艰难梭菌毒素A&B胶体金检测卡的制作方法

本实用新型涉及医疗器械领域，具体涉及一种艰难梭菌毒素a&b胶体金检测卡。

背景技术：

胶体金法是由氯金酸(haucl4)在还原剂如白磷或黄磷、抗坏血酸、柠檬酸钠等作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金也是免疫检测技术中较为理想的标记物。金是一种惰性金属，具有潜在的稳定性；色彩鲜艳，作为信号识别试剂，敏感性强；在适当的条件下，任何被精确大小的金颗粒都可以被重现性的制造出来；其优良的的稳定性、敏感性、精确性及可重复生产的特点使其非常适合应用于快速检测领域。20世纪80年代，金标记被引入膜快速检测，当正确连接时，蛋白能牢固地结合在金颗粒表面，无论液态还是固态都能保持长久的稳定性。

艰难梭菌c．d（clostridiumdifficile)是梭菌属的一种专性厌氧菌，对氧十分敏感，很难分离培养，故得名。是一种存在于人体肠道内的条件致病菌,发现于1935年，但直到1977年发现本菌与临床长期使用某些抗生素（氨苄青霉素、头孢霉素、红霉素、氯林可霉素等）引起的伪膜性肠炎有关，方被重视。特别是在欧美等发达国家，抗生素应用比较频繁，致使产生许多的耐药性病原体，艰难梭菌就是其中之一。当肠道内的正常菌群遭到破坏，定植于人体肠道内或经口摄入的产毒性c．d大量繁殖并释放两种致腹泻的毒素，即毒素a（肠道毒素，分子量308kd）和毒素b（细胞毒素，分子量270kd）。研究表明它们是引起抗生素相关性腹泻(aad)常见的病原体，严重者发展为伪膜性肠炎。研究表明，10%～20%的aad和几乎所有的伪膜性肠炎均与c．d有关。近些年随着抗生素在世界范围的广泛应用，艰难梭菌相关性疾病（cdad）在成人及儿童中发病率不断增高，引起了医务工作者的高度关注。

目前临床上检测艰难梭菌的方法主要有酶联免疫吸附分析技术（elisa）和real-timepcr（rt-pcr）技术等。elisa方法多以酶标板为固相载体，适用于大量样本筛查，变异较大，其使用逐渐受到限制。real-timepcr技术具有很高的敏感性、重复性，问世以来就受到极大的关注，但因其操作相对较复杂，需要专业技术人员，试剂和设备也较昂贵，也限制了其应用。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本实用新型提出了一种艰难梭菌毒素a&b胶体金检测卡，设计简单，使用方便，能够准确可靠地实现艰难梭菌毒素a&b双重检测。

本实用新型的技术方案：

艰难梭菌毒素a&b胶体金检测卡，它包括外壳、底板、吸水垫、样品垫、金标结合垫和反应膜，底板中间上面叠加有反应膜，样品垫的后端压在金标结合垫前端，金标结合垫后端压在反应膜前端上面，样品垫与反应膜之间装有金标结合垫，金标结合垫前端并延伸到样品垫后端与底板之间，样品垫前端压在底板上面，吸水垫前端压在反应膜后端上面，吸水垫后端压在底板上面，反应膜上面设计有检测线一和检测线二，外壳包括上壳体和下壳体，下壳体内侧设计有卡槽，底板、吸水垫、样品垫、金标结合垫和反应膜一起置入卡槽内，上壳体上面对应样品垫位置开有加样孔，上壳体上面对应反应膜上面的检测线一和检测线二位置开有对应的观察窗，上壳体内侧下面对应样品垫、结合垫和反应膜三者叠加位置设计有前压板，上壳体内侧下面对应吸水垫与反应膜叠加位置设计有后压板，上壳体扣合在下壳体上面。

所述的反应膜上面设计有质控线，质控线位于检测线二与吸水垫之间，检测线二与质控线之间的距离和检测线一与检测线二之间的距离相同，同时上壳体上也对应质控线位置开有观察窗。

其中检测线一是包被有特异性识别艰难梭菌毒素a的鼠抗艰难梭菌毒素a抗体1，可以检测艰难梭菌毒素a；检测线二是包被有特异性识别艰难梭菌毒素b的鼠抗艰难梭菌毒素b抗体2,可以检测艰难梭菌毒素b；质控线上包被有山羊抗鼠igg多克隆抗体，可以识别胶体金标记的鼠源抗体。

金标结合垫上包被有特异性识别艰难梭菌毒素a的鼠抗艰难梭菌毒素a抗体3-胶体金结合物和有特异性识别艰难梭菌毒素b的鼠抗艰难梭菌毒素b抗体4-胶体金结合物。

所述的底板是聚氯乙烯或聚对苯二甲酸类塑料材料。

所述的反应膜是由纤维素或混合纤维素制成的多聚物膜。

所述的样品垫是由惰性反应材料制成的纺织聚合物或纤维滤器等材料。

所述的金标结合垫是亲水性材料的纤维滤器或玻璃纤维或聚酯类材料。

所述的吸水垫是具有较强吸水能力的亲水材料。

所述的外壳是聚乙烯或聚苯乙烯类材料。

本实用新型的优点是设计简单，使用方便，通过本实用新型设计的外壳结合底板、吸水垫、样品垫、金标结合垫和反应膜组装的检测试纸一起使用，避免检测时样本或其它试剂污染到检测条，影响到结果的判读，安全可靠，采用胶体金检测卡检测艰难梭菌毒素a&b，重复性好，稳定性高，能够鉴别检测艰难梭菌毒素a&b。

附图说明

图1是本实用新型的示意图。

具体实施方式

参照附图1，艰难梭菌毒素a&b胶体金检测卡，它包括外壳、底板1、吸水垫2、样品垫3、结合垫4和反应膜5，底板1中间上面叠加有反应膜5，样品垫3的后端压在金标结合垫4前端上面，金标结合垫4后端压在反应膜5前端上面，样品垫3与反应膜5之间装有金标结合垫4，金标结合垫4前端并延伸到样品垫3与底板1之间，样品垫3前端压在底板1上面，吸水垫2前端压在反应膜5后端上面，吸水垫2后端压在底板1上面，反应膜5上面设计有检测线一6和检测线二7，外壳包括上壳体8和下壳体9，下壳体9内侧设计有卡槽，底板1、吸水垫2、样品垫3、金标结合垫4和反应膜5一起置入卡槽内，上壳体8上面对应样品垫3位置开有加样孔10，上壳体8上面对应反应膜5上面的检测线一6和检测线二7位置开有对应的观察窗11，上壳体8内侧下面对应样品垫3、金标结合垫4和反应膜5三者叠加位置设计有前压板12，上壳体8内侧下面对应吸水垫2与反应膜5叠加位置设计有后压板13，上壳体8扣合在下壳体9上面。所述的反应膜5上面设计有质控线14，质控线14位于检测线二7与吸水垫2之间，检测线二7与质控线14之间的距离和检测线一6与检测线二7之间的距离相同，同时上壳体8上也对应质控线14位置开有观察窗。

其中检测线一是包被有特异性识别艰难梭菌毒素a的鼠抗艰难梭菌毒素a抗体1，可以检测艰难梭菌毒素a；检测线二是包被有特异性识别艰难梭菌毒素b的鼠抗艰难梭菌毒素b抗体2,可以检测艰难梭菌毒素b；质控线上包被有山羊抗鼠igg多克隆抗体，可以识别胶体金标记的鼠源抗体。

金标结合垫上包被有特异性识别艰难梭菌毒素a的鼠抗艰难梭菌毒素a抗体3-胶体金结合物和有特异性识别艰难梭菌毒素b的鼠抗艰难梭菌毒素b抗体4-胶体金结合物。

所述的底板是聚氯乙烯或聚对聚苯二甲酸类塑料材料。

所述的反应膜是由纤维素或混合纤维素制成的多聚物膜。

所述的样品垫是由惰性反应材料制成的纺织聚合物或纤维滤器等材料。

所述的金标结合垫是亲水性材料的纤维滤器或玻璃纤维或聚酯类材料。

所述的吸水垫是具有较强吸水能力的亲水材料。

所述的外壳是聚乙烯或聚苯乙烯类材料。

本实用新型的技术原理：以往利用elisa法适用于大批量检测，需专业的技术人员进行操作，变异大；pcr技术专业性更强，且需要精密的仪器和试剂，使用受到限制。目前胶体金的使用现已非常成熟，小颗粒、非共价的蛋白结合方式，使得胶体金的使用非常方便容易，并且用于结合的蛋白量较少，节约了成本；结果清晰、携带方便、检测快速、数分钟至十几分钟既可完成，能够提供分析物存在与否的视觉证据，非常适用于现场（poct）检测。

取出本实用新型的检测卡，把待测样本滴加到加样孔中，样品垫接受到样本，流经金标结合垫，溶解金标结合垫上的抗体-胶体金结合物，并与之一起层析至反应膜上，如果样本中含有艰难梭菌毒素a&b，就会被反应膜上的检测线一和检测线二捕获，通过外壳上的观察窗可以看到检测线一、检测线二和质控线均显色；反之，如果样本中没有艰难梭菌毒素a&b，就不会被反应膜上的检测线一和检测线二捕获，通过外壳上的观察窗就不会看到检测线一、检测线二显色；不管样本中是否含有艰难梭菌毒素a&b，质控线均会显色。

采用本实用新型检测卡检测艰难梭菌毒素a&b的检测结果的判定：

1）阴性结果：仅出现一条红色条带，即质控线14显色，检测线区内无有色条带出现。表明测试样本中未检出艰难梭菌毒素a&b（tcda&b）。

2）阳性结果：检测线6（tcda阳性）或或和检测线7（tcdb阳性）显色，且质控线14也显色。表明测试样本中检出艰难梭菌毒素a或或和b(tcda或b)。

3）无效结果：当质控线14内未出现红色条带，表明试验失败或试剂失效，应需重新检测。

反应膜上试剂及作用说明：

1）检测线6上包被有鼠抗艰难梭菌毒素a单克隆抗体1，检测线7上包被有鼠抗艰难梭

毒素b单克隆抗体2，质控线14包被有山羊抗鼠igg多克隆抗体。

2）金标结合垫上包被有鼠抗艰难梭菌毒素a单克隆抗体3-胶体金结合物和鼠抗艰难梭菌毒素b单克隆抗体4-胶体金结合物。

3）若待测样本中含有艰难梭菌毒素a，当其流经金标结合垫时，就会于胶体金上标记的鼠抗艰难梭菌毒素a单克隆抗体3结合，形成艰难梭菌毒素a-鼠抗艰难梭菌毒素a单克隆抗体3-胶体金结合物，此复合物继续向前层析，流经检测线6时，就会与鼠抗艰难梭菌毒素a单克隆抗体1结合，形成鼠抗艰难梭菌毒素a单克隆抗体1-艰难梭菌毒素a-鼠抗艰难梭菌毒素a单克隆抗体3-胶体金夹心复合物，而呈现出红色；反之，如果待测样本中没有艰难梭菌毒素a，则不会显色。

4）相应的若待测样本中含有艰难梭菌毒素b，当其流经金标结合垫时，就会于胶体金上标记的鼠抗艰难梭菌毒素b单克隆抗体4结合，形成艰难梭菌毒素b-鼠抗艰难梭菌毒素b单克隆抗体4-胶体金结合物，此复合物继续向前层析，流经检测线7时，就会与鼠抗艰难梭菌毒素b单克隆抗体2结合，形成鼠抗艰难梭菌毒素b单克隆抗体2-艰难梭菌毒素b-鼠抗艰难梭菌毒素b单克隆抗体4-胶体金夹心复合物，而呈现出红色；反之，如果待测样本中没有艰难梭菌毒素b，则不会显色。

5）无论艰难梭菌毒素a&b是否存在于测试样本中，一条有色条带都会出现在质控线区内。质控线区内所显现的有色条带是判定是否有足够标本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。若无对照线出现，则实验无效。