己烷-乙酸乙酯作为提取溶剂，样品在cbc标准品出峰处41.0min未出峰，且有杂峰干扰。图3用甲醇作为提取剂色谱图峰形对称、不拖尾、分离度好，图4用乙醇作为提取剂较甲醇峰面积少约10%，故优选甲醇作为测定cbc的提取溶剂。

实施例4重复性试验

按照实施例1的方法制备处理样品。取同一个样品做6份平行样，按照供试品溶液制备方法，平行操作。重复做三天，考察重复性。结果见表1，日内峰面积rsd均小于2％，日间峰面积rsd小于0.5％，表明本方法重复性良好。

表1重复性试验结果（峰面积）

以上实施例仅是对本发明予以解释说明，并未对本发明的保护范围进行任何限制。对于本领域技术人员而言，凡未脱离本发明技术精神所做的同等实施方式或变更均在本发明的保护范围之内。