GFRAL细胞外结构域和使用方法与流程
本披露涉及gfral细胞外结构域，以及用于使用本文提供的gfral细胞外结构域的方法和组合物。本披露进一步涉及用于筛选和评价gfral配体(例如，gdf15肽)活性的基于细胞的测定，以及使用gfral细胞外结构域和gfral配体治疗的方法。还提供了可用于筛选和评价gfral配体(例如，gdf15肽)的活性的细胞和试剂盒。
背景技术：
生长分化因子15(gdf15)是转化生长因子-β(tgf-β)细胞因子超家族的一个不同成员，其参与多种生物学功能，包括癌症恶病质、肾和心脏衰竭、动脉粥样硬化和新陈代谢(breit等人,growthfactors[生长因子]2011；29(5):187-95)。最初基于血清中gdf15水平的升高与患有晚期前列腺癌的患者的体重减轻有关这一观察提出了gdf15与体重调节之间的关系(johnen等人,natmed[自然医学]2007；13(11):1333-40)。在患有异种移植的前列腺肿瘤的小鼠中，gdf15水平升高还与食物摄入减少介导的体重减轻、脂肪减少和瘦肉组织损失相关，并且能够通过施用gdf15抗体逆转(johnen等人,natmed[自然医学]2007；13(11):1333-40)。另外，已经显示在正常和致胖两种饮食条件下，小鼠中gdf15的长期升高表达均会引起食物摄入减少、体重减轻和伴随葡萄糖耐量增强的肥胖(macia等人,plosone[公共科学图书馆·综合]2012；7(4):e34868)。gdf15在食欲和体重方面的代谢作用使其成为患有肥胖和/或相关合并症的患者的有前途的疗法。
gfral，神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(gdnf)受体α家族的孤儿成员，是gdf15的一种高亲和力受体。gfral对于gdf15的食欲抑制作用也可能是必需的。gfral基因敲除小鼠中消除了gdf15介导的肥胖小鼠的食物摄入减少和体重减轻(yang等人,natmed[自然医学]2017；23(10):1158-66)。gfral需要与共受体ret结合以响应于gdf15刺激引发细胞内信号传导(yang等人,natmed[自然医学]2017；23(10):1158-66)。
已经报道了重组gdf15蛋白可作为潜在的治疗剂，并且更多这些蛋白还在研究中(xiong等人,scitranslmed[科学转化医学]2017；9(412):eaan8732)。因此，用于快速且有效评价此类治疗性蛋白的活性的测定将是理想的筛选工具。wo2017/121865、wo2017/152105和wo2018/071493中描述了与gdf15和gfral有关的测定。同样，用于改进治疗性gdf15组合物活性的新颖方法和组合物也是有益的。
技术实现要素：
本披露在各种实施例中提供了用于检测和测试gfral配体(例如，gdf15，例如，gdf15肽)的活性的新颖方法和测定。还披露了用于单独使用gfral配体(例如，根据本文披露的方法筛选活性的gdf15肽)或使用所述gfral配体与可溶性gfral(例如，包含d2和d3细胞外结构域但不包含d1细胞外结构域的gfral)的组合治疗肥胖和相关障碍的方法和组合物。
在各种实施例中，本披露更具体地涉及用于评价gfral配体的活性的细胞基方法和测定。与动物基测定相比，细胞基效力测定通常是用于确定生物产品的生物学活性的优选形式，因为细胞基效力测定可以测量产品引起的生物学反应并且可以在相对短的时间内产生结果。另外，许多细胞基效力测定定义了与产品作用机制的相关性。因此，此类测定被广泛使用，并且经常提供给药物管理局以进行药物注册和上市前批准。
在各种实施例中，本文披露的所述细胞基方法和测定是细胞基信号转导测定，并且可以用于确定gfral配体(例如，gdf15肽)的gfral信号传导活性。在各种实施例中，本披露提供了一种检测gdf15肽的活性的方法，所述方法包括：(a)提供表达细胞表面受体激酶的细胞；(b)使所述细胞与所述gdf15肽和可溶性gfral接触；以及(c)检测所述经接触细胞中的生物学反应，其中所述可溶性gfral包含有包含结构域d2和d3的gfral细胞外结构域。
在一些实施例中，所述可溶性gfral包含缺乏结构域d1的gfral细胞外结构域。在一些实施例中，所述可溶性gfral进一步包含信号肽。在一些实施例中，所述可溶性gfral包含seqidno:1的氨基酸序列或其功能变体。在一些实施例中，所述可溶性gfral或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述可溶性gfral或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述可溶性gfral包含seqidno:2的氨基酸序列或其功能变体。在一些实施例中，所述可溶性gfral或其功能变体，例如包含seqidno:1或seqidno:2的氨基酸序列的所述可溶性gfral或其功能变体，进一步包含(例如，融合至)亲和标签。在一些实施例中，所述亲和标签包含淀粉样β前体蛋白(app)标签、组氨酸(his)标签、flag标签或myc标签或者其组合。在一些实施例中，所述可溶性gfral包含seqidno:3的氨基酸序列或其功能变体，或者seqidno:25的氨基酸序列或其功能变体。
在一些实施例中，所述gdf15肽包含seqidno:13的氨基酸序列或其功能变体，所述氨基酸序列或其功能变体包括seqidno:14、15、16或17的氨基酸序列。在一些实施例中，所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gdf15肽包含亲和标签、融合、缀合、peg化和/或糖基化。在一些实施例中，所述gdf15肽用淀粉样β前体蛋白(app)标签、组氨酸(his)标签、flag标签或myc标签或者其组合标记。在一些实施例中，所述gdf15肽与人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、免疫球蛋白恒定区或α-1-抗胰蛋白酶融合。在其他实施例中，所述gdf15肽与脂肪酸缀合。
在所述细胞基方法和测定的一些实施例中，使所述细胞同时与所述gdf15肽和所述可溶性gfral接触。在一些其他实施例中，使所述细胞依次与所述gdf15肽和所述可溶性gfral接触。在一些实施例中，所述gdf15肽和所述可溶性gfral处于相同组合物中。在一些实施例中，所述gdf15肽和所述可溶性gfral处于混合物中。在一些实施例中，所述gdf15肽和所述可溶性gfral处于复合物中。在一些实施例中，所述gdf15肽和所述可溶性gfral处于二元复合物中。
在所述细胞基方法和测定的一些实施例中，所述细胞表面受体激酶是内源细胞表面受体激酶。在一些其他实施例中，所述细胞表面受体激酶是外源细胞表面受体激酶。在一些实施例中，所述细胞表面受体激酶是ret受体酪氨酸激酶。
在所述细胞基方法和测定的一些实施例中，所述细胞不表达内源gfral。在所述细胞基方法和测定的一些实施例中，所述细胞不表达部分或全长gfral(例如，包含跨膜结构域和另一个细胞质结构域的人gfral)。在一些实施例中，所述细胞不表达内源gdf15。在一些实施例中，所述细胞是包含无效gdf15基因的gdf15敲除(ko)细胞。在一些实施例中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施例中，所述细胞是人细胞。在一些实施例中，所述细胞是mcf7细胞(例如，
在一些实施例中，在gdf15肽、可溶性gfral和细胞表面受体激酶例如ret形成三元复合物时诱导生物学反应。在一些实施例中，在所述可溶性gfral不存在下与所述gdf15肽接触的细胞中不诱导所述生物学反应。在一些实施例中，所述生物学反应是信号转导反应(例如，gdf15下游的信号转导反应，例如erk或akt信号传导)。
在一些实施例中，所述生物学反应是所述细胞中蛋白的表达或活性与不与所述gdf15肽和/或所述可溶性gfral接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。在一些实施例中，所述生物学反应是ret-erk、ret-akt、蛋白激酶c、jak/stat、jnk、p38和rac1路径中的一种或多种中细胞内蛋白的表达或活性增加或减少。在一些实施例中，所述蛋白是所述ret-erk路径中选自以下的细胞内蛋白：erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2。在一些实施例中，所述蛋白是所述ret-akt路径中选自以下的细胞内蛋白：akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor。在一些实施例中，使用选自以下的一种或多种测定检测所述生物学反应：激酶或酶活性测定、全细胞与放射性标记的32p-正磷酸酯的孵育、二维凝胶电泳、免疫印迹测定(例如，western印迹)、
在一些实施例中，所述细胞表面受体激酶是ret受体酪氨酸激酶，并且所述蛋白是所述ret-erk路径中的细胞内蛋白。在一些实施例中，所述细胞内蛋白选自erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2或其任何下游靶标中的一种或多种。在一些实施例中，所述细胞内蛋白选自erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2中的一种或多种。在一些实施例中，所述erk是erk1或erk2。在一些实施例中，所述erk是erk1(也称为mapk3或prkm3)。在一些实施例中，所述erk是erk2(也称为mapk1、prkm1或prkm2)。
在其他实施例中，所述细胞表面受体激酶是ret受体酪氨酸激酶，并且所述蛋白是所述ret-akt路径中的细胞内蛋白。在一些实施例中，所述细胞内蛋白选自akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor或其任何下游靶标中的一种或多种。在一些实施例中，所述细胞内蛋白选自akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor中的一种或多种。示例性下游靶标包括但不限于s6激酶。在一些实施例中，所述akt(也称为pkb或rac)是akt1、akt2或akt3。在一些实施例中，所述ras是h-ras、k-ras或n-ras。
在一些其他实施例中，所述生物学反应是所述细胞中蛋白激酶的磷酸化与不与所述gdf15肽和所述可溶性gfral接触的对照细胞中相同蛋白激酶的磷酸化相比增加或减少。
在一些实施例中，所述蛋白激酶是所述细胞表面受体激酶。在一些实施例中，所述蛋白激酶和/或细胞表面受体激酶是ret受体酪氨酸激酶。在一些其他实施例中，所述蛋白激酶是细胞内蛋白激酶，其中所述细胞内蛋白激酶被所述细胞表面受体激酶直接或间接磷酸化。
在一些实施例中，所述蛋白激酶是所述ret-erk路径中的细胞内蛋白激酶。在一些实施例中，所述细胞内蛋白激酶选自erk、jak1、jak2、raf、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2或其任何下游靶标中的一种或多种。在一些实施例中，所述细胞内蛋白激酶选自erk、jak1、jak2、raf、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2中的一种或多种。在一些实施例中，所述细胞内蛋白激酶是erk(例如，erk1或erk2)。在一些实施例中，所述细胞内蛋白激酶是erk1和/或erk2。
在一些其他实施例中，所述蛋白激酶是所述ret-akt路径中的细胞内蛋白激酶。在一些实施例中，所述细胞内蛋白激酶选自akt、src、jak1、jak2、pi3k、pdk1、mlk3、ask1、gsk3α、gsk3β和mtor或其任何下游靶标中的一种或多种。在一些实施例中，所述细胞内蛋白激酶选自akt、src、jak1、jak2、pi3k、pdk1、mlk3、ask1、gsk3α、gsk3β和mtor中的一种或多种。在一些实施例中，所述细胞内蛋白激酶是akt(例如，akt1、akt2或akt3)。在一些实施例中，所述细胞内蛋白激酶是akt1、akt2和/或akt3。在一些实施例中，所述ret-akt路径中的下游靶标是s6激酶。
在各种其他实施例中，本披露提供了一种检测gdf15肽的活性的方法，所述方法包括：(a)提供表达gfral细胞外结构域(例如，可溶性gfral细胞外结构域)和细胞表面受体激酶的细胞；(b)使所述细胞与所述gdf15肽接触；以及(c)检测所述经接触细胞中的生物学反应，其中所述gfral细胞外结构域包含结构域d2和d3。
在各种其他实施例中，本披露提供了一种检测gdf15肽的活性的方法，所述方法包括：(a)提供表达gfral细胞外结构域(例如，可溶性gfral细胞外结构域)和细胞表面受体激酶的细胞；(b)使所述细胞与所述gdf15肽接触；以及(c)检测所述经接触细胞中的生物学反应，其中所述gfral细胞外结构域包含结构域d2和d3；并且其中所述细胞不内源表达gfral。
在各种实施例中，所述经接触细胞中的生物学反应是与细胞信号传导或信号转导有关的反应(例如，蛋白激酶的磷酸化)。在各种实施例中，使用选自以下的一种或多种测定检测所述生物学反应：激酶或酶活性测定、全细胞与放射性标记的32p-正磷酸酯的孵育、二维凝胶电泳、免疫印迹测定(例如，western印迹)、
在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域缺乏结构域d1。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域是可溶性gfral细胞外结构域。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域通过系链(tether)与细胞表面附接。在一些实施例中，所述系链是gfral跨膜结构域或其功能片段。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域或系链包含天然gfral跨膜结构域的氨基酸序列。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域或系链包含seqidno:18的氨基酸序列或其功能变体。在一些实施例中，所述系链是与所述gfral细胞外结构域融合的异源跨膜结构域。
在一些实施例中，所述系链是糖磷脂酰肌醇(gpi)或能够指导gpi接头添加的序列。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域或系链包含seqidno:19的氨基酸序列或其功能变体、seqidno:20的氨基酸序列或其功能变体或者seqidno:21的氨基酸序列或其功能变体。在一些实施例中，所述系链是膜插入序列。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域或系链包含seqidno:22的氨基酸序列或其功能变体，或者seqidno:23的氨基酸序列或其功能变体。在一些其他实施例中，所述系链是膜插入脂肪酸。
在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域进一步包含信号肽。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域包含seqidno:1的氨基酸序列或其功能变体或者由其组成。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少95％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域包含seqidno:2的氨基酸序列或其功能变体或者由其组成。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域，例如包含seqidno:1或seqidno:2的氨基酸序列的所述gfral细胞外结构域，进一步包含(例如，融合至)亲和标签。在一些实施例中，所述亲和标签包含淀粉样β前体蛋白(app)标签、组氨酸(his)标签、flag标签或myc标签或者其组合。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域包含seqidno:3的氨基酸序列或其功能变体，或者seqidno:25的氨基酸序列或其功能变体。
在一些实施例中，所述gdf15肽包含seqidno:13的氨基酸序列或其功能变体或者由其组成，所述氨基酸序列或其功能变体包括seqidno:14、15、16或17的氨基酸序列。在一些实施例中，所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少95％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gdf15肽进一步包含(例如，融合至)亲和标签、融合、缀合、peg化和/或糖基化。在一些实施例中，所述gdf15肽用淀粉样β前体蛋白(app)标签、组氨酸(his)标签、flag标签或myc标签或者其组合标记。在一些实施例中，所述gdf15肽与人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、免疫球蛋白恒定区或α-1-抗胰蛋白酶融合。在其他实施例中，所述gdf15肽与脂肪酸缀合。
在一些实施例中，所述细胞表面受体激酶是内源细胞表面受体激酶。在一些其他实施例中，所述细胞表面受体激酶是外源细胞表面受体激酶。在一些实施例中，所述细胞表面受体激酶是ret受体酪氨酸激酶。
在一些实施例中，所述细胞不表达内源gfral。在一些实施例中，所述细胞不表达全长gfral。在一些实施例中，所述细胞不表达内源gdf15。在一些实施例中，所述细胞是包含无效gdf15基因的gdf15ko细胞。在一些实施例中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施例中，所述细胞是人细胞。在一些实施例中，所述细胞是mcf7细胞。在一些实施例中，所述细胞是sh-sy5y细胞。在仍其他实施例中，所述细胞是hek293a-gdf15ko细胞。
在一些实施例中，在gdf15肽、gfral细胞外结构域和细胞表面受体激酶(例如，ret)形成三元复合物时诱导生物学反应。在一些实施例中，所述生物学反应是信号转导反应(例如，gdf15下游的信号转导反应，例如erk或akt信号传导)。在一些实施例中，所述生物学反应是所述细胞中蛋白的表达或活性与不与所述gdf15肽和所述可溶性gfral接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。表达或活性增加或减少的所述蛋白可以是本文所述的任何示例性蛋白，例如，ret-erk、ret-akt、蛋白激酶c、jak/stat、jnk、p38和rac1路径中的一种或多种中的细胞内蛋白。在一些实施例中，使用本文披露的任何示例性测定检测生物学反应。
在一些实施例中，所述生物学反应是ret-erk、ret-akt、蛋白激酶c、jak/stat、jnk、p38和rac1路径中的一种或多种中细胞内蛋白的表达或活性增加或减少。在一些实施例中，所述蛋白是所述ret-erk路径中选自以下的细胞内蛋白：erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2。在一些实施例中，所述蛋白是所述ret-akt路径中选自以下的细胞内蛋白：akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor。
在一些实施例中，所述细胞表面受体激酶是ret受体酪氨酸激酶，并且所述蛋白是所述ret-erk路径中的细胞内蛋白。在一些实施例中，所述细胞内蛋白选自erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2或其任何下游靶标中的一种或多种。在一些实施例中，所述细胞内蛋白选自erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2中的一种或多种。在一些实施例中，所述erk是erk1或erk2。
在其他实施例中，所述细胞表面受体激酶是ret受体酪氨酸激酶，并且所述蛋白是所述ret-akt路径中的细胞内蛋白。在一些实施例中，所述细胞内蛋白选自akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor或其任何下游靶标中的一种或多种。在一些实施例中，所述细胞内蛋白选自akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor中的一种或多种。在一些实施例中，所述akt是akt1、akt2或akt3。
在一些其他实施例中，所述生物学反应是所述细胞中蛋白激酶的磷酸化与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白激酶的磷酸化相比增加或减少。
在一些实施例中，所述蛋白激酶是所述细胞表面受体激酶。在一些实施例中，所述蛋白激酶和/或细胞表面受体激酶是ret受体酪氨酸激酶。在一些其他实施例中，所述蛋白激酶是细胞内蛋白激酶，其中所述细胞内蛋白激酶被所述细胞表面受体激酶直接或间接磷酸化。
在一些实施例中，所述蛋白激酶是所述ret-erk路径中的细胞内蛋白激酶。在一些实施例中，所述细胞内蛋白激酶选自erk、jak1、jak2、raf、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2或其任何下游靶标中的一种或多种。在一些实施例中，所述细胞内蛋白激酶选自erk、jak1、jak2、raf、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2中的一种或多种。在一些实施例中，所述细胞内蛋白激酶是erk(例如，erk1或erk2)。在一些实施例中，所述细胞内蛋白激酶是erk1和/或erk2。
在一些其他实施例中，所述蛋白激酶是所述ret-akt路径中的细胞内蛋白激酶。在一些实施例中，所述细胞内蛋白激酶选自akt、src、jak1、jak2、pi3k、pdk1、mlk3、ask1、gsk3α、gsk3β和mtor或其任何下游靶标中的一种或多种。在一些实施例中，所述细胞内蛋白激酶选自akt、src、jak1、jak2、pi3k、pdk1、mlk3、ask1、gsk3α、gsk3β和mtor中的一种或多种。在一些实施例中，所述细胞内蛋白激酶是akt(例如，akt1、akt2或akt3)。在一些实施例中，所述细胞内蛋白激酶是akt1、akt2和/或akt3。在一些实施例中，所述ret-akt路径中的下游靶标是s6激酶。
在各种实施例中，本文进一步提供了分离和修饰的细胞以用于检测gdf15肽的活性。在各种实施例中，所述细胞表达包含结构域d2和d3的gfral细胞外结构域以及细胞表面受体激酶。在各种实施例中，所述gfral细胞外结构域包含结构域d2和d3，但缺乏结构域d1。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域进一步包含信号肽。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域包含seqidno:1的氨基酸序列或其功能变体或者由其组成。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域包含seqidno:2的氨基酸序列或其功能变体或者由其组成。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域，例如包含seqidno:1或seqidno:2的氨基酸序列的所述gfral细胞外结构域，进一步包含(例如，融合至)亲和标签。在一些实施例中，所述亲和标签包含淀粉样β前体蛋白(app)标签、组氨酸(his)标签、flag标签或myc标签或者其组合。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域包含seqidno:3的氨基酸序列或其功能变体，或者seqidno:25的氨基酸序列或其功能变体。
在一些实施例中，所述gdf15肽包含seqidno:13的氨基酸序列或其功能变体，所述氨基酸序列或其功能变体包括seqidno:14、15、16或17的氨基酸序列。在一些实施例中，所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gdf15肽包含亲和标签、融合、缀合、peg化和/或糖基化。在一些实施例中，所述gdf15肽用淀粉样β前体蛋白(app)标签、组氨酸(his)标签、flag标签或myc标签或者其组合标记。在一些实施例中，所述gdf15肽与人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、免疫球蛋白恒定区或α-1-抗胰蛋白酶融合。在其他实施例中，所述gdf15肽与脂肪酸缀合。
在一些实施例中，所述细胞表面受体激酶是内源细胞表面受体激酶。在一些其他实施例中，所述细胞表面受体激酶是外源细胞表面受体激酶。在一些实施例中，所述细胞表面受体激酶是ret受体酪氨酸激酶。
在一些实施例中，所述细胞不表达内源gfral。在一些实施例中，所述细胞不表达全长gfral。在一些实施例中，所述细胞不表达内源gdf15。在一些实施例中，所述细胞是包含无效gdf15基因的gdf15ko细胞。在一些实施例中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施例中，所述细胞是人细胞。在一些其他实施例中，所述细胞是mcf7细胞。在一些实施例中，所述细胞是sh-sy5y细胞。在仍其他实施例中，所述细胞是hek293a-gdf15ko细胞。
在各种实施例中，本文进一步提供了用于确定gdf15肽的活性的试剂盒。在各种实施例中，所述试剂盒包含用于与所述gdf15肽接触的细胞，以及检测所述经接触细胞中的生物学反应的构件。在各种实施例中，所述细胞是表达包含结构域d2和d3的gfral细胞外结构域以及细胞表面受体激酶的分离和修饰的细胞
在各种实施例中，本文还提供了本文披露的gfral配体(例如，gdf15肽)和gfral细胞外结构域例如在治疗受试者的肥胖或肥胖相关障碍、降低食欲和/或减轻体重等中的治疗方法和用途。在各种实施例中，本文所述的治疗方法和用途可用于治疗肥胖或肥胖相关障碍，诸如癌症、体重障碍和/或代谢疾病和障碍。本文披露了可能与肥胖同时发生或者可能是体重过多的直接或间接结果的示例性肥胖相关障碍和病症。这些障碍和病症包括但不限于癌症、ii型糖尿病(t2dm)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、高甘油三酯血症和心血管疾病。
例如，在某些方面，本披露提供了一种通过向受试者施用gdf15肽来治疗肥胖或肥胖相关障碍的方法，其中所述gdf15肽是例如，如使用本文所述的检测方法所确定，在与所述gdf15肽接触的细胞中诱导生物学反应，和/或具有gfral信号传导活性的物质。在一些实施例中，所述生物学反应是信号转导反应(例如，erk活化或信号传导，或akt活化或信号传导)。在一些实施例中，所述生物学反应是所述细胞中蛋白的表达或活性与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。在一些实施例中，所述生物学反应是ret-erk、ret-akt、蛋白激酶c、jak/stat、jnk、p38和rac1路径中的一种或多种中细胞内蛋白的表达或活性增加或减少。在一些实施例中，所述蛋白是所述ret-erk路径中选自以下的细胞内蛋白：erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2。在一些实施例中，所述蛋白是所述ret-akt路径中选自以下的细胞内蛋白：akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor。
在一些实施例中，所述生物学反应是所述细胞中蛋白激酶的磷酸化与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白激酶的磷酸化相比增加或减少。在一些实施例中，所述蛋白激酶是细胞内蛋白激酶，其中所述细胞内蛋白激酶被所述细胞表面受体激酶直接或间接磷酸化。在一些实施例中，所述受试者超重或肥胖。在一些实施例中，所述受试者的身体质量指数在25与29.9之间。在一些其他实施例中，所述受试者的身体质量指数为30或更高。在一些实施例中，所述肥胖相关障碍是癌症、体重障碍或代谢疾病或障碍。在一些实施例中，所述肥胖相关障碍是癌症、t2dm、nash、高甘油三酯血症或心血管疾病。
在某些其他方面，本披露提供了gdf15肽在治疗受试者的肥胖或肥胖相关障碍中的用途，其中所述gdf15肽是例如，如使用本文所述的检测方法所确定，在与所述gdf15肽接触的细胞中诱导生物学反应，和/或具有gfral信号传导活性的物质。在一些实施例中，所述生物学反应是信号转导反应(例如，erk活化或信号传导，或akt活化或信号传导)。在一些实施例中，所述生物学反应是所述细胞中蛋白的表达或活性与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。在一些实施例中，所述生物学反应是ret-erk、ret-akt、蛋白激酶c、jak/stat、jnk、p38和rac1路径中的一种或多种中细胞内蛋白的表达或活性增加或减少。在一些实施例中，所述蛋白是所述ret-erk路径中选自以下的细胞内蛋白：erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2。在一些实施例中，所述蛋白是所述ret-akt路径中选自以下的细胞内蛋白：akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor。
在一些实施例中，所述生物学反应是所述细胞中蛋白激酶的磷酸化与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白激酶的磷酸化相比增加或减少。在一些实施例中，所述蛋白激酶是细胞内蛋白激酶，其中所述细胞内蛋白激酶被所述细胞表面受体激酶直接或间接磷酸化。在一些实施例中，所述受试者超重或肥胖。在一些实施例中，所述受试者的身体质量指数在25与29.9之间。在一些其他实施例中，所述受试者的身体质量指数为30或更高。在一些实施例中，所述肥胖相关障碍是癌症、体重障碍或代谢疾病或障碍。在一些实施例中，所述肥胖相关障碍是癌症、t2dm、nash、高甘油三酯血症或心血管疾病。
在某些其他方面，本披露提供了一种通过向受试者施用gdf15肽来降低食欲和/或减轻体重的方法，其中所述gdf15肽是例如，如使用本文所述的检测方法所确定，在与所述gdf15肽接触的细胞中诱导生物学反应，和/或具有gfral信号传导活性的物质。在一些实施例中，所述生物学反应是信号转导反应(例如，erk活化或信号传导，或akt活化或信号传导)。在一些实施例中，所述生物学反应是所述细胞中蛋白的表达或活性与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。在一些实施例中，所述生物学反应是ret-erk、ret-akt、蛋白激酶c、jak/stat、jnk、p38和rac1路径中的一种或多种中细胞内蛋白的表达或活性增加或减少。在一些实施例中，所述蛋白是所述ret-erk路径中选自以下的细胞内蛋白：erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2。在一些实施例中，所述蛋白是所述ret-akt路径中选自以下的细胞内蛋白：akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor。
在一些实施例中，所述生物学反应是所述细胞中蛋白激酶的磷酸化与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白激酶的磷酸化相比增加或减少。在一些实施例中，所述蛋白激酶是细胞内蛋白激酶，其中所述细胞内蛋白激酶被所述细胞表面受体激酶直接或间接磷酸化。在一些实施例中，所述受试者超重或肥胖。在一些实施例中，所述受试者的身体质量指数在25与29.9之间。在一些其他实施例中，所述受试者的身体质量指数为30或更高。
在某些其他方面，本披露提供了gdf15肽在降低受试者的食欲和/或减轻体重中的用途，其中所述gdf15肽是例如，如使用本文所述的检测方法所确定，在与所述gdf15肽接触的细胞中诱导生物学反应，和/或具有gfral信号传导活性的物质。在一些实施例中，所述生物学反应是信号转导反应(例如，erk活化或信号传导，或akt活化或信号传导)。在一些实施例中，所述生物学反应是所述细胞中蛋白的表达或活性与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。在一些实施例中，所述生物学反应是ret-erk、ret-akt、蛋白激酶c、jak/stat、jnk、p38和rac1路径中的一种或多种中细胞内蛋白的表达或活性增加或减少。在一些实施例中，所述蛋白是所述ret-erk路径中选自以下的细胞内蛋白：erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2。在一些实施例中，所述蛋白是所述ret-akt路径中选自以下的细胞内蛋白：akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor。
在一些实施例中，所述生物学反应是所述细胞中蛋白激酶的磷酸化与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白激酶的磷酸化相比增加或减少。在一些实施例中，所述蛋白激酶是细胞内蛋白激酶，其中所述细胞内蛋白激酶被所述细胞表面受体激酶直接或间接磷酸化。在一些实施例中，所述受试者超重或肥胖。在一些实施例中，所述受试者的身体质量指数在25与29.9之间。在一些其他实施例中，所述受试者的身体质量指数为30或更高。
在某些其他方面，本披露提供了一种治疗肥胖或肥胖相关障碍的方法，所述方法包括向受试者施用gdf15肽和gfral(例如，可溶性gfral)，其中所述gdf15肽例如，如使用本文所述的检测方法所确定，在与所述gdf15肽接触的细胞中诱导生物学反应，和/或具有gfral信号传导活性，并且其中所述gfral包含有包含结构域d2和d3的gfral细胞外结构域。在一些实施例中，所述gfral是可溶性gfral。在一些实施例中，所述gfral包含缺乏结构域d1的gfral细胞外结构域。在一些实施例中，所述gfral进一步包含信号肽。在一些实施例中，所述gfral由缺乏结构域d1的gfral细胞外结构域和任选的信号肽组成。在一些实施例中，所述gfral包含seqidno:1的氨基酸序列或其功能变体或者由其组成。在一些实施例中，所述gfral或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gfral或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gfral包含seqidno:2的氨基酸序列或其功能变体或者由其组成。在一些实施例中，所述gfral进一步包含(例如，融合至)亲和标签。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域，例如包含seqidno:1或seqidno:2的氨基酸序列的所述gfral细胞外结构域，进一步包含(例如，融合至)亲和标签。在一些实施例中，所述亲和标签包含淀粉样β前体蛋白(app)标签、组氨酸(his)标签、flag标签或myc标签或者其组合。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域包含seqidno:3的氨基酸序列或其功能变体，或者seqidno:25的氨基酸序列或其功能变体。在一些实施例中，所述gfral是包含gfral细胞外结构域的可溶性gfral，所述gfral细胞外结构域包含结构域d2和d3但缺乏结构域d1。
在一些实施例中，同时施用所述gdf15肽和所述gfral。在一些其他实施例中，依次施用所述gdf15肽和所述gfral。在一些实施例中，所述gdf15肽和所述gfral处于相同组合物中。在一些实施例中，所述gdf15肽和所述gfral处于混合物中。在一些实施例中，所述gdf15肽和所述gfral处于复合物中。在一些实施例中，所述gdf15肽和所述gfral处于二元复合物中。在一些实施例中，所述生物学反应是信号转导反应(例如，erk活化或信号传导，或akt活化或信号传导)。在一些实施例中，所述生物学反应是所述细胞中蛋白的表达或活性与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。在一些实施例中，所述生物学反应是ret-erk、ret-akt、蛋白激酶c、jak/stat、jnk、p38和rac1路径中的一种或多种中细胞内蛋白的表达或活性增加或减少。在一些实施例中，所述蛋白是所述ret-erk路径中选自以下的细胞内蛋白：erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2。在一些实施例中，所述蛋白是所述ret-akt路径中选自以下的细胞内蛋白：akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor。
在一些实施例中，所述生物学反应是所述细胞中蛋白激酶的磷酸化与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白激酶的磷酸化相比增加或减少。在一些实施例中，所述蛋白激酶是细胞内蛋白激酶，其中所述细胞内蛋白激酶被所述细胞表面受体激酶直接或间接磷酸化。可以将所述gdf15肽和所述gfral配制在一种或多种合适的治疗组合物例如包含药学上可接受的载体的治疗组合物中，或者进行包装以供储存(例如，冻干)，随后重构以施用于患者。施用可以通过任何合适的途径进行，例如静脉内、皮下、肠胃外、肌肉内等。在一些实施例中，所述受试者超重或肥胖。在一些实施例中，所述受试者的身体质量指数在25与29.9之间。在一些其他实施例中，所述受试者的身体质量指数为30或更高。在一些实施例中，所述肥胖相关障碍是癌症、体重障碍或代谢疾病或障碍。在一些实施例中，所述肥胖相关障碍是癌症、t2dm、nash、高甘油三酯血症或心血管疾病。
在某些其他方面，本披露提供了gdf15肽和gfral(例如，可溶性gfral)在治疗受试者的肥胖或肥胖相关障碍中的用途，其中所述gdf15肽例如，如使用本文所述的检测方法所确定，在与所述gdf15肽接触的细胞中诱导生物学反应，和/或具有gfral信号传导活性，并且其中所述gfral包含有包含结构域d2和d3的gfral细胞外结构域。在一些实施例中，所述gfral是可溶性gfral。在一些实施例中，所述gfral包含缺乏结构域d1的gfral细胞外结构域。在一些实施例中，所述gfral进一步包含信号肽。在一些实施例中，所述gfral包含seqidno:1的氨基酸序列或其功能变体或者由其组成。在一些实施例中，所述gfral或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gfral或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gfral包含seqidno:2的氨基酸序列或其功能变体或者由其组成。在一些实施例中，所述gfral，例如包含seqidno:1或seqidno:2的氨基酸序列的所述gfral，进一步包含(例如，融合至)亲和标签。在一些实施例中，所述亲和标签包含淀粉样β前体蛋白(app)标签、组氨酸(his)标签、flag标签或myc标签或者其组合。在一些实施例中，所述gfral包含seqidno:3的氨基酸序列或其功能变体，或者seqidno:25的氨基酸序列或其功能变体。在一些实施例中，所述gfral是包含gfral细胞外结构域的可溶性gfral，所述gfral细胞外结构域包含结构域d2和d3但缺乏结构域d1。
在一些实施例中，同时施用所述gdf15肽和所述gfral。在一些其他实施例中，依次施用所述gdf15肽和所述gfral。在一些实施例中，所述gdf15肽和所述可溶性gfral处于相同组合物中。在一些实施例中，所述gdf15肽和所述gfral处于混合物中。在一些实施例中，所述gdf15肽和所述gfral处于复合物中。在一些实施例中，所述gdf15肽和所述gfral处于二元复合物中。在一些实施例中，所述生物学反应是信号转导反应(例如，erk活化或信号传导，或akt活化或信号传导)。在一些实施例中，所述生物学反应是所述细胞中蛋白的表达或活性与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。在一些实施例中，所述生物学反应是ret-erk、ret-akt、蛋白激酶c、jak/stat、jnk、p38和rac1路径中的一种或多种中细胞内蛋白的表达或活性增加或减少。在一些实施例中，所述蛋白是所述ret-erk路径中选自以下的细胞内蛋白：erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2。在一些实施例中，所述蛋白是所述ret-akt路径中选自以下的细胞内蛋白：akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor。
在一些实施例中，所述生物学反应是所述细胞中蛋白激酶的磷酸化与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白激酶的磷酸化相比增加或减少。在一些实施例中，所述蛋白激酶是细胞内蛋白激酶，其中所述细胞内蛋白激酶被所述细胞表面受体激酶直接或间接磷酸化。在一些实施例中，所述受试者超重或肥胖。在一些实施例中，所述受试者的身体质量指数在25与29.9之间。在一些其他实施例中，所述受试者的身体质量指数为30或更高。在一些实施例中，所述肥胖相关障碍是癌症、体重障碍或代谢疾病或障碍。在一些实施例中，所述肥胖相关障碍是癌症、t2dm、nash、高甘油三酯血症或心血管疾病。
在某些其他方面，本披露提供了一种降低食欲和/或减轻体重的方法，所述方法包括向受试者施用gdf15肽和gfral(例如，可溶性gfral)，其中所述gdf15肽例如，如使用本文所述的检测方法所确定，在与所述gdf15肽接触的细胞中诱导生物学反应，和/或具有gfral信号传导活性，并且其中所述gfral包含有包含结构域d2和d3的gfral细胞外结构域。在一些实施例中，所述gfral是可溶性gfral。在一些实施例中，所述gfral包含缺乏结构域d1的gfral细胞外结构域。在一些实施例中，所述gfral进一步包含信号肽。在一些实施例中，所述gfral由缺乏结构域d1的gfral细胞外结构域和任选的信号肽组成。在一些实施例中，所述gfral包含seqidno:1的氨基酸序列或其功能变体或者由其组成。在一些实施例中，所述gfral或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gfral或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gfral包含seqidno:2的氨基酸序列或其功能变体或者由其组成。在一些实施例中，所述gfral，例如包含seqidno:1或seqidno:2的氨基酸序列的所述gfral，进一步包含(例如，融合至)亲和标签。在一些实施例中，所述亲和标签包含淀粉样β前体蛋白(app)标签、组氨酸(his)标签、flag标签或myc标签或者其组合。在一些实施例中，所述gfral包含seqidno:3的氨基酸序列或其功能变体，或者seqidno:25的氨基酸序列或其功能变体。在一些实施例中，所述gfral是包含gfral细胞外结构域的可溶性gfral，所述gfral细胞外结构域包含结构域d2和d3但缺乏结构域d1。
在一些实施例中，同时施用所述gdf15肽和所述gfral。在一些其他实施例中，依次施用所述gdf15肽和所述gfral。在一些实施例中，所述gdf15肽和所述gfral处于相同组合物中。在一些实施例中，所述gdf15肽和所述gfral处于混合物中。在一些实施例中，所述gdf15肽和所述gfral处于复合物中。在一些实施例中，所述gdf15肽和所述gfral处于二元复合物中。在一些实施例中，所述生物学反应是信号转导反应(例如，erk活化或信号传导，或akt活化或信号传导)。在一些实施例中，所述生物学反应是所述细胞中蛋白的表达或活性与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。在一些实施例中，所述生物学反应是ret-erk、ret-akt、蛋白激酶c、jak/stat、jnk、p38和rac1路径中的一种或多种中细胞内蛋白的表达或活性增加或减少。在一些实施例中，所述蛋白是所述ret-erk路径中选自以下的细胞内蛋白：erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2。在一些实施例中，所述蛋白是所述ret-akt路径中选自以下的细胞内蛋白：akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor。
在一些实施例中，所述生物学反应是所述细胞中蛋白激酶的磷酸化与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白激酶的磷酸化相比增加或减少。在一些实施例中，所述蛋白激酶是细胞内蛋白激酶，其中所述细胞内蛋白激酶被所述细胞表面受体激酶直接或间接磷酸化。可以将所述gdf15肽和所述gfral配制在一种或多种合适的治疗组合物例如包含药学上可接受的载体的治疗组合物中，或者进行包装以供储存(例如，冻干)，随后重构以施用于患者。施用可以通过任何合适的途径进行，例如静脉内、皮下、肠胃外、肌肉内等。在一些实施例中，所述受试者超重或肥胖。在一些实施例中，所述受试者的身体质量指数在25与29.9之间。在一些其他实施例中，所述受试者的身体质量指数为30或更高。
在某些其他方面，本披露提供了gdf15肽和gfral(例如，可溶性gfral)在降低受试者的食欲和/或减轻体重中的用途，其中所述gdf15肽例如，如使用本文所述的检测方法所确定，在与所述gdf15肽接触的细胞中诱导生物学反应，和/或具有gfral信号传导活性，并且其中所述gfral包含有包含结构域d2和d3的gfral细胞外结构域。在一些实施例中，所述gfral是可溶性gfral。在一些实施例中，所述gfral包含缺乏结构域d1的gfral细胞外结构域。在一些实施例中，所述gfral进一步包含信号肽。在一些实施例中，所述gfral由缺乏结构域d1的gfral细胞外结构域和任选的信号肽组成。在一些实施例中，所述gfral包含seqidno:1的氨基酸序列或其功能变体或者由其组成。在一些实施例中，所述gfral或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gfral或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gfral包含seqidno:2的氨基酸序列或其功能变体或者由其组成。在一些实施例中，所述gfral，例如包含seqidno:1或seqidno:2的氨基酸序列的所述gfral，进一步包含(例如，融合至)亲和标签。在一些实施例中，所述亲和标签包含淀粉样β前体蛋白(app)标签、组氨酸(his)标签、flag标签或myc标签或者其组合。在一些实施例中，所述gfral包含seqidno:3的氨基酸序列或其功能变体，或者seqidno:25的氨基酸序列或其功能变体。在一些实施例中，所述gfral是包含gfral细胞外结构域的可溶性gfral，所述gfral细胞外结构域包含结构域d2和d3但缺乏结构域d1。
在一些实施例中，同时施用所述gdf15肽和所述gfral。在一些其他实施例中，依次施用所述gdf15肽和所述gfral。在一些实施例中，所述gdf15肽和所述可溶性gfral处于相同组合物中。在一些实施例中，所述gdf15肽和所述gfral处于混合物中。在一些实施例中，所述gdf15肽和所述gfral处于复合物中。在一些实施例中，所述gdf15肽和所述gfral处于二元复合物中。在一些实施例中，所述生物学反应是信号转导反应(例如，erk活化或信号传导，或akt活化或信号传导)。在一些实施例中，所述生物学反应是所述细胞中蛋白的表达或活性与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。在一些实施例中，所述生物学反应是ret-erk、ret-akt、蛋白激酶c、jak/stat、jnk、p38和rac1路径中的一种或多种中细胞内蛋白的表达或活性增加或减少。在一些实施例中，所述蛋白是所述ret-erk路径中选自以下的细胞内蛋白：erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2。在一些实施例中，所述蛋白是所述ret-akt路径中选自以下的细胞内蛋白：akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor。
在一些实施例中，所述生物学反应是所述细胞中蛋白激酶的磷酸化与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白激酶的磷酸化相比增加或减少。在一些实施例中，所述蛋白激酶是细胞内蛋白激酶，其中所述细胞内蛋白激酶被所述细胞表面受体激酶直接或间接磷酸化。在一些实施例中，所述受试者超重或肥胖。在一些实施例中，所述受试者的身体质量指数在25与29.9之间。在一些其他实施例中，所述受试者的身体质量指数为30或更高。
在本文所述的治疗方法和用途的一些实施例中，所述gdf15肽包含seqidno:13的氨基酸序列或其功能变体，所述氨基酸序列或其功能变体包括seqidno:14、15、16或17的氨基酸序列。在一些实施例中，所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gdf15肽包含亲和标签、融合、缀合、peg化和/或糖基化。在一些实施例中，所述gdf15肽用淀粉样β前体蛋白(app)标签、组氨酸标签、flag标签或myc标签或者其组合标记。在一些实施例中，所述gdf15肽与人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、免疫球蛋白恒定区或α-1-抗胰蛋白酶融合。在其他实施例中，所述gdf15肽与脂肪酸缀合。
在仍其他方面，本披露提供了能够与gfral配体(例如，gdf15肽)结合的gfral细胞外结构域。在各种实施例中，本披露更具体地提供了包含结构域d2和d3的gfral细胞外结构域。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域缺乏结构域d1。在一些实施例中，gfral细胞外结构域包含结构域d2和d3，并且缺乏结构域d1。在一些实施例中，与包含结构域d1的gfral细胞外结构域相比，缺乏结构域d1的所述gfral细胞外结构域表现出增加的与gdf15的结合活性。在一些实施例中，当所述gfral细胞外结构域与gdf15结合或与gdf15复合时，与包含结合结构域d1的gfral细胞外结构域相比，缺乏结构域d1的所述gfral细胞外结构域表现出增加的ret活化和/或信号传导效力。
在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域不在细胞表面上表达。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域通过系链与所述细胞表面附接。在一些其他实施例中，所述gfral细胞外结构域是可溶性的。
在各种实施例中，本披露还提供了一种包含gfral细胞外结构域的可溶性gfral，所述gfral细胞外结构域包含结构域d2和d3。在一些实施例中，所述可溶性gfral包含缺乏结构域d1的gfral细胞外结构域。在一些实施例中，所述可溶性gfral进一步包含信号肽。在一些实施例中，所述gfral由缺乏结构域d1的gfral细胞外结构域和任选的信号肽组成。在一些实施例中，所述可溶性gfral包含seqidno:1的氨基酸序列或其功能变体或者由其组成。在一些实施例中，所述可溶性gfral或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述可溶性gfral或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述可溶性gfral包含seqidno:2的氨基酸序列或其功能变体或者由其组成。在一些实施例中，所述可溶性gfral或其功能变体，例如包含seqidno:1或seqidno:2的氨基酸序列的所述可溶性gfral或其功能变体，进一步包含(例如，融合至)亲和标签。在一些实施例中，所述亲和标签包含淀粉样β前体蛋白(app)标签、组氨酸(his)标签、flag标签或myc标签或者其组合。在一些实施例中，所述可溶性gfral或其功能变体包含seqidno:3的氨基酸序列或其功能变体，或者seqidno:25的氨基酸序列或其功能变体。
在仍其他方面，本披露提供了鉴别能够调节gdf15活性的药剂的方法，以及将此类药剂配制成药物组合物的方法。
例如，在某些方面，本披露提供了一种鉴别能够调节gdf15活性的药剂的方法，所述方法包括：(a)使分离和修饰的细胞与所述药剂和gdf15肽接触；以及(b)检测所述经接触细胞中的生物学反应，其中所述细胞表达包含结构域d2和d3的gfral细胞外结构域以及细胞表面受体激酶；并且其中如果所述经接触细胞中的生物学反应相对于在所述药剂不存在下与所述gdf15肽接触的细胞中的生物学反应增加或减少，则确定所述药剂调节gdf15活性。在一些实施例中，所述药剂是抗体。在一些实施例中，所述药剂是抗gdf15抗体。在一些实施例中，所述药剂是抗gfral抗体。在一些实施例中，所述gdf15肽包含seqidno:13的氨基酸序列或其功能变体，所述氨基酸序列或其功能变体包括seqidno:14、15、16或17的氨基酸序列。在一些实施例中，所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gdf15肽包含亲和标签、融合、缀合、peg化和/或糖基化。在一些实施例中，所述gdf15肽用淀粉样β前体蛋白(app)标签、组氨酸标签、flag标签或myc标签或者其组合标记。在一些实施例中，所述gdf15肽与人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、免疫球蛋白恒定区或α-1-抗胰蛋白酶融合。在一些实施例中，所述gdf15肽与脂肪酸缀合。
在某些方面，本披露提供了一种鉴别能够调节gdf15活性的药剂的方法，所述方法包括：(a)提供表达细胞表面受体激酶的细胞；(b)使所述细胞与gdf15肽和可溶性gfral接触；(c)使所述细胞与所述药剂接触；以及(d)检测所述经接触细胞中的生物学反应，其中所述可溶性gfral包含有包含结构域d2和结构域d3并且缺乏结构域d1的gfral细胞外结构域。在一些实施例中，如果在所述gdf15肽、所述可溶性gfral和所述药剂存在下所述经接触细胞中的生物学反应相对于所述药剂不存在下与所述gdf15肽和所述可溶性gfral接触的细胞中的生物学反应增加，则确定所述药剂调节或增加gdf15活性。在其他实施例中，如果在所述gdf15肽、所述可溶性gfral和所述药剂存在下所述经接触细胞中的生物学反应相对于所述药剂不存在下与所述gdf15肽和所述可溶性gfral接触的细胞中的生物学反应减少，则确定所述药剂调节或减少gdf15活性。在一些实施例中，所述药剂是抗体。在一些实施例中，所述药剂是抗gdf15抗体。在一些实施例中，所述药剂是抗gfral抗体。
在一些实施例中，所述可溶性gfral包含seqidno:1的氨基酸序列或其功能变体。在一些实施例中，所述可溶性gfral或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述可溶性gfral或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述可溶性gfral，例如包含seqidno:1或seqidno:2的所述可溶性gfral，进一步包含(例如，融合至)亲和标签。在一些实施例中，所述亲和标签包含淀粉样β前体蛋白(app)标签、组氨酸(his)标签、flag标签或myc标签或者其组合。在一些实施例中，所述可溶性gfral或其功能变体包含seqidno:3的氨基酸序列或其功能变体，或者seqidno:25的氨基酸序列或其功能变体。
在一些实施例中，所述gdf15肽包含seqidno:13的氨基酸序列或其功能变体或者由其组成，所述氨基酸序列或其功能变体包括seqidno:14、15、16或17的氨基酸序列。在一些实施例中，所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少95％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gdf15肽进一步包含(例如，融合至)亲和标签、融合、缀合、peg化和/或糖基化。在一些实施例中，所述gdf15肽用淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、flag标签或myc标签或者其组合标记。在一些实施例中，所述gdf15肽与人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、免疫球蛋白恒定区或α-1-抗胰蛋白酶融合。在一些实施例中，所述gdf15肽与脂肪酸缀合。
在某些其他方面，本披露提供了一种生产包含药剂的药物组合物的方法，所述方法包括：(a)通过本文所述的任何示例性鉴别方法鉴别能够调节gdf15活性的药剂；以及(b)将所述药剂配制在药物组合物中。在一些实施例中，所述药剂是抗体。在一些实施例中，所述药剂是抗gdf15抗体。在一些实施例中，所述药剂是抗gfral抗体。
在某些其他方面，本披露提供了一种治疗受试者的肥胖或肥胖相关障碍的方法，所述方法包括：(a)通过本文所述的任何示例性鉴别方法鉴别能够调节gdf15活性的药剂；以及(b)向所述受试者施用所述药剂。在一些实施例中，所述药剂是抗体。在一些实施例中，所述药剂是抗gdf15抗体。在一些实施例中，所述药剂是抗gfral抗体。在一些实施例中，所述受试者超重或肥胖。在一些实施例中，所述受试者的身体质量指数在25与29.9之间。在一些实施例中，所述受试者的身体质量指数为30或更高。在一些实施例中，所述肥胖相关障碍是癌症、体重障碍或代谢疾病或障碍。在一些实施例中，所述肥胖相关障碍是癌症、t2dm、nash、高甘油三酯血症或心血管疾病。
在某些其他方面，本披露提供了一种降低受试者的食欲和/或减轻体重的方法，所述方法包括：(a)通过本文所述的任何示例性鉴别方法鉴别能够调节gdf15活性的药剂；以及(b)向所述受试者施用所述药剂。在一些实施例中，所述药剂是抗体。在一些实施例中，所述药剂是抗gdf15抗体。在一些实施例中，所述药剂是抗gfral抗体。在一些实施例中，所述受试者超重或肥胖。在一些实施例中，所述受试者的身体质量指数在25与29.9之间。在一些实施例中，所述受试者的身体质量指数为30或更高。
在一方面，本文提供了一种检测gdf15肽的活性的方法，所述方法包括：(i)(a)提供表达细胞表面受体激酶的细胞；(b)使所述细胞与所述gdf15肽和可溶性gfral接触，其中所述可溶性gfral包含有包含结构域d2和d3的gfral细胞外结构域；以及(c)检测所述经接触细胞中的生物学反应；或(ii)(a)提供表达细胞表面受体激酶以及包含结构域d2和d3的gfral细胞外结构域的细胞；(b)使所述细胞与所述gdf15肽接触；以(c)检测所述经接触细胞中的生物学反应。
在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域缺乏结构域d1。在一些实施例中，所述方法包括提供表达细胞表面受体激酶和gfral细胞外结构域的细胞，其中(i)所述gfral细胞外结构域是可溶性gfral细胞外结构域，或(ii)所述gfral细胞外结构域通过系链附接于细胞表面。
在一些实施例中，所述系链：(i)是gfral跨膜结构域或其功能片段；(ii)包含seqidno:18的氨基酸序列或其功能变体；(iii)是与所述gfral细胞外结构域融合的异源跨膜结构域；(iv)是糖磷脂酰肌醇(gpi)；(v)包含seqidno:19的氨基酸序列或其功能变体、seqidno:20的氨基酸序列或其功能变体或者seqidno:21的氨基酸序列或其功能变体；(vi)是膜插入序列，(vii)包含seqidno:22的氨基酸序列或其功能变体；或者seqidno:23的氨基酸序列或其功能变体；或(viii)是膜插入脂肪酸。
在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域进一步包含信号肽。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域用选自淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、flag标签和myc标签的亲和标签标记。
在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域(i)包含seqidno:1的氨基酸序列或其功能变体；(ii)与seqidno:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性；(iii)与seqidno:1的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性；(iv)包含seqidno:2的氨基酸序列或其功能变体；(v)与seqidno:2的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性；(vi)与seqidno:2的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性；(vii)包含seqidno:3的氨基酸序列或其功能变体；或(viii)包含seqidno:25的氨基酸序列或其功能变体。
在一些实施例中，所述gdf15肽或其功能变体(i)包含seqidno:13、14、15、16或17的氨基酸序列或其功能变体；(ii)与seqidno:13的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性；或(iii)与seqidno:13的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
在一些实施例中，所述gdf15肽(i)用选自淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、flag标签和myc标签的亲和标签标记；(ii)与人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、免疫球蛋白恒定区或α-1-抗胰蛋白酶融合；(iii)与脂肪酸缀合；(iv)具有peg化，和/或(v)具有糖基化。在一些实施例中，所述细胞表面受体激酶是(i)内源细胞表面受体激酶；(ii)外源细胞表面受体激酶；和/或(iii)ret受体酪氨酸激酶。
在一些实施例中，所述细胞不表达(i)内源gfral；(ii)全长gfral；和/或(iii)内源gdf15。在一些实施例中，所述细胞是包含无效gdf15基因的gdf15敲除(ko)细胞。
在一些实施例中，(i)在所述gdf15肽、所述可溶性gfral或所述gfral细胞外结构域和所述细胞表面受体激酶形成三元复合物时诱导所述生物学反应；(ii)在所述可溶性gfral不存在下与所述gdf15肽接触的细胞中不诱导所述生物学反应；和/或(iii)所述生物学反应是所述细胞中蛋白的表达或活性与不与所述gdf15肽和/或所述可溶性gfral接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。在一些实施例中，所述生物学反应是ret-erk、ret-akt、蛋白激酶c、jak/stat、jnk、p38和rac1路径中的一种或多种中细胞内蛋白的表达或活性增加或减少。
在一些实施例中，所述细胞表面受体激酶是ret受体酪氨酸激酶，并且所述蛋白是(i)所述ret-erk路径中选自以下的细胞内蛋白：erk1、erk2、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2或其任何下游靶标；或(ii)所述ret-akt路径中选自以下的细胞内蛋白：akt1、akt2、akt3、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor或其任何下游靶标。在一些实施例中，所述生物学反应是所述细胞中蛋白激酶的磷酸化与不与所述gdf15肽和/或所述可溶性gfral接触的对照细胞中相同蛋白激酶的磷酸化相比增加或减少。
在一些实施例中，(i)所述蛋白激酶是细胞表面受体激酶；(ii)所述蛋白激酶和/或细胞表面受体激酶是ret受体酪氨酸激酶；或(iii)所述蛋白激酶是细胞内蛋白激酶，其中所述细胞内蛋白激酶被所述细胞表面受体激酶直接或间接磷酸化。在一些实施例中，所述蛋白激酶是(i)所述ret-erk路径中选自以下的细胞内蛋白激酶：erk1、erk2、jak1、jak2、raf、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2或其任何下游靶标；或(ii)所述ret-akt路径中选自以下的细胞内蛋白激酶：akt1、akt2、akt3、src、jak1、jak2、pi3k、pdk1、mlk3、ask1、gsk3α、gsk3β和mtor或其任何下游靶标。
在一方面，本文提供了一种用于检测gdf15肽的活性的分离和修饰的细胞，其中所述细胞表达包含结构域d2和d3的gfral细胞外结构域以及细胞表面受体激酶。
在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域缺乏结构域d1。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域是(i)可溶性gfral细胞外结构域；或(ii)通过系链附接于细胞表面。在一些实施例中，所述系链(i)是gfral跨膜结构域或其功能片段；(ii)包含seqidno:18的氨基酸序列或其功能变体；(iii)是与所述gfral细胞外结构域融合的异源跨膜结构域；(iv)是糖磷脂酰肌醇(gpi)；(v)包含seqidno:19的氨基酸序列或其功能变体、seqidno:20的氨基酸序列或其功能变体或者seqidno:21的氨基酸序列或其功能变体；(vi)是膜插入序列；(vii)包含seqidno:22的氨基酸序列或其功能变体，或者seqidno:23的氨基酸序列或其功能变体；或(viii)是膜插入脂肪酸。
在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域进一步包含信号肽。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域用选自淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、flag标签和myc标签的亲和标签标记。
在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域(i)包含seqidno:1的氨基酸序列或其功能变体；(ii)与seqidno:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性；(iii)与seqidno:1的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性；(iv)包含seqidno:2的氨基酸序列或其功能变体；(v)与seqidno:2的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性；(vi)与seqidno:2的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性；(vii)包含seqidno:3的氨基酸序列或其功能变体；或(viii)包含seqidno:25的氨基酸序列或其功能变体。在一些实施例中，所述细胞表面受体激酶是(i)内源细胞表面受体激酶；(ii)外源细胞表面受体激酶；和/或(iii)ret受体酪氨酸激酶。
在一些实施例中，所述细胞不表达(i)内源gfral；(ii)全长gfral；和/或(iii)内源gdf15。在一些实施例中，所述细胞是包含无效gdf15基因的gdf15敲除(ko)细胞。在一些实施例中，所述细胞选自哺乳动物细胞、人细胞、mcf7细胞、sh-sy5y细胞和hek293a-gdf15ko细胞。
在一方面，本文提供了一种用于确定gdf15肽的活性的试剂盒，其中所述试剂盒包含如权利要求19至29中任一项所述的细胞以用于与所述gdf15肽接触；以及检测所述经接触细胞中的生物学反应的构件。
在一方面，本文提供了一种包含gfral细胞外结构域的可溶性gfral，所述gfral细胞外结构域包含结构域d2和d3。
在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域缺乏结构域d1。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域进一步包含信号肽。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域用选自淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、flag标签和myc标签的亲和标签标记。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域：(i)包含seqidno:1的氨基酸序列或其功能变体；(ii)与seqidno:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性；(iii)与seqidno:1的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性；(iv)包含seqidno:2的氨基酸序列或其功能变体；(v)与seqidno:2的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性；(vi)与seqidno:2的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性；(vii)包含seqidno:3的氨基酸序列或其功能变体；或(viii)包含seqidno:25的氨基酸序列或其功能变体。
在一方面，本文提供了一种鉴别能够调节gdf15活性的药剂的方法，其中所述方法包括：(a)使如权利要求19至29中任一项所述的细胞与所述药剂和gdf15肽接触；以及(b)检测所述经接触细胞中的生物学反应，其中如果所述经接触细胞中的生物学反应相对于在所述药剂不存在下与所述gdf15肽接触的细胞中的生物学反应增加或减少，则确定所述药剂调节gdf15活性。
在一方面，本文提供了一种鉴别能够调节gdf15活性的药剂的方法，所述方法包括：(a)提供表达细胞表面受体激酶的细胞；(b)使所述细胞与gdf15肽和可溶性gfral接触，其中所述可溶性gfral包含有包含结构域d2和d3并且缺乏结构域d1的gfral细胞外结构域；(c)使所述细胞与所述药剂接触；以及(d)检测所述经接触细胞中的生物学反应，其中(i)如果在所述gdf15肽、所述可溶性gfral和所述药剂存在下所述经接触细胞中的生物学反应相对于所述药剂不存在下与所述gdf15肽和所述可溶性gfral接触的细胞中的生物学反应增加，则确定所述药剂调节或增加gdf15活性；或(ii)如果在所述gdf15肽、所述可溶性gfral和所述药剂存在下所述经接触细胞中的生物学反应相对于所述药剂不存在下与所述gdf15肽和所述可溶性gfral接触的细胞中的生物学反应减少，则确定所述药剂调节或减少gdf15活性。
在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域用选自淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、flag标签和myc标签的亲和标签标记。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域：(i)包含seqidno:1的氨基酸序列或其功能变体；(ii)与seqidno:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性；(iii)与seqidno:1的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性；(iv)包含seqidno:2的氨基酸序列或其功能变体；(v)与seqidno:2的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性；(vi)与seqidno:2的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性；(vii)包含seqidno:3的氨基酸序列或其功能变体；或(viii)包含seqidno:25的氨基酸序列或其功能变体。在一些实施例中，所述药剂是选自抗gdf15抗体和抗gfral抗体的抗体。
在一些实施例中，所述生物学反应是ret-erk、ret-akt、蛋白激酶c、jak/stat、jnk、p38和rac1路径中的一种或多种中细胞内蛋白的表达、活性或磷酸化水平增加或减少。在一些实施例中，所述细胞内蛋白在所述ret-erk路径中并且选自erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2。在一些实施例中，所述细胞内蛋白在所述ret-akt路径中并且选自akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor。
在一些实施例中，所述gdf15肽或其功能变体：(i)包含seqidno:13、14、15、16或17的氨基酸序列或其功能变体；(ii)与seqidno:13的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性；或(iii)与seqidno:13的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
在一些实施例中，所述gdf15肽：(i)用选自淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、flag标签和myc标签的亲和标签标记；(ii)与人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、免疫球蛋白恒定区或α-1-抗胰蛋白酶融合；(iii)与脂肪酸缀合；(iv)具有peg化；和/或(v)具有糖基化。
附图说明
图1显示了示例性的人gfral细胞外结构域(ecd)构建体。全长gfral(ecd)-his通过缺失跨膜结构域和c端细胞质尾，并添加六个组氨酸(his)标签产生。gfral(d2d3)-app通过缺失结构域d1(gdnf受体(gfrα1)同源物d1)和近膜区(x)，并添加淀粉样β前体蛋白(app)表位标签产生。gfral(d2d3)-his通过缺失结构域d1(gdnf受体(gfrα1)同源物d1)和近膜区(x)，并添加六个组氨酸(his)标签产生。gfral(ecd)-fc通过将gfral(ecd)与人免疫球蛋白g1(igg1)恒定区(fc)结构域融合产生。人cret(ecd)-fc通过将人ret细胞外结构域(ret-ecd)与人igg1fc融合产生。还产生了his-gdf15，这是一种n端用六个组氨酸标记的人gdf15。缩写：s.p.-cd33信号肽；d1-d3-gdnf受体(gfrα1)同源物的结构域d1-d3；app-淀粉样β前体蛋白；x-结构域d3与跨膜结构域之间功能未知的区域；ecd-细胞外结构域；ret-在转染期间重排。
图2a显示了示例性的his-gdf15和gfral(d2d3)-app构建体。图2b显示了通过sds-page分析进行的级分筛选。图2b中显示的单个蛋白带含有gfral(d2d3)-app单体(24.6kd)和his-gdf15二聚体(二聚体为26.6kd，单体为13.3kd)两者。
图3显示从若干个级分浓缩的复合物含有共表达的gfral(d2d3)-app和his-gdf15，如通过sds-page在还原条件下所揭示。所述复合物含有24.6kdgfral(d2d3)-app和13.3kdhis-gdf15。
图4a显示了在非还原条件下通过sds-page分析的含有his-gdf15/gfral(ecd)-fc复合物的级分。图4b显示从图4a中的级分浓缩的复合物含有his-gdf15和gfral(ecd)-fc，如通过sds-page在还原条件下所揭示。
图5显示了在不同的蛋白浓度(0-5log10pm)下，纯化的his-gdf15复合物与纯化的重组可溶性gfralecd变体的组合对cret(ecd)-fc包被的板的结合活性。
图6显示了在不同的蛋白浓度(0-5log10pm)下，his-gdf15与gfral(ecd)-his或his-gdf15(l294r)与gfral(ecd)-his的纯化的混合物对cret(ecd)-fc包被的板的结合活性。
图7显示了用培养基处理15min后sh-sy5y细胞中erk和akt的磷酸化(泳道1)；gdnf-3.3nm(+gfrα/ret的对照)(泳道2)；纯化的his-gdf15/gfral(d2d3)-app复合物-27.8nm(泳道3)；纯化的his-gdf15/gfral(d2d3)-app复合物-83.3nm(泳道4)；纯化的his-gdf15/gfral(d2d3)-app复合物-250nm(泳道5)；纯化的his-gdf15/gfral(ecd)-fc复合物-27.8nm(泳道6)；纯化的his-gdf15/gfral(ecd)-fc复合物-83.3nm(泳道7)；纯化的his-gdf15/gfral(ecd)-fc复合物-250nm(泳道8)；单独的his-gdf15-250nm(泳道9)；单独的gfral(d2d3)-app-250nm(泳道10)；单独的gfral(ecd)-fc-250nm(泳道11)；添加到细胞中之前60min在培养基中形成的his-gdf15+gfral(d2d3)-app-每种组分250nm(泳道12)，如通过western印迹所分析。对于泳道3-8，共表达gdf15/gfral复合物并且从共转染的hek293f细胞的上清液共纯化。
图8显示了用培养基处理15min后mcf7细胞中erk和akt的磷酸化(泳道1)；gdnf-3.3nm(+gfrα/ret的对照)(泳道2)；纯化的his-gdf15/gfral(d2d3)-app复合物-27.8nm(泳道3)；纯化的his-gdf15/gfral(d2d3)-app复合物-83.3nm(泳道4)；纯化的his-gdf15/gfral(d2d3)-app复合物-250nm(泳道5)；纯化的his-gdf15/gfral(ecd)-fc复合物-27.8nm(泳道6)；纯化的his-gdf15/gfral(ecd)-fc复合物-83.3nm(泳道7)；纯化的his-gdf15/gfral(ecd)-fc复合物-250nm(泳道8)；单独的his-gdf15-250nm(泳道9)；单独的gfral(d2d3)-app-250nm(泳道10)；单独的gfral(ecd)-fc-250nm(泳道11)；以及添加到细胞中之前60min在培养基中形成的his-gdf15+gfral(d2d3)-app-每种组分250nm(泳道12)，如通过western印迹所分析。对于泳道3-8，共表达gdf15/gfral复合物并且从共转染的hek293f细胞的上清液共纯化。
图9显示了用培养基处理15min后sh-sy5y和mcf7细胞中erk和akt的浓度依赖性磷酸化(泳道1)；gdnf-3.3nm(泳道2)；gfral(d2d3)-app+his-gdf15-28nm(每一种)(泳道3)；gfral(d2d3)-app+his-gdf15-83nm(泳道4)；gfral(d2d3)-app+his-gdf15-250nm(泳道5)；培养基(泳道7)；gdnf-3.3nm(泳道8)；gfral(d2d3)-app+his-gdf15-28nm(泳道9)；gfral(d2d3)-app+his-gdf15-83nm(泳道10)；以及gfral(d2d3)-app+his-gdf15-250nm(泳道12)，如通过western印迹所分析。在处理之前，将gfral(d2d3)-app+his-gdf15在培养基中混合并在室温下孵育1小时。
图10a-10b显示了用以下处理5-15min后，mcf7细胞(图10a)和sh-sy5y细胞(图10b)中erk和akt的磷酸化：gdnf-15min(泳道1)；培养基-5min(泳道2)；gfral(d2d3)-app+his-gdf15-5min(泳道3)；培养基-10min(泳道4)；gfral(d2d3)-app+his-gdf15-10min(泳道5)；培养基-15min(泳道6)；gfral(d2d3)-app+his-gdf15-15min(泳道7)；培养基-15min(泳道8)；以及gfral(d2d3)-app+his-gdf15-15min，复合物未预孵育(泳道9)，如通过western印迹所分析。
图11a-11b显示了当与gfral(d2d3)-app或全长gfral(ecd)重构(预混合)时，不同形式的纯化gdf15蛋白对mcf7细胞erk磷酸化诱导的效力。数据表示为绝对磷酸基-erkalphalisa测定信号单位(图11a)以及磷酸化的erk信号相对于培养基对照的倍数增加(图11b)。
图12a-12b显示了当与gfral(d2d3)-app或全长gfral(ecd)重构(预混合)时，不同形式的纯化gdf15蛋白对sh-sy5y细胞erk磷酸化诱导的效力。数据表示为绝对磷酸基-erkalphalisa测定信号单位(图12a)以及磷酸化的erk信号相对于培养基对照的倍数增加(图12b)。
具体实施方式
为了可以更容易地理解本披露，在整个具体实施方式中定义了某些术语。除非本文另外定义，否则本披露使用的所有科学和技术术语具有与本领域普通技术人员通常所理解相同的含义。
如本文所用，“gfral”或“gdnf家族受体α样”是指具有任何天然存在的全长gfral受体多肽的氨基酸序列的gfral受体多肽或其任何变体或功能片段，所述gfral受体多肽或其任何变体或功能片段能够(1)与gdf15结合；并且(2)促进与全长gfral相关的生物学反应，诸如在与gdf15复合时结合至并活化ret细胞表面受体，和/或响应于gdf15刺激促进细胞内信号传导(例如，ret-erk信号传导、ret-akt信号传导)。在一些实施例中，所述gfral是全长哺乳动物gfral(例如，人、猴、大鼠或小鼠gfral)或其变体或功能片段。在一些实施例中，所述gfral是全长人gfral或其变体或功能片段。本文提供了人gfral的示例性氨基酸和核酸序列。参见例如表1，其包括全长人gfral的示例性序列(氨基酸：seqidno:9(uniprot参考序列：q6uxv0)；核酸：seqidno:24(ncbi参考序列：nm_207410.2))以及其示例性变体和功能片段。li等人(jneurochem[神经化学杂志]2005；95(2):361-76)和wo2003/076569也描述了示例性的人gfral。
如本文所用的术语“受体”是指与称为“配体”的生物活性分子结合的细胞相关蛋白。在一些实施例中，受体是gfral，并且配体是gdf15。本披露的gfral受体多肽可以是“膜结合的”或“可溶的”。
如本文所用，“gfral配体”是指与gfral受体多肽或者其变体或功能片段结合的生物活性分子。gfral配体可以是gfral的拮抗剂或激动剂。在一些实施例中，所述gfral配体是gdf15肽。在一些实施例中，所述gdf15肽可以是全长肽或保留激动或拮抗gfral的能力的片段。在一些实施例中，肽或片段可以进一步与其他肽或其他治疗、药代动力学或载体部分缀合或融合。在一些实施例中，所述gdf15肽可以与脂肪酸缀合。例如，脂肪酸缀合的gdf15肽可以是wo2015/200078中披露的任何此种肽，所述文献通过引用并入本文中。在一些其他实施例中，所述gdf15肽可以与血清白蛋白，例如，人血清白蛋白(hsa)或小鼠血清白蛋白(msa)融合。在仍其他实施例中，所述gdf15肽可以与α-1-抗胰蛋白酶或免疫球蛋白恒定区(例如，免疫球蛋白g1恒定区)融合。gdf15融合肽例如可以是在wo2015/198199或wo2017/109706中披露的任何此种肽，所述文献均通过引用并入本文中。在一些其他实施例中，肽或片段可以例如，通过掺入序列变异，通过将短肽序列添加到所述肽或片段的n和/或c端，和/或通过peg化和/或糖基化进一步修饰，使得修饰的肽或片段保留未修饰的gdf15肽的一种或多种功能。
如本文所用，“可溶性gfral”是指未结合至细胞膜或锚定在细胞膜中的gfral受体多肽或其变体或功能片段。可溶性受体多肽通常是配体结合型受体多肽，其缺乏跨膜和细胞内结构域，或与细胞膜的其他连接，诸如糖磷酸肌醇。可溶性受体多肽可以包含其他氨基酸残基，诸如免疫球蛋白恒定区序列(例如，人免疫球蛋白g1fc序列)，或提供多肽纯化或提供多肽附接于底物的位点的亲和标签(例如，淀粉样β前体蛋白(app)标签或组氨酸(his)标签)。可溶性受体多肽通常基本上不含跨膜和细胞内多肽区段，此时，所述可溶性受体多肽缺乏这些区段的足够部分来分别提供膜锚定或信号转导。在一些实施例中，所述gfral是可溶性gfral(例如，可溶性人gfral)。在一些实施例中，所述可溶性gfral包含gfral细胞外结构域。在一些实施例中，所述可溶性gfral包含缺乏足够长度跨膜结构域的gfral细胞外结构域，使得所述可溶性gfral不存在于细胞膜上或锚定在细胞膜中。
如本文所用，“膜结合的gfral”是指结合至细胞膜或锚定在细胞膜中的gfral受体多肽或其变体或功能片段。在一些实施例中，所述gfral是膜结合的gfral(例如，膜结合的人gfral)。在一些实施例中，所述膜结合的gfral包含gfral细胞外结构域。在一些实施例中，所述膜结合的gfral包含系于细胞表面的gfral细胞外结构域。
如本文所用的术语“系”是指多肽的物理修饰(例如，使多肽定位于细胞表面的结构域或脂肪酰化位点的添加)。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域通过系链(tether)与细胞表面附接。在一些实施例中，所述系链是gfral跨膜结构域。在一些实施例中，所述系链是gfral跨膜结构域功能片段。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域或系链包含天然gfral跨膜结构域的氨基酸序列。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域或系链包含seqidno:18的氨基酸序列或其功能变体。在一些实施例中，所述系链是与所述gfral细胞外结构域融合的异源跨膜结构域。
在一些实施例中，所述系链是糖磷脂酰肌醇(gpi)或能够指导gpi接头添加的序列。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域或系链包含seqidno:19的氨基酸序列或其功能变体、seqidno:20的氨基酸序列或其功能变体或者seqidno:21的氨基酸序列或其功能变体。在一些实施例中，所述系链是膜插入序列，例如自主膜插入序列或vergères等人,jbiolchem[生物化学杂志]1995；270(7):3414-22中描述的序列，所述文献通过引用并入本文中。示例性的膜插入序列包括但不限于细胞色素b5的跨膜c端结构域(seqidno:22和23)(参见例如，vergères等人,jbiolchem[生物化学杂志]1995；270(7):3414-22)。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域或系链包含seqidno:22的氨基酸序列或其功能变体，或者seqidno:23的氨基酸序列或其功能变体。在一些其他实施例中，所述系链是膜插入脂肪酸。在一些其他实施例中，所述系链是与gfral的细胞外结构域融合的异源跨膜结构域。在一些实施例中，所述跨膜结构域将gfral细胞外结构域定位于细胞表面。
如本文所用，术语“变体”是指相对于参考(未修饰的)天然氨基酸序列经修饰的序列。修饰的序列相对于参考序列含有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入(或密码子的相应取代、缺失和/或插入)。变体不一定需要对参考序列进行物理操作。只要序列与参考序列相比含有不同的氨基酸，无论其合成方式如何，都将其视为“变体”。在某些实施例中，变体与参考序列相比具有高氨基酸序列同源性。在一些实施例中，变体涵盖具有氨基酸取代、缺失和/或插入的多肽，只要所述多肽与参考序列或与参考序列的相应区段(例如，功能片段)具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％氨基酸序列同一性。参考序列可以是例如人gfral(seqidno:9；uniprot参考序列：q6uxv0)。参考序列还可以是例如人gfral的功能片段，诸如人gfral的全长细胞外结合结构域(seqidno:4；uniprot参考序列：q6uxv0的氨基酸20-351)。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域是人gfral的全长细胞外结合结构域的变体。
在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域包含结构域d2和d3，但缺乏结构域d1(参见例如，seqidno:1)。在一些实施例中，所述参考序列是seqidno:1。在一些实施例中，所述gfral和/或gfral细胞外结构域与seqidno:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gfral和/或gfral细胞外结构域与seqidno:1的氨基酸序列具有至少85％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gfral和/或gfral细胞外结构域与seqidno:1的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gfral和/或gfral细胞外结构域与seqidno:1的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性。
在一些实施例中，包含结构域d2和d3但缺乏结构域d1的所述gfral细胞外结构域进一步包含信号肽(参见例如，seqidno:2)。在一些实施例中，所述参考序列是seqidno:2。在一些实施例中，所述gfral和/或gfral细胞外结构域与seqidno:2的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gfral和/或gfral细胞外结构域与seqidno:2的氨基酸序列具有至少85％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gfral和/或gfral细胞外结构域与seqidno:2的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gfral和/或gfral细胞外结构域与seqidno:2的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性。
在一些实施例中，包含结构域d2和d3但缺乏结构域d1的所述gfral细胞外结构域进一步包含(例如，融合至)亲和标签(参见例如，seqidno:3或seqidno:25)。在一些实施例中，所述参考序列是seqidno:3。在一些实施例中，所述参考序列是seqidno:25。在一些实施例中，所述gfral和/或gfral细胞外结构域与seqidno:3或seqidno:25的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gfral和/或gfral细胞外结构域与seqidno:3或seqidno:25的氨基酸序列具有至少85％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gfral和/或gfral细胞外结构域与seqidno:3或seqidno:25的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。在一些实施例中，所述gfral和/或gfral细胞外结构域与seqidno:3或seqidno:25的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性。
术语“同一性”或“同源性”是指如通过比较序列所确定，两个或更多个多肽的序列之间的关系。“同一性”还指如由两个或更多个氨基酸残基的串之间的匹配数所确定，多肽之间的序列相关性程度。“同一性”测量了两个或更多个序列中较小序列之间同一性匹配的百分比，其中用数学模型或计算机程序(即，算法)解决空位比对(如果有的话)。相关蛋白的同一性能够通过已知方法容易地计算。此类方法包括但不限于在以下文献中描述的方法：“computationalmolecularbiology[计算分子生物学]”(leskam编,oxforduniversitypress[牛津大学出版社],newyork[纽约],1988)；和“biocomputing:informaticsandgenomeprojects[生物计算：信息学和基因组计划]”(smithdw编,academicpress[学术出版社],newyork[纽约],1993)。
在一些实施例中，本文所述的组合物和方法中使用的所述gfral是gfral的变体，例如人gfral的变体或其功能片段。此类变体包含在术语“gfral”中。术语“gfral变体”是指保留了如下能力的gfral变体：(1)与gdf15结合；并且(2)促进与全长gfral相关的生物学反应，诸如在与gdf15复合时结合至并活化ret细胞表面受体，和/或促进细胞内信号传导(例如，ret-erk信号传导、ret-akt信号传导)。gfral变体可以是截短的gfral、gfral类似物或gfral衍生物。术语“截短的gfral”是指野生型gfral的功能片段。野生型gfral的功能片段可以包含例如全长gfral细胞外结构域或仅包含结构域d2和d3的gfral细胞外结构域。术语“gfral类似物”是指修饰的gfral，其中野生型gfral的一个或多个氨基酸残基已被其他天然或非天然氨基酸残基取代，和/或其中一个或多个天然或非天然氨基酸残基已被添加到野生型gfral中。术语“gfral衍生物”是指具有或不具有取代、添加或缺失一个或多个天然或非天然氨基酸残基的化学修饰的野生型gfral，其中在野生型gfral中不存在至少一个取代基。典型的修饰包括但不限于酰胺、碳水化合物、烷基基团、酰基基团、酯和peg化。
如本文所用，“gfral细胞外结构域”是指缺乏跨膜和细胞内(细胞质)结构域的gfral受体多肽。gfral细胞外结构域可以包括或可以不包括n端信号肽，并且可以衍生自任何物种。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域是哺乳动物gfral(例如，人、猴、大鼠或小鼠gfral)的细胞外结构域。在一些实施例中，所述gfral细胞外结构域是人gfral的细胞外结构域。术语“gfral细胞外结构域”包括野生型gfral细胞外结构域和gfral细胞外结构域变体。
在gfral细胞外结构域内，存在三个独立的富含半胱氨酸的亚结构域：结构域1(d1)、结构域2(d2)和结构域3(d3)。gfral的某些特性可以归因于这些亚结构域的活性和/或结合亲和力。例如，已经鉴别结构域d2内的氨基酸残基是gfral与gdf15结合的相互作用界面氨基酸。同样，已经鉴别结构域d3内的氨基酸残基是gfral与ret结合的相互作用界面氨基酸。参见例如，wo2017/152105。术语“gfral细胞外结构域”涵盖包含这些结构域(d1、d2和d3)中的一个、两个或全部三个的gfral细胞外结构域。在一些实施例中，gfral细胞外结构域包含结构域d1、d2和d3。在其他实施例中，gfral细胞外结构域包含结构域d2和d3，但缺乏结构域d1。在一些实施例中，包含结构域d2和d3但缺乏结构域d1的gfral细胞外结构域进一步包含n端信号肽。
表1中阐述了示例性gfral序列和构建体。
表1.示例性gfral序列和构建体。
*带下划线的序列指示cd33信号肽(seqidno:10)。
**粗体序列指示编码序列(cds)。
本披露至少部分基于以下发现：对gfral细胞外结构域的某些修饰在例如gdf15活性测定和治疗组合中赋予了优于野生型gfral细胞外结构域的功能优势。参见例如，实例3-11。在一些实施例中，与包含结构域d1的相应gfral细胞外结构域相比，包含结构域d2和d3但缺乏结构域d1的gfral细胞外结构域表现出增加的与gdf15的结合活性。在一些实施例中，与包含结构域d1的相应gfral细胞外结构域(与gdf15的复合物)相比，包含结构域d2和d3但缺乏结构域d1的gfral细胞外结构域(与gdf15的复合物)在ret活化和信号传导中表现出增加的效力。
gfrald1结构域包含6个n-糖基化位点，从而引起异质n-糖基化，并使全长gfral细胞外结构域的分子量增加高达18kd(goodman等人,cellrep[细胞报道]2014；8(6):1894-1904)。gfrald2结构域能够与gdf15结合并与ret细胞外结构域的近膜半胱氨酸富集区相互作用。不希望受理论限制，gfrald1结构域上碳水化合物的存在和全长gfral细胞外结构域的折叠可以遮蔽或抑制gfrald2结构域与gdf15和ret细胞外结构域的相互作用。
例如，如本文提供的实例所述，从全长gfral细胞外结构域去除结构域d1后，gdf15与包含结构域d2和d3但缺乏结构域d1的gfral细胞外结构域(gfral(d2d3))可以形成比gdf15与全长gfral细胞外结构域(gfral(ecd))更小更紧凑的复合物。不受理论限制，此更小更紧凑的复合物可以更好地嵌入ret细胞外结构域二聚形成的囊袋中，从而使gfral(d2d3)/gdf15复合物与ret的结合活性增加。此可以使gfral(d2d3)/gdf15复合物在ret活化中的效力增加，并为治疗和细胞基测定目的均提供了益处。gfral(ecd)/gdf15的较大复合物可能不太稳定。同样，基于结合测定中的观察结果，在细胞表面上与ret接合后，较大复合物与表面ret的相互作用可能不如较小复合物强，因此导致ret活化和信号传导的效力降低。
在一些实施例中，包含结构域d2和d3但缺乏结构域d1的gfral细胞外结构域的益处可以提供增强的测定以评价gdf15肽的效力或功效。在一些实施例中，包含结构域d2和d3但缺乏结构域d1的gfral细胞外结构域的这些益处可以通过单独施用gfral或施用gfral与gdf15肽(例如，与脂肪酸缀合或白蛋白融合的gdf15肽)的组合来提供治疗肥胖或相关障碍的改进的治疗益处。
在某些方面，本文的披露内容特征在于检测gdf15肽的活性的细胞基测定，所述测定包括：(a)提供表达细胞表面受体激酶的细胞；(b)使所述细胞与所述gdf15肽和可溶性gfral接触；以及(c)检测所述经接触细胞中的生物学反应，其中所述可溶性gfral包含有包含结构域d2和d3的gfral细胞外结构域。
在某些其他方面，本披露的特征在于检测gdf15肽的活性的细胞基测定，所述测定包括：(a)提供表达gfral细胞外结构域(例如，可溶性gfral细胞外结构域)和细胞表面受体激酶的细胞；(b)使所述细胞与所述gdf15肽接触；以及(c)检测所述经接触细胞中的生物学反应，其中所述gfral细胞外结构域包含结构域d2和d3。
如本文所用，“gdf15”和“gdf15肽”是指哺乳动物来源的任何gdf15多肽或其变体或功能片段。在各种实施例中，所述gdf15肽是人gdf15肽或其变体或功能片段。在各种实施例中，人gdf15被合成为308个氨基酸的前蛋白(seqidno:12；uniprot参考序列：q99988)，所述前蛋白包括信号肽(氨基酸1-29)、前肽(氨基酸30-196)和112个氨基酸的成熟gdf15肽(氨基酸197-308(也鉴别为seqidno:13))(参见例如，bootcov等人,procnatlacadsciusa[美国国家科学院院刊]1997；94(21):11514-9)，但这些亚序列之间的边界可以略微变化。例如，在各种实施例中，所述人gdf15前蛋白(seqidno:12；uniprot参考序列：q99988)可以再分为信号肽(氨基酸1-29)、前肽(氨基酸30-194)和成熟gdf15肽(氨基酸195-308)。在各种实施例中，成熟gdf15肽包含seqidno:12的氨基酸197-308，并且在本文中鉴别为seqidno:13。在各种其他实施例中，成熟gdf15肽包含seqidno:12的氨基酸200-308，并且在本文中鉴别为seqidno:14。
另外，已经报道了序列变化。例如，seqidno:12的氨基酸202、269和288已经被分别报道为asp、glu和ala(参见例如，hromas等人,biochimbiophysacta[生物化学与生物物理学报]1997；1354(1):40-4；lawton等人,gene[基因]1997；203(1):17-26)。例如，在amaya-amaya等人,jimmunolres[免疫学研究杂志]2015；2015:270763中描述了在氨基酸202处含有asp取代的示例性序列变体(“gdf15h6d变体”)。
gdf15肽的变体或其功能片段可以以任何所需的组合包括一个或多个氨基酸缺失、添加和/或取代。氨基酸序列变化(例如，通过氨基酸缺失、添加和/或取代)的量限于保留成熟gdf15肽的活性(例如，gfral信号传导活性)。在一些实施例中，成熟gdf15肽的变体以任何所需的组合相对于seqidno:13具有约1至约20、约1至约18、约1至约17、约1至约16、约1至约15、约1至约14、约1至约13、约1至约12、约1至约11、约1至约10、约1至约9、约1至约8、约1至约7、约1至约6或约1至约5个氨基酸缺失、添加或取代。可替代地或另外，当相对于seqidno:13的全长测量时，所述变体可以具有与seqidno:13具有至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在各种实施例中，gdf15肽或变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。在各种实施例中，gdf15肽或变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少85％氨基酸序列同一性。在各种实施例中，gdf15肽或变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。在各种实施例中，gdf15肽或变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性。
本文披露的gdf15肽和变体还可以包含其他修饰，诸如亲和标签(例如，his标签)、peg化、糖基化、融合(例如与人或小鼠血清白蛋白、免疫球蛋白恒定区)和缀合(例如与脂肪酸)。参见例如，wo2015/200078中披露的缀合，所述文献通过引用并入本文中；还参见wo2015/198199和wo2017/109706中披露的融合，所述文献均通过引用并入本文中。术语“gdf15肽”涵盖包含亲和标签、peg化、糖基化、融合、缀合或任何其他一种或多种修饰或用上述修饰进行修饰的gdf15肽和变体，这些修饰可以支持对所述肽的期望生理学反应(例如，期望pk、清除率、半衰期、溶解度等)。
不希望受理论限制，据报道gdf15与gfral受体特异性结合，并且gfral受体需要与共受体ret缔合以响应于gdf15刺激引发细胞内信号传导(yang等人,natmed[自然医学]2017；23(10):1158-1166)。此外，通常已知生物活性gdf15是通过一个链间二硫键共价连接的成熟肽的25-kd同二聚体。因此，当gdf15肽是gdf15的变体时，任何氨基酸缺失、添加和/或取代通常在不参与受体结合或肽-肽界面的位置处。例如，认为seqidno:12的位置216、222、223、225、237、239、241、252、253、254、257、258、260、261、264、265、268、269、270、273、275、276、279、297、299、300和308处的氨基酸参与肽-肽界面。这些位置处的任何氨基酸取代通常是不利的，并且任何取代通常是保守取代。在一些实施例中，表面暴露但不是物种间保守的氨基酸可以被其他氨基酸取代而不破坏肽的折叠或其活性。gdf15的任何此种变体可以用作本文披露内容中的gdf15肽。此类变体也可以缀合至第二药剂，例如治疗剂、可检测标记和/或支持对肽的期望pk、清除率、半衰期和/或其他生理学反应的药剂(例如，组氨酸标记的、白蛋白标记或脂肪酸标记的gdf15肽变体)。本文披露的gdf15肽和变体包括gdf15的天然存在和合成的变体。示例性变体包括但不限于：(i)gdf15h6d变体(参见例如amaya-amaya等人,jimmunolres[免疫学研究杂志]2015；2015:270763，所述文献通过引用并入本文中)；(ii)gdf15与免疫球蛋白恒定区的融合体(参见例如，xiong等人,scitranslmed[科学转化医学]2017；9(412):eaan8732；以及wo2012/138919，所述文献均通过引用并入本文中)；(iii)gdf15与α-1-抗胰蛋白酶的融合体(参见例如，wo2016/102580，所述文献通过引用并入本文中)；(iv)向gdf15n端和/或c端添加短肽(参见例如wo2017/202936，所述文献通过引用并入本文中)；(v)序列变化，例如以改进溶解度(参见例如美国专利号9,161,966，所述文献通过引用并入本文)；以及(vi)peg化和/或糖基化(例如，参见美国公开号us2015/0023960a1和美国专利号9,161,966，所述文献均通过引用并入本文中)。
其他变体包括本文披露的那些变体(参见例如，seqidno:15-17)和在以下文献中描述的其他变体：wo2013/148117、wo2014/120619、wo2015/197446、wo2015/198199、wo2016/069921、wo2016/018931和wo2016/102580，所述文献均通过引用并入本文中。wo2013/148117、wo2014/120619、wo2015/197446、wo2015/198199、wo2016/069921、wo2016/018931或wo2016/102580中描述的任何gdf15肽或变体均可以用作本文的披露内容中的gdf15肽。
表2中阐述了示例性gdf15序列。
表2.示例性gdf15序列。
*带下划线的序列指示cd33信号肽(seqidno:10)。
如本文所用，“活性”是指gfral配体(例如，gdf15肽)在生物过程中实现改变的能力。在一些实施例中，gfral配体的活性由其在与所述配体接触的细胞中是否引发或诱导指定生物学反应来确定。在一些实施例中，当将测试分子与参考标准或参考分子比较时，细胞基活性测定的结果表示为“相对活性”。相对活性的使用使得可以在同一测定中直接比较测试分子与参考分子，从而减少对最终报道结果的影响或不同批次之间的差异。
在细胞基活性测定中，通常使用参考分子来指定相对活性，从而确保对各种待测试分子的活性测量进行标准化。如本文所用，在gfral配体活性测定中的“参考分子”是指具有已知生物学活性的gfral配体。例如，gfral配体可以是具有已知生物学活性的gdf15肽。在一些实施例中，参考分子是野生型或重组野生型gdf15肽(例如，人或重组人gdf15)。在其他实施例中，所述参考分子是野生型或重组野生型gdf15肽的变体(例如，人或重组人gdf15的变体，其中gdf15变体的生物学活性是已知的)。在仍其他实施例中，所述参考分子是用于治疗用途的代表性批次的gdf15。在一些实施例中，使细胞在培养板中生长，并在一定浓度范围内用参考分子和待测试的gfral配体刺激。在一些实施例中，浓度范围覆盖了从0到最大浓度的整个剂量反应范围。在一些其他实施例中，整个剂量反应曲线呈s形。
如本文所用，“生物学反应”是指细胞与gfral配体诸如gdf15肽接触后在细胞中的反应。生物学反应可以包括与以下有关的任何反应，例如：细胞信号传导或信号转导(例如，蛋白激酶的磷酸化)、基因转录、蛋白表达、毒性、细胞因子释放、细胞增殖、细胞运动或形态、细胞生长停滞或者细胞死亡(例如，细胞凋亡)。
在各种实施例中，可以使用本文所述或本领域已知的任何示例性测定评价或测量细胞与gfral配体诸如gdf15肽接触后细胞中的生物学反应。在各种实施例中，所述测定涉及使细胞或细胞培养物与gfral配体(例如，gdf15肽)接触，并确定细胞或培养物的一种或多种特性在接触后是否改变。在各种实施例中，可以检测以下的变化：rna表达水平、蛋白表达水平、蛋白活性水平、蛋白修饰水平(例如，蛋白磷酸化)、报告信号水平、毒性、细胞因子释放、细胞增殖、细胞运动或形态、细胞生长停滞和/或细胞死亡(例如，细胞凋亡)。
在一些实施例中，所述生物学反应是经接触细胞中蛋白的表达或活性与不与所述gfral配体(例如，gdf15肽)接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。在一些实施例中，所述生物学反应是信号转导反应。在一些实施例中，所述信号转导反应包含细胞内蛋白上的丝氨酸、酪氨酸或苏氨酸残基的磷酸化。在一些实施例中，所述信号转导反应包含erk(例如，erk1、erk2)的磷酸化。在一些实施例中，所述信号转导反应包含akt(例如，akt1、akt2、akt3)的磷酸化。
在一些实施例中，使用一种或多种测定检测所述生物学反应以评价蛋白表达、活性和/或磷酸化水平。在一些实施例中，使用选自以下的一种或多种测定检测所述生物学反应：激酶或酶活性测定、全细胞与放射性标记的32p-正磷酸酯的孵育、二维凝胶电泳、免疫印迹测定(例如，western印迹)、
术语“信号转导”是指涉及细胞外刺激物通过细胞表面受体，通过特定和连续的一系列分子传递到细胞核中的基因，从而产生对刺激物的特异性细胞反应的生化过程。信号转导通常是控制细胞活动并协调细胞作用的通信系统的一部分。通过此类通信系统，细胞可以感知并对细胞外条件的变化作出反应。在本披露的各种实施例中，与gfral配体(例如，gdf15肽)接触的细胞通过启动信号转导反应来对gfral配体的存在作出反应。在各种实施例中，与gfral配体(例如，gdf15肽)和gfral受体多肽(例如，可溶性gfral)接触的细胞通过启动信号转导反应来对gfral配体和gfral受体多肽的存在作出反应。在各种实施例中，所述细胞是内源性或外源性表达细胞表面受体激酶的细胞。在各种实施例中，所述细胞表面受体激酶是ret受体酪氨酸激酶。在各种实施例中，所述细胞还表达外源gfral细胞外结构域。
gfral，神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(gdnf)受体α家族的孤儿成员，已经被鉴别为直接与gdf15结合的受体。然而，为了响应于gdf15刺激引发细胞内信号传导，gfral与gdf15的复合物典型地结合并活化ret细胞表面受体激酶。gdf15典型地在仅表达gfral或仅表达ret的细胞中不诱导下游信号，但是在表达gfral和ret两者的细胞中可以检测到gdf15信号。不希望受理论限制，据信gdf15的体内活性通过gfral和ret两者通过形成三元复合物介导。在各种实施例中，gdf15肽和gfral受体多肽(例如，可溶性gfral)形成二元复合物。在各种实施例中，所述二元复合物与ret结合以形成三元复合物。在各种实施例中，gdf15-gfral-ret三元复合物的形成活化ret并刺激ret介导的细胞内信号传导。
如本文所用的术语“复合物”是指彼此具有亲和力的至少两个部分(例如，化学或生化部分)之间的非共价缔合。复合物的实例包括抗原/抗体、凝集素/亲和素、靶标多核苷酸/探针寡核苷酸、抗体/抗抗体、受体/配体(例如，gfral和gdf15)、酶/配体、多肽/多肽、多肽/多核苷酸、多肽/辅因子、多肽/底物、多肽/抑制剂、多肽/小分子等之间的非共价缔合。术语“二元复合物”是指两个此类部分，诸如受体和配体(例如，gfral和gdf15)之间非共价缔合。术语“三元复合物”是指三个部分，诸如受体、共受体和配体(例如，gfral、gdf15和ret)之间非共价缔合。
如本文所用，“ret”是指具有任何天然存在的全长ret受体多肽的氨基酸序列的ret受体多肽或其任何变体或功能片段，所述ret受体多肽或其任何变体或功能片段能够结合与gdf15复合时的gfral并被所述gfral活化。在一些实施例中，所述ret是全长哺乳动物ret(例如，人、猴、大鼠或小鼠ret)或其变体或功能片段。在一些实施例中，所述ret是全长人ret。
“ret”是“转染期间重排”的缩写，因为最初发现在3t3纤维母细胞系中在其用获自人淋巴瘤细胞的dna转染后ret基因的dna序列重排。人ret基因的天然可变剪接可产生ret蛋白的3种不同同种型：ret51、ret43和ret9。这三种同种型在其n端共有相同的1063个氨基酸，但分别在其细胞质c端含有51、43和9个不同的氨基酸。本文中的术语“ret”涵盖所有三种同种型。ret是受体酪氨酸激酶的典型代表，具有细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内激酶结构域。参见例如，mulligan,natrevcancer[自然评论·癌症]2014；14(3):173-86。
在各种实施例中，当ret被gfral与gdf15的复合物结合时，发生ret活化。在各种实施例中，当gdf15、gfral和ret形成三元复合物(即，gdf15-gfral-ret三元复合物)时，发生ret活化。在各种实施例中，ret活化包含ret二聚和ret细胞内激酶结构域中某些残基的磷酸化。ret细胞内结构域中的此类磷酸化残基可促进与信号传导分子(诸如磷脂酶cγ(plcγ))或与各种衔接子蛋白的直接相互作用，这可以引起多个下游信号路径的活化。
在各种实施例中，gfral配体(例如，gdf15肽)的活性通过其在与所述配体接触的细胞中是否引发或诱导指定生物学反应来确定。在一些实施例中，所述指定生物学反应是信号转导反应。在一些实施例中，所述信号转导反应涉及以下中的一种或多种的活化：erk/mapk路径、pi3k/akt路径、蛋白激酶c路径、jak/stat路径、jnk路径、p38路径和rac1路径，所述活化可以根据本领域已知的方法测量。
信号转导的一种主要机制涉及蛋白磷酸化。在一些实施例中，所述信号转导反应是与gfral配体(例如，gdf15肽)接触的细胞中蛋白激酶的磷酸化与不与gfral配体接触的对照细胞中相同蛋白激酶的磷酸化相比增加或减少。
如本文所用，“蛋白激酶”是指将磷酸基团从磷酸供体转移到底物蛋白中的受体氨基酸上的酶。可以基于受体氨基酸特异性将蛋白激酶分类。两种最充分表征的蛋白激酶类型是蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶(蛋白醇基团为受体的蛋白激酶)和蛋白酪氨酸激酶(蛋白酚基团为受体的蛋白激酶)。ret，以及被活化的ret直接或间接磷酸化的所有蛋白激酶，均欲涵盖在术语“蛋白激酶”中。示例性的蛋白激酶如本文中所述，并且其他蛋白激酶为本领域中所已知。ret受体相互作用和信号转导路径评述于例如mulligan,natrevcancer[自然评论·癌症]2014；14(3):173-86中。
在一些实施例中，所述蛋白激酶是erk/mapk路径(在本文中也称为“ret-erk”路径)的细胞内蛋白激酶。在一些实施例中，所述蛋白激酶选自erk(erk1、erk2)、jak1、jak2、raf、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2或其任何下游靶标中的一种或多种。在一些实施例中，所述蛋白激酶选自erk(erk1、erk2)、jak1、jak2、raf、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2中的一种或多种。ret-erk路径中的示例性细胞内蛋白包括erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2，以及任何上游调节物及其下游靶标。在一些实施例中，与gfral配体(例如，gdf15肽)接触的细胞中的信号转导反应可以是ret-erk路径中任何细胞内蛋白的表达或活性与不与gfral配体接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。
在一些实施例中，所述蛋白激酶是pi3k/akt路径(在本文中也称为“ret-akt”路径)的细胞内蛋白激酶。在一些实施例中，所述蛋白激酶选自akt(akt1、akt2、akt3)、src、jak1、jak2、pi3k、pdk1、mlk3、ask1、gsk3α、gsk3β和mtor或其任何下游靶标中的一种或多种。在一些实施例中，所述蛋白激酶选自akt(akt1、akt2、akt3)、src、jak1、jak2、pi3k、pdk1、mlk3、ask1、gsk3α、gsk3β和mtor中的一种或多种。在一些实施例中，所述ret-akt路径中的下游靶标是s6激酶。所述ret-akt路径中的示例性细胞内蛋白包括akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor以及其任何上游调节物和下游靶标。在一些实施例中，与gfral配体(例如，gdf15肽)接触的细胞中的信号转导反应可以是ret-akt路径中任何细胞内蛋白的表达或活性与不与gfral配体接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。
在一些实施例中，所述蛋白激酶是所述蛋白激酶c路径的细胞内蛋白激酶。在一些实施例中，所述蛋白激酶是蛋白激酶c。在一些实施例中，ret活化包含磷脂酶cγ(plcγ)的磷酸化。在一些实施例中，磷酸化的plcγ活化了蛋白激酶c路径。参见例如，mullican等人,natmed[自然医学]2017；23(10):1150-7。在一些实施例中，与gfral配体(例如，gdf15肽)接触的细胞中的信号转导反应可以是蛋白激酶c路径中任何细胞内蛋白的表达或活性与不与gfral配体接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。
在一些实施例中，所述蛋白激酶是所述jak/stat路径中的细胞内蛋白激酶。在一些实施例中，所述蛋白激酶选自jak1和jak2中的一种或多种。jak/stat路径中的示例性细胞内蛋白包括：jak1、jak2和stat3，所述细胞内蛋白已经参与ret信号传导(参见例如，mulligan,natrevcancer[自然评论·癌症]2014；14(3):173-86)，以及jak3、tyk2、stat1、stat2和stat5。在一些实施例中，与gfral配体(例如，gdf15肽)接触的细胞中的信号转导反应可以是jak/stat路径中任何细胞内蛋白的表达或活性与不与gfral配体接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。
在一些实施例中，所述蛋白激酶是所述jnk路径的细胞内蛋白激酶。在一些实施例中，所述蛋白激酶选自jnk1、jnk2、tak1、mkk4和mkk7中的一种或多种。jnk路径中的示例性细胞内蛋白包括jnk1、jnk2、tak1、mkk4和mkk7。在一些实施例中，与gfral配体(例如，gdf15肽)接触的细胞中的信号转导反应可以是jnk路径中任何细胞内蛋白的表达或活性与不与gfral配体接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。
在一些实施例中，所述蛋白激酶是所述p38路径的细胞内蛋白激酶。在一些实施例中，所述蛋白激酶选自mkk3、mkk6、p38mapk(例如，mapk11、mapk12、mapk13和mapk14)、msk1、msk2、mk2、mk3、mnk1和mnk2中的一种或多种。p38路径中的示例性细胞内蛋白包括mkk3、mkk6、p38mapk(例如，mapk11、mapk12、mapk13和mapk14)、msk1、msk2、mk2、mk3、mnk1和mnk2。在一些实施例中，与gfral配体(例如，gdf15肽)接触的细胞中的信号转导反应可以p38路径中任何细胞内蛋白的表达或活性与不与gfral配体接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。
在一些实施例中，所述蛋白激酶是所述rac1路径的细胞内蛋白激酶。在一些实施例中，所述蛋白激酶是pkn2。rac1路径中的示例性细胞内蛋白包括rac1和pkn2。在一些实施例中，与gfral配体(例如，gdf15肽)接触的细胞中的信号转导反应可以rac1路径中任何细胞内蛋白的表达或活性与不与gfral配体接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。
在一些实施例中，所述蛋白激酶是所述细胞表面受体激酶。在一些实施例中，所述蛋白激酶和/或细胞表面受体激酶是ret受体酪氨酸激酶。
已经开发了用于测量蛋白磷酸化的各种测定。针对磷酸化的酪氨酸/丝氨酸/苏氨酸残基或针对特定的磷酸化蛋白激酶的磷酸化特异性抗体的发现，使免疫学测定能够测量蛋白激酶的磷酸化，诸如免疫印迹测定(例如western印迹)、
在本披露的某些方面，与gfral配体接触的细胞是内源性表达或通过用构建体或载体转染外源性表达细胞表面受体激酶的细胞。在某些方面，所述细胞还表达外源gfral细胞外结构域。在一些实施例中，所述细胞不表达内源gfral或内源gfral细胞外结构域。在一些实施例中，所述细胞不表达内源gdf15。在一些实施例中，所述细胞是包含有效gdf15基因的gdf15ko细胞。在一些实施例中，用构建体或载体转染所述细胞以外源性表达gfral细胞外结构域。示例性细胞包括动物细胞。在一些实施例中，所述动物细胞源自哺乳动物，例如人、灵长类动物或啮齿动物。在一些实施例中，所述细胞是人细胞。在一些实施例中，mcf7细胞、sh-sy5y细胞或hek293a-gdf15ko细胞。
如本文所用，“表达”是指细胞对核酸分子的转录和翻译。
如本文所用的术语“构建体”是指已经通过人为干预(包括通过重组手段或直接化学合成)产生的核酸分子，所述核酸分子具有允许在细胞中转录和/或翻译特定核酸的一系列指定核酸元件。构建体可以是质粒、病毒或核酸片段的一部分。构建体还可以包括可整合的dna片段(即，可通过遗传重组整合到宿主基因组中的片段)和能够整合包含目的基因或核酸序列的dna片段的其他媒介物。在一些实施例中，所述构建体包含控制元件和编码ret细胞表面受体激酶的基因或核酸序列。在一些实施例中，所述构建体包含控制元件和编码gfral细胞外结构域的基因或核酸序列。示例性控制元件包括但不限于启动子系统、控制mrna表达水平的调节元件、编码核糖体结合位点的序列以及终止转录和翻译的序列。
如本文所用，术语“内源”是指物质源自生物体或在生物体内产生。“内源”基因或蛋白是存在于物种中也衍生自所述物种的基因或蛋白。
如本文所用，术语“外源”是指物质或分子源自生物体或在生物体外产生。相对于所转染的细胞，外源基因可以来自不同物种(“异源”基因)或来自相同物种(“同源”基因)。转染的细胞可以称为重组细胞。
如本文所用的术语“重组”是指多核苷酸或多肽天然不存在于宿主细胞中。重组分子可以含有两个或更多个天然存在的序列，这些序列以非天然存在的方式连接在一起。重组细胞含有重组多核苷酸或多肽。
在各种实施例中，可使用重组表达方法产生本文所述的gfral配体和gfral细胞外结构域。使用宿主细胞的重组蛋白表达是本领域中常规使用的。如本文所用，术语“宿主细胞”是指到如下细胞，其被人工工程化以包含编码肽序列的核酸，并且将转录并翻译并且任选地分泌肽至细胞生长培养基中。出于重组生产的目的，典型地通过常规方法合成或克隆编码肽的氨基酸序列的核酸，并整合至表达载体中。示例性宿主细胞包括但不限于中国仓鼠卵巢(cho)细胞、人胚肾(hek)细胞(例如，hek293、hek293t、hek293f、hek293s)、猴肾(cos)细胞(例如，cos-1、cos-7)、幼仓鼠肾脏(bhk)细胞(例如，bhk-21)、非洲绿猴肾细胞(例如，bsc-1)、hela细胞、人肝细胞癌细胞(例如，hepg2)、骨髓瘤细胞(例如，ns0、653、sp2/0)、淋巴瘤细胞、大肠杆菌(e.coli)或其他细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞，或其任何衍生物、永生化或转化的细胞。在一些实施例中，所述宿主细胞是cho细胞。在一些实施例中，所述宿主细胞是hek细胞。在一些实施例中，所述宿主细胞是hek293t、hek293f或hek293s细胞。在一些实施例中，hek293s细胞可以产生具有改变的糖基化模式(例如，较短的糖基化链)的重组蛋白(例如，重组gfral配体或gfral细胞外结构域)。
治疗方法和组合物
使用本文所述的新颖gfral受体多肽和细胞基活性测定评价的gdf15肽可以用于多种治疗或预防应用中。所述应用包括但不限于减少肥胖和治疗肥胖，预防肥胖的产生，减轻体重，逆转或减慢体重增加，降低食欲，降低喂养效率以及治疗代谢性疾病。因此，本披露提供了通过单独施用gdf15肽或施用gdf15肽与gfral受体多肽(例如，可溶性gfral)的组合来治疗肥胖和肥胖相关病症的方法。本披露还提供了通过单独施用gdf15肽或施用gdf15肽与gfral受体多肽(例如，可溶性gfral)的组合来降低例如超重或肥胖受试者的食欲和/或减轻体重的方法。还提供了单独的gdf15肽或gdf15肽与gfral受体多肽的组合例如在治疗肥胖、降低食欲和/或减轻体重中的用途。本文提供的治疗方法和用途可以用于治疗或预防肥胖和/或与体重过多有关的多种障碍和病症中的任一种。
如本文所用，术语“治疗”及其同源词是指疾病、障碍或病症(例如，心脏衰竭)或其至少一种可辨别症状的改善。在一些实施例中，“治疗”是指患者不一定可辨别的至少一个可测量物理参数的改善。在一些实施例中，“治疗”是指在身体上(例如，可辨别的症状的稳定)、在生理上(例如，身体参数的稳定)或在所述两个方面抑制疾病、障碍或病症的进展。在一些实施例中，“治疗”是指减慢疾病、障碍或病症的进展或逆转其进展。如本文所用，“治疗”及其同源词还涵盖延迟发作或降低获得给定疾病、障碍或病症的风险。
术语“受试者”和“患者”在本文中可互换地用于指任何人或非人动物。非人动物包括所有脊椎动物(例如，哺乳动物和非哺乳动物)，诸如任何哺乳动物。哺乳动物的非限制性实例包括人、小鼠、大鼠、兔、狗、猴和猪。在优选实施例中，所述受试者是人。
超重或肥胖的受试者患各种代谢疾病和严重健康问题的风险增加。这些代谢疾病和严重健康问题通常首先作为代谢综合征的一部分出现，其特征是血压升高，血糖高，腹部周围体脂肪过多以及血液胆固醇水平异常。然后会产生严重的健康问题，诸如ii型糖尿病、高血压、冠心病、中风、癌症、骨关节炎、睡眠呼吸暂停、血脂异常、胰岛素升高(胰岛素抗性)和换气不足综合征。ii型糖尿病还会引起几种其他严重健康问题，诸如糖尿病性神经病、糖尿病性肾病和糖尿病性视网膜病。需要单独使用gdf15肽或使用gdf15肽与gfral受体多肽(例如，可溶性gfral)的组合进行治疗的受试者通常是超重或肥胖的。通常，如果成年人的身体质量指数(bmi)(通过将人的体重(以千克计)除以所述人的身高(以米计)的平方而获得的测量结果)在25与29.9之间，则所述成年人被认为超重；并且如果成年人的bmi为30或更高，则认为所述成人肥胖。但是，可以调节此指南以解决种族差异。例如，通过种族调节，bmi为27.5或更高的亚裔个体可以被视为肥胖(whoexpertconsultation[who专家磋商会],lancet[柳叶刀]2004；363(9403):157-63)。产生代谢疾病的风险增加的受试者也是单独使用gdf15肽或使用gdf15肽与gfral受体多肽(例如，可溶性gfral)的组合进行治疗的候选者。例如，患有糖尿病前期或空腹血糖水平升高至100至125mg/dl的受试者，以及ii型糖尿病(空腹血糖水平为126mg/dl或更高的受试者)均为治疗的候选者。
在某些方面，本披露涉及治疗受试者的肥胖或肥胖相关障碍的方法。如本文所用的术语“肥胖”是指其中过量的体脂肪积累到可能对健康有负面影响的程度的病症，这又可能导致预期寿命降低和/或健康问题增加。在一些情况下，在受试者的身体质量指数(bmi)大于20kg/m2、21kg/m2、22kg/m2、23kg/m2、24kg/m2、25kg/m2、26kg/m2、27kg/m2、28kg/m2、29kg/m2或30kg/m2时，可认为其是肥胖的。在一些情况下，肥胖的特征还可以是以下中的一种或多种：空腹血糖水平为至少100mg/dl，血浆甘油三酯水平为至少150mg/dl，男性hdl胆固醇低于40mg/dl且女性低于50mg/dl，血压为至少130/85mmhg，并且男性腹部腰围大于40英寸且女性腹部腰围大于35英寸。
术语“肥胖相关障碍”是指可能与肥胖同时发生或者可能是体重过多的直接或间接结果的任何病症。除代谢疾病和障碍以外，所述术语还涵盖例如癌症、体重障碍。在一些实施例中，所述肥胖相关障碍是癌症、体重障碍和/或代谢疾病或障碍。本文描述了示例性的肥胖相关障碍，诸如像癌症、ii型糖尿病(t2dm)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、高甘油三酯血症和心血管疾病。
如本文所用，术语“体重障碍”是指与体重过多和/或食欲增强相关的病症。各种参数可用于确定与参考健康个体相比受试者是否超重，包括受试者的年龄、身高、性别和健康状况。例如，可以通过评定受试者的bmi来认为所述受试者超重或肥胖。在一些情况下，可以认为bmi在18.5至24.9kg/m2范围内的成年人具有正常体重；并且可以认为bmi在25与29.9kg/m2之间的成年人是超重(肥胖前)的；可以认为bmi为30kg/m2或更高的成年人是肥胖的。食欲增强经常导致体重过多。有若干种与食欲增强相关的病症，包括例如，夜间进食综合征，其特征是通常与失眠相关的早晨厌食和夜间多食，但可能与下丘脑损伤有关。
术语“代谢疾病”和类似地在本文中使用的术语包括但不限于肥胖、ii型糖尿病(t2dm)、胰腺炎、血脂异常、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、胰岛素抗性、高胰岛素血症、葡萄糖耐受不良、高甘油三酯血症、高血糖症、代谢综合征、高血压、心血管疾病、动脉粥样硬化、外周动脉疾病、中风、心脏衰竭、冠心病、糖尿病并发症(包括但不限于慢性肾病)、神经病、胃轻瘫和其他代谢障碍。
术语“代谢疾病或障碍”是指相关的一系列特征，包括但不限于高胰岛素血症、葡萄糖耐量异常、肥胖、脂肪向腹部或上体腔的重新分布、高血压、以高甘油三酯、低高密度脂蛋白(hdl)颗粒和高低密度脂蛋白(ldl)颗粒为特征的血脂异常。患有代谢疾病或障碍的受试者具有产生t2dm和例如动脉粥样硬化的风险。
如本文所用，术语“代谢综合征”是指一系列风险因素，其增加了心脏病和其他疾病如糖尿病和中风的风险。这些风险因素包括但不限于腹部脂肪(即，在大多数男性中腰臀比>0.9或bmi>30kg/m2)；高血糖(即，禁食后至少100mg/dl)；高甘油三酯(即，血流中至少150mg/dl)；低hdl(即，男性少于40mg/dl，并且女性少于50mg/dl)；以及130/85mmhg或更高的血压(世界卫生组织(worldhealthorganization))。
在某些方面，本披露还涉及治疗受试者的遗传性肥胖的方法，所述遗传性肥胖诸如普拉德-威利综合征(prader-willisyndrome)、瘦素突变和/或黑皮质素4受体突变。
示例性实施例是一种通过向受试者施用gdf15肽来治疗肥胖或肥胖相关障碍的方法，其中所述gdf15肽如使用本文所述的检测方法所确定，在与所述gdf15肽接触的细胞中诱导生物学反应，和/或具有gfral信号传导活性。可以单独施用gdf15肽或施用gdf15肽与第二药剂(例如，gfral受体多肽，例如，可溶性gfral)的组合，并且可以以任何可接受的配制品、剂量和给药方案施用。
另一个示例性实施例是一种治疗肥胖或肥胖相关障碍的方法，所述方法包括向受试者施用gdf15肽与gfral的组合，其中所述gdf15肽，如使用本文所述的检测方法所确定，在与所述gdf15肽接触的细胞中诱导生物学反应，和/或具有gfral信号传导活性，并且其中所述gfral包含有包含结构域d2和d3的gfral细胞外结构域。在一些实施例中，所述gfral是可溶性gfral。在一些实施例中，所述gfral包含缺乏结构域d1的gfral细胞外结构域。在一些实施例中，所述gfral进一步包含信号肽。在一些实施例中，所述gfral包含seqidno:1的氨基酸序列或其功能变体。在一些实施例中，所述gfral包含seqidno:2的氨基酸序列或其功能变体。
如本文所用，“组合”或“共同施用”施用是指在受试者患有医学病症(例如，肥胖)期间向受试者递送两种或更多种不同的治疗。例如，在一些实施例中，在受试者已经诊断出患有疾病或障碍之后并且在疾病或障碍已经治愈或消除之前，递送两种或更多种治疗。在一些实施例中，当第二治疗的递送开始时，第一治疗的递送仍在进行，因此存在重叠。在一些实施例中，所述第一和第二治疗同时开始。这些递送类型有时在本文中被称为“同时(simultaneous/concurrent)”或“伴随”递送。在其他实施例中，一种治疗的递送在第二治疗的递送开始前结束。此递送类型在本文中有时称为“依次”或“依次”递送。在一些实施例中，同时施用所述gdf15肽和所述gfral。在一些其他实施例中，依次施用所述gdf15和所述gfral。
在同时施用的一些实施例中，两种治疗(例如，gdf15肽和gfral)包含在同一配制品中。此类配制品可以以任何适当的形式并且通过任何合适的途径施用。在一些实施例中，所述两种治疗(例如，gdf15肽和gfral)包含在混合物中。在一些实施例中，所述两种治疗(例如，gdf15肽和gfral)处于复合物中。在一些实施例中，所述两种治疗(例如，gdf15肽和gfral)处于二元复合物中。在一些实施例中，所述两种治疗包含gdf15肽和gfral。在一些实施例中，所述gfral(例如，可溶性gfral)包含有包含结构域d2和d3但缺乏结构域d1的gfral细胞外结构域。
在同时施用的其他实施例中，两种治疗(例如，gdf15肽和gfral)以单独的配制品，以任何适当的形式并通过任何合适的途径施用。在一些实施例中，所述两种治疗包含gdf15肽和gfral。在一些实施例中，例如，所述gdf15肽和gfral可以同时或以任何顺序在不同时间点依次施用；在任一情况下，其应该在时间上充分接近地施用，以提供所需的治疗或预防作用。在一些实施例中，所述gfral(例如，可溶性gfral)包含有包含结构域d2和d3但缺乏结构域d1的gfral细胞外结构域。
采用常规的药物实践来提供包含gdf15抗体肽和/或gfral受体多肽(例如，可溶性gfral)的合适配制品或组合物，并将此类组合物施用于受试者或实验动物。配制药物组合物的方法是本领域中已知的(参见例如，“remington'spharmaceuticalsciences[雷明顿药物科学],”mackpublishingco.,easton,pa[宾夕法尼亚州伊斯顿市的麦克出版公司])。适当配制品取决于施用途径。
实例
以下实例提供本披露的说明性实施例。本领域普通技术人员将认识到可以在不改变本披露的精神或范围的情况下进行多种修改和变化。这样的修改和变化涵盖在本披露的范围内。提供的实例不以任何方式限制本披露。
实例1：产生用于gdf15结合测定的重组可溶性gfral细胞外结构域
方法：根据来自genbank和uniprot数据库的人gfral的基因核苷酸和蛋白序列(ncbi参考序列：nm_207410.2；uniprot参考序列：q6uxv0)产生人gfral(d2d3)-app(seqidno:3)、人gfral(d2d3)-his(seqidno:25)、人gfral(ecd)-his(seqidno:6)和人gfral(ecd)-fc(seqidno:7)基因构建体(图1)。通过使用vectornti软件和blast分析序列的信号肽(s.p.)和功能结构域。将含有全长人gfral细胞外结构域(gfral(ecd))、人gfral细胞外结构域的d2d3区(gfral(d2d3))以及纯化标签诸如his(六个组氨酸)、app(淀粉样β前体蛋白)或fc(人igg1fc)的基因构建体设计，合成，并在cmv启动子的控制下克隆到prs5a表达载体主链中，以在hek293t或hek293f细胞或cho细胞中进行基因表达。人cret(ecd)-fc(seqidno:8)(图1)通过将人ret细胞外结构域(ret-ecd)与人igg1fc融合产生。将人cd33信号肽(seqidno:10)与每个构建体的n端融合以引导蛋白分泌。
设计了另一种构建体his-gdf15，以编码n端用六个组氨酸标记的人gdf15(seqidno:11)(图1)。合成构建体，并克隆到prs5a表达载体主链中，以共转染和共纯化gdf15衍生的gfral复合物。
新构建体：
·人gfral(d2d3)-app
·人gfral(d2d3)-his
·人gfral(ecd)-his
·人gfral(ecd)-fc
·人cret(ecd)-fc
·人his-gdf15
细胞系：使人胚肾细胞悬浮细胞系hek293t或hek293f或cho细胞在freestyle293表达培养基(fs293)中在37℃下繁殖，以进行瞬时转染并产生重组gfral(d2d3)-app、gfral(d2d3)-his、gfral(ecd)-his、gfral(ecd)-fc、cret(ecd)-fc以及本披露的其他蛋白或蛋白复合物。
试剂：使用purelinkexpi无内毒素的giga质粒纯化试剂盒(马萨诸塞州沃尔瑟姆市的赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific,walthamma))产生无内毒素的质粒dna，以用于转染和蛋白产生。施用聚乙烯亚胺溶液(pei)进行转染。使用ni-nta超流动小柱(马里兰州日耳曼镇凯杰公司(qiagen,germantownmd))和hitrap蛋白a柱(马萨诸塞州马尔堡市的ge医疗生命科学公司(gehealthcarelifesciences,marlboroughma))进行蛋白纯化。
重组蛋白的表达和纯化：为了产生纯化的重组gfral和cret蛋白，以及这些蛋白与his-gdf15的共表达复合物，将表达载体在fs293培养基中稀释，并与pei溶液按1:2.5(w/w)的比率混合，以形成dna/pei复合物，随后相应地添加至hek293t或hek293f细胞培养物或cho细胞培养物中。例如，将1mg表达质粒dna与2.5mgpei复合以瞬时转染1升hek293细胞培养物。转染后4天，从转染的细胞培养物收获上清液，过滤，并运行通过适当的亲和柱以纯化重组蛋白。通过凯杰公司ni-nta超流动小柱纯化his标记的蛋白，通过与抗appmab(单克隆抗体)缀合的sepharose树脂纯化app标记的蛋白，并通过蛋白a柱纯化fc融合体。用350mm咪唑洗脱与镍柱结合的蛋白。对于单独的gfral(ecd)-his构建体，在实验中使用前，通过尺寸排阻色谱通过superdex200柱(马萨诸塞州马尔堡市的ge医疗生命科学公司)进行单体物质的额外纯化。用补充有150mmnacl的50mm柠檬酸溶液(ph3.0)洗脱与抗appmab缀合的sepharose树脂或蛋白a柱结合的蛋白，随后用1mtrishcl中和。随后，将洗脱的蛋白级分进行缓冲液交换，并在杜氏磷酸盐缓冲盐水(dpbs)中浓缩。如us2017/204149中所述，使用大肠杆菌产生纯化的重组his-gdf15，并进行生物素化或原样用于与重组gfralecd蛋白进行体外重构，以用于基于板的cret结合和细胞测定。
实例2：可溶性gfral细胞外结构域蛋白与gdf15的共表达和共纯化
方法：为了产生gfral(d2d3)-app/his-gdf15和gfral(ecd)-fc/his-gdf15复合物，将his-gdf15载体dna与等量的hgfral(d2d3)-app载体或hgfral(ecd)-fc载体混合，以用于使用实例1中所述的pei方法瞬时转染3升hek293t或hek293f培养物。转染后4天，分别通过ni-nta小柱和蛋白a柱纯化gfral(d2d3)-app/his-gdf15复合物(图2a-2b和图3)和gfral(ecd)-fc/his-gdf15复合物(图4a-4b)。将洗脱的蛋白级分进行缓冲液交换，在dpbs中浓缩，并通过sds-page电泳、尺寸排阻和质谱分析：
从3000ml培养基纯化gfral(d2d3)-app/his-gdf15复合物(洗脱曲线未显示)。图2a显示了示例性的his-gdf15和gfral(d2d3)-app构建体。图2b显示了通过sds-page分析进行的级分筛选。图2b中显示的单个蛋白带含有gfral(d2d3)-app单体(24.6kd)和his-gdf15二聚体(二聚体为26.6kd，单体为13.3kd)两者。
共表达的gfral(d2d3)-app/his-gdf15复合物如下分析：从若干个级分浓缩的复合物含有共表达的gfral(d2d3)-app和his-gdf15，如通过sds-page在还原条件下所揭示(图3)。所述复合物含有24.6kdgfral(d2d3)-app和13.3kdhis-gdf15。通过尺寸排阻进一步分析了共表达的gfral(d2d3)-app/his-gdf15复合物(20μg)(数据未显示)。峰指示存在gfral(d2d3)-app/his-gdf15复合物。还在还原条件下，分析了二元复合物中gfral(d2d3)-app和his-gdf15的分子量。24355道尔顿(dalton)峰是gfral(d2d3)-app多肽，在纯化过程中，从其n端剪切了甘氨酸，并且从c端剪切了天冬氨酸和丝氨酸。
从蛋白a柱亲和纯化gfral(ecd)-fc/his-gdf15复合物。图4a显示了在非还原条件下通过sds-page分析的含有his-gdf15/gfral(ecd)-fc复合物的级分。图4b显示从图4a中的级分浓缩的复合物含有his-gdf15和gfral(ecd)-fc，如通过sds-page在还原条件下所揭示。
纯化产生了1.6mggfral(d2d3)-app/his-gdf15和14mggfral(ecd)-fc/his-gdf15复合物。将这些复合物进一步用于表达cret的细胞活化测定中(图7和图8)。
实例3：gdf15与可溶性重组gfral变体的复合物与ret-fc蛋白包被的板结合
将生物素化的重组his-gdf15(生物素)与纯化的全长gfral(d2d3)-app、gfral(ecd)-his或gfral(ecd)-fc多肽(如实例1中所述制备)混合以形成二元分子复合物。然后将复合物稀释并与包被有重组cret(ecd)-fc的板一起孵育。
方法：为了在体外产生可溶性gdf15/gfral复合物，将实例1中纯化的重组gfral(d2d3)-app、gfral(ecd)-his和gfral(ecd)-fc蛋白与等摩尔量的生物素化的his-gdf15(1250pm)新鲜混合在补充有50μmcacl2的dpbs中。将混合物在室温下孵育60min以允许复合物形成。制成的复合物在4℃下稳定，并且无需进一步纯化即可直接用于针对包被在塑料板上的cret(ecd)-fc的体外结合测定。以相同的方式制备了三种不同的gdf15/gfralecd复合物，其包括his-gdf15(生物素)/gfral(d2d3)-app、his-gdf15(生物素)/gfral(ecd)-his和his-gdf15(生物素)/gfral(ecd)-fc。以与野生型his-gdf15相同的方式制备纯化的重组his-gdf15(l294r)，一种非功能性突变体，其中位置位294处的亮氨酸残基被精氨酸置换(参见us2017/204149)。将his-gdf15(l294r)与gfral(ecd)-his混合，以产生gdf15/gfral/cret相互作用的阴性对照。
为了确定与野生型gdf15复合的可溶性gfral细胞外结构域是否可以结合固定的cret，将重组人cret(ecd)-fc包被到meso-scalediscovery(msd)标准结合板(每毫升1μg蛋白)上的dpbs中在4℃下过夜。洗涤并封闭后，将板与2x连续稀释的不同gdf15/gfral复合物和对照一起孵育60min，然后与链霉亲和素磺化标签一起孵育(图5)。
试剂：
·用于洗涤包被板的缓冲液：含有500μmcacl2的dpbs
·包被缓冲液：含有250μmcacl2的dpbs
·封闭缓冲液：dpbs，5％bsa，含有250μmcacl2
·稀释缓冲液：补充有2％bsa、250μmcacl2的1xtbst(25mmtris，150mmnacl，0.05％tween20)
·洗涤溶液：补充有500μmcacl2的1xtbst
结果：如用链霉亲和素所检测，用纯化的组分新鲜制备的所有gfral/gdf15复合物均能够与板上包被的cret(ecd)-fc结合。与全长gfral衍生的对应物(gfral(ecd)-his和gfral(ecd)-fc)相比，gfral(d2d3)-app复合物表现出略强的gdf15结合活性(图5)。
实例4：单独的可溶性gfral(ecd)-his以及与突变gdf15(l294r)的混合物不与固定的cret(ecd)-fc蛋白结合
方法：如实例3所述制备纯化的生物素化的his-gdf15和gfral(ecd)-his或his-gdf15(l294r)和gfral(ecd)-his的混合物。还包括单个蛋白his-gdf15(l294r)和gfral(ecd)-his作为对照。使用生物素化的小鼠抗6xhis标签单克隆抗体，随后使用链霉亲和素磺化标签以及另外地实例3中所述的方法检测蛋白与包被有cret(ecd)-fc的板的结合。
结果：his-gdf15(生物素)/gfral(ecd)-his复合物表现出与cret(ecd)-fc强结合。相比之下，his-gdf15(l294r)/gfral(ecd)-his混合物、单独的his-gdf15(l294r)突变体和单独的gfral(ecd)-his均未显示与cret(ecd)-fc的显著结合(图6)。
实例5：可溶性gfral(d2d3)-app与his-gdf15的组合诱导sh-sy5y细胞中的perk和pakt
方法：如实例2中所述产生共表达和共纯化的his-gdf15/gfral(d2d3)-app和his-gdf15/gfral(ecd)-fc复合物。重构的可溶性his-gdf15/gfral(d2d3)-app复合物从分别通过将每种组分在培养基中预混合，并在室温下孵育60min纯化的组分制备。然后将蛋白复合物直接用于刺激sh-sy5y细胞，随后制备细胞裂解液，以通过免疫印迹测定确定磷酸化的erk和akt蛋白的水平。将共表达的共纯化的复合物、预混合的复合物和单个蛋白在培养基中稀释至指定浓度，然后在检测之前用于刺激sh-sy5y细胞15min。将通过gfrα1和cret发出信号的重组gdnf蛋白(新泽西州洛基山市的派普泰克公司(peprotech,rockyhillnj))用作sh-sy5y细胞活化的阳性对照。通过免疫印迹测定用针对磷酸化的erk和磷酸化的akt的抗体检测到了his-gdf15/gfral(d2d3)-app复合物对sh-sy5y细胞的活化。
细胞培养及处理方法：将sh-sy5y细胞(美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection；atcc)crl-2266)以每孔400,000个细胞接种在12孔聚d-赖氨酸包被的板(康宁公司(corning)；354470)中的dmem/f12汉姆氏培养基(dmem/f12ham'smedia，生命技术公司(lifetechnologies)；11320-033)中，所述dmem/f12汉姆氏培养基含有10％热灭活的fbs(hyclone；sh30071.03)和1％青霉素-链霉素(生命技术公司(lifetechnologies)；15140-122)。48小时后，将培养基更换为如上所述并且另外含有1.5μm视黄酸的新鲜培养基。24小时后，用无血清dmem/f12替换培养基，维持两小时。然后将细胞用蛋白或对照处理15min，用温dpbs洗涤，并在液氮中速冻。
western印迹方法：在含有蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物(皮尔斯公司(pierce)；78441)的ripa缓冲液(生命技术公司；89900)中裂解细胞。使裂解液变性并还原，并在150v下在nupage4％-12％bis-tris凝胶(生命技术公司；np0336box)中运行两小时。在25v下使用英杰公司(invitrogen)iblot2仪器6min将蛋白转移到硝酸纤维素膜(生命技术公司；ib23001)上。然后将膜在室温下在含有0.1％tween-20(tbst)的tris缓冲盐水中的5％干奶粉中封闭一小时，随后在4℃下在含有5％bsa(西格玛公司(sigma)；a8022)的tbst中的一级抗体中孵育过夜。将膜在室温下在tbst中洗涤3次，每次10min，然后在室温下在含有5％bsa的tbst中在二级抗体中孵育一小时。然后将膜在室温下在tbst中洗涤三次，每次20min。然后使用化学发光检测试剂(ge医疗公司(gehealthcare)；rpn2235；或珀金埃尔默公司(perkinelmer)；nel103001ea)对western印迹进行可视化。
抗体：
·磷酸基-akt(ser473)(细胞信号传导公司(cellsignaling)；4060)-1:2000稀释
·磷酸基-p44/42mapk(erk1/2)(thr202/tyr204)(细胞信号传导公司；4370)-1:2000稀释
·β-肌动蛋白-hrp(艾博抗公司(abcam)；ab49900)-1:10,000稀释
·hrp连接的抗兔igg(细胞信号传导公司；7074)-1:10,000稀释
结果：共表达和共纯化的his-gdf15/gfral(d2d3)-app复合物以及预混合的his-gdf15/gfral(d2d3)-app能够在sh-sy5y细胞中以浓度依赖性方式诱导erk和akt的磷酸化(图7，泳道3-5和12)。相比之下，共表达的his-gdf15/gfral(ecd)-fc复合物尽管与板上固定的重组cret(ecd)-fc结合(图5)，但并不刺激相同细胞中的erk或akt的磷酸化(图7，泳道6-8)。不希望受理论限制，在gfral(ecd)c端上fc的存在可能产生空间位阻，从而阻止gdf15/gfral(ecd)与细胞表面上ret的细胞外区结构域之间形成功能信号复合物，因此不会引起ret二聚(ret自身磷酸化和信号传导的先决条件)。另外，纯化的单个组分不会刺激sh-sy5y细胞中erk和akt的磷酸化(图7，泳道9-11道)。
实例6：可溶性gfral(d2d3)与gdf15的组合诱导mcf7细胞中的perk和pakt
方法：如实例2和5中所述制备共表达和重构(预混合)的his-gdf15/gfral(d2d3)-app复合物。将gdnf蛋白(其通过gfrα1和cret发出信号)用作mcf7细胞活化的阳性对照。
细胞培养及处理方法：将mcf7细胞(atcc；htb-22)以每孔100,000个细胞接种在12孔组织培养物处理的板中的emem培养基(atcc；30-2003)中，所述emem培养基含有10％热灭活的fbs(hyclone；sh30071.03)和1％青霉素-链霉素(生命技术公司；15140-122)。48小时后，将培养基更换为无血清emem，维持24小时。然后将细胞用蛋白或对照处理15min，用温dpbs洗涤，并在液氮中速冻。
western印迹方法：如实例5所述进行western印迹。
结果：与sh-sy5y细胞的结果(图7，泳道3-5)相比，共表达的his-gdf15/gfral(d2d3)-app复合物似乎不诱导mcf7细胞中erk和akt的磷酸化(图8，泳道3-5)。然而，由单个组分重构(预混合)的his-gdf15/gfral(d2d3)-app能够诱导erk和akt的磷酸化(图8，泳道12)。与对于sh-sy5y细胞观察到的结果相似，共表达的his-gdf15/gfral(ecd)-fc复合物不诱导mcf7细胞中erk和akt的磷酸化(图8，泳道6-8)。纯化的单个组分也不会刺激mcf7细胞中erk和akt的磷酸化(图8，泳道9-11)。
实例7：sh-sy5y和mcf7细胞中erk和akt磷酸化的诱导依赖于gdf15/gfral(d2d3)复合物的剂量
方法：在实例5和6中，重构(预混合)的his-gdf15/gfral(d2d3)-app复合物能够刺激mcf7和sh-sy5y细胞中的erk和akt磷酸化。为了确定erk和akt的磷酸化是否依赖于重构的his-gdf15/gfral(d2d3)-app复合物的浓度，将稀释的重组his-gdf15(28nm、83nm和250nm)与等量gfral(d2d3)-app在培养基中混合。将混合物在室温下孵育60min以允许复合物形成。然后将蛋白复合物直接用于刺激mcf7和sh-sy5y细胞15min，随后制备细胞裂解液，以如实例5通过免疫印迹测定确定磷酸化的erk和akt水平。将gdnf蛋白用作sh-sy5y细胞和mcf7细胞活化的阳性对照。
细胞培养及处理方法：如实例5所述培养和处理sh-sy5y细胞。如实例6所述培养和处理mcf7细胞。
western印迹方法：如实例5所述进行western印迹。
结果：重构的his-gdf15/gfral(d2d3)-app复合物对mcf7和sh-sy5y细胞中erk和akt磷酸化的诱导似乎依赖于复合物的浓度(图9)。刺激的sh-sy5y细胞显示出磷酸化erk和akt总水平比刺激的mcf7细胞高。
实例8：无需长时间预孵育his-gdf15和gfral(d2d3)-app即可重构可以活化mcf7和sh-sy5y细胞的复合物
部分进行了以下实验来确定使用重构的his-gdf15/gfral(d2d3)-app复合物诱导mcf7和sh-sy5y细胞中的erk和akt磷酸化所要的刺激时间。还进行了实验来评定长时间共孵育his-gdf15和gfral(d2d3)-app(添加mcf7和sh-sy5y细胞之前)是否为诱导erk和akt磷酸化所必需。
方法：如下制备重构的his-gdf15/gfral(d2d3)-app复合物。形式(a)：将30nm(对于sh-sy5y细胞刺激)或100nm(对于mcf7细胞刺激)his-gdf15与等浓度的gfral(d2d3)-app在培养基中混合，并在室温下孵育60min以使得可在添加到mcf7和sh-sy5y细胞培养物中之前形成复合物。形式(b)：将相同浓度的his-gdf15与等浓度的gfral(d2d3)-app在培养基中混合，然后立即添加到mcf7和sh-sy5y细胞培养物中。将形式(a)的结果与形式(b)并行比较。将3.3nmgdnf蛋白用作sh-sy5y细胞和mcf7细胞活化的阳性对照。
细胞培养及处理方法：如实例5所述培养和处理sh-sy5y细胞。如实例6所述培养和处理mcf7细胞。
western印迹方法：如实例5所述进行western印迹。
结果：当用100nm复合物处理mcf7细胞5、10和15min(图10a，泳道3、5和7)时，15min时间点(泳道7)产生了最高水平的磷酸化erk和akt。对于用30nm复合物处理在相同时间段的sh-sy5y细胞也是如此(图10b，泳道3、5和7)。在无预孵育时间(即，在混合后立即添加到细胞中)的情况下用重构(预混合)的his-gdf15/gfral(d2d3)-app刺激mcf7和sh-sy5y细胞15min也产生了高水平的磷酸化erk和akt(图10a-10b，泳道9)。这些结果表明，his-gdf15和gfral(d2d3)-app可以彼此快速地相互作用，以形成能够刺激表达ret的细胞的复合物。对于his-gdf15和gfral(d2d3)-app，无需长共孵育时间。
实例9：gfral(d2d3)-app与his-gdf15或脂肪酸-gdf15的组合强刺激mcf7细胞中的erk磷酸化
部分进行了以下实验来将免疫印迹基测定转化为高通量板基测定(alphalisa)，并且部分比较了his-gdf15/gfral(d2d3)-app和his-gdf15/gfral(ecd)-his复合物的效力。
方法：将三种形式的gdf15与gfral(d2d3)-app或gfral(ecd)-his组合(如实例8中所述)，以在添加mcf7细胞培养物以诱导erk磷酸化之前立即产生六种不同的gdf15/gfral复合物。gfd15样品包括含his-gdf15、脂肪酸-gdf15(如wo2015/200078中所述)和msa-gdf15(小鼠血清白蛋白-gdf15融合体，如wo2015/198199和wo2017/109706中所述)的dpbs，ph7.4。将gdnf蛋白用作mcf7细胞活化的阳性对照。
细胞培养及处理方法：将mcf7细胞以每孔5,000个细胞接种在384孔聚d-赖氨酸包被的板中的emem培养基(atcc；30-2003)中，所述emem培养基含有10％热灭活的fbs(hyclone；sh30071.03)和1％青霉素-链霉素(生命技术公司；15140-122)。48小时后，将培养基更换为无血清emem，维持24小时。然后用蛋白或对照处理细胞15min。然后将细胞在冰上放置5min，并将裂解缓冲液(来自试剂盒，珀金埃尔默公司(perkinelmer)；alsu-perk-a10k)添加到每个孔中。然后将细胞在室温下，以350rpm振荡10min。将裂解液储存在-80℃下直到进行alphalisa。
alphalisa方法：用alphalisasurefireultra试剂盒(珀金埃尔默公司，alsu-perk-a10k)检测磷酸基-erk水平，并按照制造商所述进行测定。简言之，将5μl稀释的受体珠粒添加到384孔optiplate(珀金埃尔默公司，6007290)中的每个孔中；然后添加10μl裂解液，随后添加5μl稀释的供体珠粒；然后将板以1000rpm离心10秒，在室温下孵育2小时，然后使用标准alphascreen设定在envision仪器上读数。
结果：如通过alphalisa所测量，his-gdf15与gfral(d2d3)-app的复合物以剂量依赖方式(28nm至250nm)诱导mcf7细胞中的erk磷酸化(图11a-11b)。250nm浓度的脂肪酸-gdf15与gfral(d2d3)-app的复合物诱导类似水平的erk磷酸化。相同浓度的msa-gdf15与gfral(d2d3)-app的复合物诱导的erk磷酸化程度相对较低，但其水平略高于仅含培养基的对照。此结果可能是由于在gdf15二聚体的n端永久存在两个大的msa多肽，这可能会产生阻止gdf15/gfral复合物与细胞表面ret适当相互作用的空间位阻。
与gfral(d2d3)-app蛋白相比，全长gfral(ecd)-his蛋白(在与250nm浓度的his-gdf15或脂肪酸-gdf15复合时)显示出高于培养基对照水平的低erk磷酸化诱导。数据显示为绝对磷酸基-erkalphalisa测定信号单位(图11a)以及磷酸化的erk信号相对于培养基对照的倍数增加(图11b)。
实例10：gfral(d2d3)-app与his-gdf15或脂肪酸-gdf15的组合强刺激sh-sy5y细胞中的erk磷酸化
方法：如实例9所述进行以下实验，但测试sh-sy5y细胞培养物。
细胞培养及处理方法：将sh-sy5y细胞以每孔10,000个细胞接种在384孔聚d-赖氨酸包被的板中的dmem/f12汉姆氏培养基(生命技术公司；11320-033)中，所述dmem/f12汉姆氏培养基含有10％热灭活的fbs(hyclone；sh30071.03)和1％青霉素-链霉素(生命技术公司；15140-122)。48小时后，将培养基更换为如上所述并且另外含有1.5μm视黄酸的新鲜培养基。24小时后，用无血清dmem/f12替换培养基，维持两小时。然后用蛋白或对照处理细胞15min。然后将细胞在冰上放置5min，并将裂解缓冲液(来自试剂盒，珀金埃尔默公司；alsu-perk-a10k)添加到每个孔中。将细胞在室温下，以350rpm振荡10min。将裂解液储存在-80℃下直到进行alphalisa。
alphalisa方法：如实例9所述检测磷酸基-erk水平。
结果：如在mcf7细胞中，his-gdf15/gfral(d2d3)-app和脂肪酸-gdf15/gfral(d2d3)-app复合物在诱导sh-sy5y细胞中的erk磷酸化方面比其gfral(ecd)-his对应物更有效(图12a-12b)。但是，含有gfral(ecd)-his的复合物在sh-sy5y细胞中的活性似乎大于mcf7细胞中。
另外，如在mcf7细胞中，msa-gdf15与gfral蛋白的复合物在sh-sy5y细胞中几乎不诱导erk磷酸化。数据显示为绝对磷酸基-erkalphalisa测定信号单位(图12a)以及磷酸化的erk信号相对于培养基对照的倍数增加(图12b)。
实例11：mcf7细胞中的erk磷酸化依赖于gfral(d2d3)和脂肪酸-gdf15的剂量
方法：在这些实验中，将各种浓度的脂肪酸-gdf15与gfral(d2d3)-app组合，以比较各自在mcf7细胞中诱导erk磷酸化的相对能力。如实例9所述进行实验方法。
细胞培养及处理方法：如实例9所述培养和处理mcf7细胞。
alphalisa方法：如实例9所述检测磷酸基-erk水平。
结果：含有较高浓度的脂肪酸-gdf15和gfral(d2d3)-app两者的复合物产生高于培养基对照的较大erk磷酸化诱导(表3)。
两者存在达到最大perk信号的比率，并且将脂肪酸-gdf15的浓度增加到或超过gfral(d2d3)-app的浓度可能导致信号从峰值降低。此假设与三元复合物模型一致。当脂肪酸-gdf15浓度匹配或超过gfral(d2d3)的浓度时，脂肪酸-gdf15与单个gfral(d2d3)-app蛋白的复合物的形成可能会增加。预期此类复合物不会结合两个ret蛋白，相比之下，脂肪酸-gdf15与两个gfral(d2d3)-app蛋白的复合物能够结合两个ret蛋白，所述两个ret蛋白二聚并主动发出信号。因此，理想地，测定中gdf15构建体的浓度不超过gfral(d2d3)构建体的浓度，以使测定能准确地比较不同gdf15基物质的效力。
脂肪酸-gdf15与gfral(d2d3)-app的组合对mcf7细胞中erk磷酸化的剂量依赖性结果可重现(表4)。
表3.用gfral(d2d3)-app和脂肪酸-gdf15处理后，mcf7细胞中的erk磷酸化*
*图表中的值指示perk倍数改变。
表4.用gfral(d2d3)-app和脂肪酸-gdf15处理后，mcf7细胞中的erk磷酸化*
*图表中的值指示perk倍数改变。
编号的实施例
实施例1.一种检测gdf15肽的活性的方法，所述方法包括：
(a)提供表达细胞表面受体激酶的细胞；
(b)使所述细胞与所述gdf15肽和可溶性gfral接触；以及
(c)检测所述经接触细胞中的生物学反应，
其中所述可溶性gfral包含有包含结构域d2和d3的gfral细胞外结构域。
实施例2.如实施例1所述的方法，其中所述可溶性gfral包含缺乏结构域d1的gfral细胞外结构域。
实施例3.如实施例1或2所述的方法，其中所述可溶性gfral进一步包含信号肽。
实施例4.如实施例1至3中任一项所述的方法，其中所述可溶性gfral包含seqidno:1的氨基酸序列或其功能变体。
实施例5.如实施例1至3中任一项所述的方法，其中所述可溶性gfral或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。
实施例6.如实施例1至3中任一项所述的方法，其中所述可溶性gfral或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
实施例7.如实施例1至3中任一项所述的方法，其中所述可溶性gfral包含seqidno:2的氨基酸序列或其功能变体。
实施例8.如实施例1至7中任一项所述的方法，其中所述可溶性gfral进一步包含(例如，融合至)亲和标签。
实施例9.如实施例8所述的方法，其中所述亲和标签包含淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、flag标签或myc标签。
实施例10.如实施例1至9中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽包含seqidno:13的氨基酸序列或其功能变体。
实施例11.如实施例1至9中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。
实施例12.如实施例1至9中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
实施例13.如实施例1至12中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽包含亲和标签、融合、缀合、peg化和/或糖基化。
实施例14.如实施例1至13中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽用淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、flag标签或myc标签标记。
实施例15.如实施例1至14中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽与人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、免疫球蛋白恒定区或α-1-抗胰蛋白酶融合。
实施例16.如实施例1至15中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽与脂肪酸缀合。
实施例17.如实施例1至16中任一项所述的方法，其中使所述细胞同时与所述gdf15肽和所述可溶性gfral接触。
实施例18.如实施例1至16中任一项所述的方法，其中使所述细胞依次与所述gdf15肽和所述可溶性gfral接触。
实施例19.如实施例17所述的方法，其中所述gdf15肽和所述可溶性gfral处于相同组合物中。
实施例20.如实施例19所述的方法，其中所述gdf15肽和所述可溶性gfral处于混合物中。
实施例21.如实施例19所述的方法，其中所述gdf15肽和所述可溶性gfral处于二元复合物中。
实施例22.如实施例1至21中任一项所述的方法，其中所述细胞表面受体激酶是内源细胞表面受体激酶。
实施例23.如实施例1至21中任一项所述的方法，其中所述细胞表面受体激酶是外源细胞表面受体激酶。
实施例24.如实施例1至23中任一项所述的方法，其中所述细胞表面受体激酶是ret受体酪氨酸激酶。
实施例25.如实施例1至24中任一项所述的方法，其中所述细胞不表达内源gfral。
实施例26.如实施例1至25中任一项所述的方法，其中所述细胞不表达全长gfral。
实施例27.如实施例1至26中任一项所述的方法，其中所述细胞不表达内源gdf15。
实施例28.如实施例1至27中任一项所述的方法，其中所述细胞是包含无效gdf15基因的gdf15敲除(ko)细胞。
实施例29.如实施例1至28中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
实施例30.如实施例1至29中任一项所述的方法，其中所述细胞是人细胞。
实施例31.如实施例1至30中任一项所述的方法，其中所述细胞是mcf7细胞。
实施例32.如实施例1至30中任一项所述的方法，其中所述细胞是sh-sy5y细胞。
实施例33.如实施例1至30中任一项所述的方法，其中所述细胞是hek293a-gdf15ko细胞。
实施例34.如实施例1至33中任一项所述的方法，其中当所述gdf15肽、所述可溶性gfral和所述细胞表面受体激酶形成三元复合物时诱导所述生物学反应。
实施例35.如实施例1至34中任一项所述的方法，其中在所述可溶性gfral不存在下与所述gdf15肽接触的细胞中不诱导所述生物学反应。
实施例36.如实施例1至35中任一项所述的方法，其中所述生物学反应是所述细胞中蛋白的表达或活性与不与所述gdf15肽和所述可溶性gfral接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。
实施例37.如实施例1至36中任一项所述的方法，其中所述生物学反应是ret-erk、ret-akt、蛋白激酶c、jak/stat、jnk、p38和rac1路径中的一种或多种中细胞内蛋白的表达或活性增加或减少。
实施例38.如实施例36所述的方法，其中所述蛋白是所述ret-erk路径中选自以下的细胞内蛋白：erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2。
实施例39.如实施例36所述的方法，其中所述蛋白是所述ret-akt路径中选自以下的细胞内蛋白：akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor。
实施例40.如实施例36或实施例38所述的方法，其中所述细胞表面受体激酶是ret受体酪氨酸激酶，并且所述蛋白是所述ret-erk路径中的细胞内蛋白。
实施例41.如实施例40所述的方法，其中所述细胞内蛋白选自erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2或其任何下游靶标中的一种或多种。
实施例42.如实施例40或实施例41所述的方法，其中所述细胞内蛋白选自erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2中的一种或多种。
实施例43.如实施例41或实施例42所述的方法，其中所述erk是erk1或erk2。
实施例44.如实施例36或实施例39所述的方法，其中所述细胞表面受体激酶是ret受体酪氨酸激酶，并且所述蛋白是所述ret-akt路径中的细胞内蛋白。
实施例45.如实施例44所述的方法，其中所述细胞内蛋白选自akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor或其任何下游靶标中的一种或多种。
实施例46.如实施例44或实施例45所述的方法，其中所述细胞内蛋白选自akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor中的一种或多种。
实施例47.如实施例45或实施例46所述的方法，其中所述akt是akt1、akt2或akt3。
实施例48.如实施例1至35中任一项所述的方法，其中所述生物学反应是所述细胞中蛋白激酶的磷酸化与不与所述gdf15肽和所述可溶性gfral接触的对照细胞中相同蛋白激酶的磷酸化相比增加或减少。
实施例49.如实施例48所述的方法，其中所述蛋白激酶是所述细胞表面受体激酶。
实施例50.如实施例48或实施例49所述的方法，其中所述蛋白激酶和/或细胞表面受体激酶是ret受体酪氨酸激酶。
实施例51.如实施例48所述的方法，其中所述蛋白激酶是细胞内蛋白激酶，其中所述细胞内蛋白激酶被所述细胞表面受体激酶直接或间接磷酸化。
实施例52.如实施例48或实施例51所述的方法，其中所述蛋白激酶是所述ret-erk路径中的细胞内蛋白激酶。
实施例53.如实施例52所述的方法，其中所述细胞内蛋白激酶选自erk、jak1、jak2、raf、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2或其任何下游靶标中的一种或多种。
实施例54.如实施例52或实施例53所述的方法，其中所述细胞内蛋白激酶选自erk、jak1、jak2、raf、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2中的一种或多种。
实施例55.如实施例52至54中任一项所述的方法，其中所述细胞内蛋白激酶是erk。
实施例56.如实施例53至55中任一项所述的方法，其中所述erk是erk1或erk2。
实施例57.如实施例48或实施例51所述的方法，其中所述蛋白激酶是所述ret-akt路径中的细胞内蛋白激酶。
实施例58.如实施例57所述的方法，其中所述细胞内蛋白激酶选自akt、src、jak1、jak2、pi3k、pdk1、mlk3、ask1、gsk3α、gsk3β和mtor或其任何下游靶标中的一种或多种。
实施例59.如实施例57或实施例58所述的方法，其中所述细胞内蛋白激酶选自akt、src、jak1、jak2、pi3k、pdk1、mlk3、ask1、gsk3α、gsk3β和mtor中的一种或多种。
实施例60.如实施例57至59中任一项所述的方法，其中所述细胞内蛋白激酶是akt。
实施例61.如实施例58至60中任一项所述的方法，其中所述akt是akt1、akt2或akt3。
实施例62.一种检测gdf15肽的活性的方法，所述方法包括：
(a)提供表达gfral细胞外结构域和细胞表面受体激酶的细胞；
(b)使所述细胞与所述gdf15肽接触；以及
(c)检测所述经接触细胞中的生物学反应，
其中所述gfral细胞外结构域包含结构域d2和d3。
实施例63.如实施例62所述的方法，其中所述gfral细胞外结构域缺乏结构域d1。
实施例64.如实施例62或实施例63所述的方法，其中所述gfral细胞外结构域是可溶性gfral细胞外结构域。
实施例65.如实施例62或实施例63所述的方法，其中所述gfral细胞外结构域通过系链与细胞表面附接。
实施例66.如实施例65所述的方法，其中所述系链是gfral跨膜结构域或其功能片段。
实施例67.如实施例65或实施例66所述的方法，其中所述gfral细胞外结构域或系链包含seqidno:18的氨基酸序列或其功能变体。
实施例68.如实施例65所述的方法，其中所述系链是与所述gfral细胞外结构域融合的异源跨膜结构域。
实施例69.如实施例65所述的方法，其中所述系链是糖磷脂酰肌醇(gpi)。
实施例70.如实施例65或实施例69所述的方法，其中所述gfral细胞外结构域或系链包含seqidno:19的氨基酸序列或其功能变体、seqidno:20的氨基酸序列或其功能变体或者seqidno:21的氨基酸序列或其功能变体。
实施例71.如实施例65所述的方法，其中所述系链是膜插入序列。
实施例72.如实施例65或实施例71所述的方法，其中所述gfral细胞外结构域或系链包含seqidno:22的氨基酸序列或其功能变体，或者seqidno:23的氨基酸序列或其功能变体。
实施例73.如实施例65所述的方法，其中所述系链是膜插入脂肪酸。
实施例74.如实施例62至73中任一项所述的方法，其中所述gfral细胞外结构域进一步包含信号肽。
实施例75.如实施例62至74中任一项所述的方法，其中所述gfral细胞外结构域包含seqidno:1的氨基酸序列或其功能变体。
实施例76.如实施例62至74中任一项所述的方法，其中所述gfral细胞外结构域或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。
实施例77.如实施例62至74中任一项所述的方法，其中所述gfral细胞外结构域或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
实施例78.如实施例62至74中任一项所述的方法，其中所述gfral细胞外结构域包含seqidno:2的氨基酸序列或其功能变体。
实施例79.如实施例62至78中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽包含seqidno:13的氨基酸序列或其功能变体。
实施例80.如实施例62至78中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。
实施例81.如实施例62至78中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
实施例82.如实施例62至81中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽包含亲和标签、融合、缀合、peg化和/或糖基化。
实施例83.如实施例62至82中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽用淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、flag标签或myc标签标记。
实施例84.如实施例62至83中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽与人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、免疫球蛋白恒定区或α-1-抗胰蛋白酶融合。
实施例85.如实施例62至84中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽与脂肪酸缀合。
实施例86.如实施例62至85中任一项所述的方法，其中所述细胞表面受体激酶是内源细胞表面受体激酶。
实施例87.如实施例62至85中任一项所述的方法，其中所述细胞表面受体激酶是外源细胞表面受体激酶。
实施例88.如实施例62至87中任一项所述的方法，其中所述细胞表面受体激酶是ret受体酪氨酸激酶。
实施例89.如实施例62至88中任一项所述的方法，其中所述细胞不表达内源gfral。
实施例90.如实施例62至89中任一项所述的方法，其中所述细胞不表达全长gfral。
实施例91.如实施例62至90中任一项所述的方法，其中所述细胞不表达内源gdf15。
实施例92.如实施例62至91中任一项所述的方法，其中所述细胞是包含无效gdf15基因的gdf15ko细胞。
实施例93.如实施例62至92中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
实施例94.如实施例62至93中任一项所述的方法，其中所述细胞是人细胞。
实施例95.如实施例62至94中任一项所述的方法，其中所述细胞是mcf7细胞。
实施例96.如实施例62至94中任一项所述的方法，其中所述细胞是sh-sy5y细胞。
实施例97.如实施例62至94中任一项所述的方法，其中所述细胞是hek293a-gdf15ko细胞。
实施例98.如实施例62至97中任一项所述的方法，其中当所述gdf15肽、所述gfral细胞外结构域和所述细胞表面受体激酶形成三元复合物时诱导所述生物学反应。
实施例99.如实施例62至98中任一项所述的方法，其中所述生物学反应是所述细胞中蛋白的表达或活性与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。
实施例100.如实施例62至99中任一项所述的方法，其中所述生物学反应是ret-erk、ret-akt、蛋白激酶c、jak/stat、jnk、p38和rac1路径中的一种或多种中细胞内蛋白的表达或活性增加或减少。
实施例101.如实施例99所述的方法，其中所述蛋白是所述ret-erk路径中选自以下的细胞内蛋白：erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2。
实施例102.如实施例99所述的方法，其中所述蛋白是所述ret-akt路径中选自以下的细胞内蛋白：akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor。
实施例103.如实施例99或实施例101所述的方法，其中所述细胞表面受体激酶是ret受体酪氨酸激酶，并且所述蛋白是所述ret-erk路径中的细胞内蛋白。
实施例104.如实施例103所述的方法，其中所述细胞内蛋白选自erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2或其任何下游靶标中的一种或多种。
实施例105.如实施例103或实施例104所述的方法，其中所述细胞内蛋白选自erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2中的一种或多种。
实施例106.如实施例104或实施例105所述的方法，其中所述erk是erk1或erk2。
实施例107.如实施例99或实施例102所述的方法，其中所述细胞表面受体激酶是ret受体酪氨酸激酶，并且所述蛋白是所述ret-akt路径中的细胞内蛋白。
实施例108.如实施例107所述的方法，其中所述细胞内蛋白选自akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor或其任何下游靶标中的一种或多种。
实施例109.如实施例107或实施例108所述的方法，其中所述细胞内蛋白选自akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor中的一种或多种。
实施例110.如实施例108或实施例109所述的方法，其中所述akt是akt1、akt2或akt3。
实施例111.如实施例62至98中任一项所述的方法，其中所述生物学反应是所述细胞中蛋白激酶的磷酸化与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白激酶的磷酸化相比增加或减少。
实施例112.如实施例111所述的方法，其中所述蛋白激酶是所述细胞表面受体激酶。
实施例113.如实施例111或实施例112所述的方法，其中所述蛋白激酶和/或细胞表面受体激酶是ret受体酪氨酸激酶。
实施例114.如实施例111所述的方法，其中所述蛋白激酶是细胞内蛋白激酶，其中所述细胞内蛋白激酶被所述细胞表面受体激酶直接或间接磷酸化。
实施例115.如实施例111或实施例114所述的方法，其中所述蛋白激酶是所述ret-erk路径中的细胞内蛋白激酶。
实施例116.如实施例115所述的方法，其中所述细胞内蛋白激酶选自erk、jak1、jak2、raf、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2或其任何下游靶标中的一种或多种。
实施例117.如实施例115或实施例116所述的方法，其中所述细胞内蛋白激酶选自erk、jak1、jak2、raf、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2中的一种或多种。
实施例118.如实施例115至117中任一项所述的方法，其中所述细胞内蛋白激酶是erk。
实施例119.如实施例116至118中任一项所述的方法，其中所述erk是erk1或erk2。
实施例120.如实施例111或实施例114所述的方法，其中所述蛋白激酶是所述ret-akt路径中的细胞内蛋白激酶。
实施例121.如实施例120所述的方法，其中所述细胞内蛋白激酶选自akt、src、jak1、jak2、pi3k、pdk1、mlk3、ask1、gsk3α、gsk3β和mtor或其任何下游靶标中的一种或多种。
实施例122.如实施例120或实施例121所述的方法，其中所述细胞内蛋白激酶选自akt、src、jak1、jak2、pi3k、pdk1、mlk3、ask1、gsk3α、gsk3β和mtor中的一种或多种。
实施例123.如实施例120至122中任一项所述的方法，其中所述细胞内蛋白激酶是akt。
实施例124.如实施例121至123中任一项所述的方法，其中所述akt是akt1、akt2或akt3。
实施例125.一种用于检测gdf15肽的活性的分离和修饰的细胞，其中所述细胞表达包含结构域d2和d3的gfral细胞外结构域以及细胞表面受体激酶。
实施例126.如实施例125所述的方法，其中所述gfral细胞外结构域缺乏结构域d1。
实施例127.如实施例125或实施例126所述的细胞，其中所述gfral细胞外结构域是可溶性gfral细胞外结构域。
实施例128.如实施例125或实施例126所述的细胞，其中所述gfral细胞外结构域通过系链与细胞表面附接。
实施例129.如实施例128所述的细胞，其中所述系链是gfral跨膜结构域或其功能片段。
实施例130.如实施例128或实施例129所述的细胞，其中所述gfral细胞外结构域或系链包含seqidno:18的氨基酸序列或其功能变体。
实施例131.如实施例128所述的细胞，其中所述系链是与所述gfral细胞外结构域融合的异源跨膜结构域。
实施例132.如实施例128所述的细胞，其中所述系链是糖磷脂酰肌醇(gpi)。
实施例133.如实施例128或实施例132所述的细胞，其中所述gfral细胞外结构域或系链包含seqidno:19的氨基酸序列或其功能变体、seqidno:20的氨基酸序列或其功能变体或者seqidno:21的氨基酸序列或其功能变体。
实施例134.如实施例128所述的细胞，其中所述系链是膜插入序列。
实施例135.如实施例128或实施例134所述的细胞，其中所述gfral细胞外结构域或系链包含seqidno:22的氨基酸序列或其功能变体，或者seqidno:23的氨基酸序列或其功能变体。
实施例136.如实施例128所述的细胞，其中所述系链是膜插入脂肪酸。
实施例137.如实施例125至136中任一项所述的细胞，其中所述gfral细胞外结构域进一步包含信号肽。
实施例138.如实施例125至137中任一项所述的细胞，其中所述gfral细胞外结构域包含seqidno:1的氨基酸序列或其功能变体。
实施例139.如实施例125至137中任一项所述的细胞，其中所述gfral细胞外结构域或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。
实施例140.如实施例125至137中任一项所述的细胞，其中所述gfral细胞外结构域或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
实施例141.如实施例125至137中任一项所述的细胞，其中所述gfral细胞外结构域包含seqidno:2的氨基酸序列或其功能变体。
实施例142.如实施例125至141中任一项所述的细胞，其中所述gdf15肽包含seqidno:13的氨基酸序列或其功能变体。
实施例143.如实施例125至141中任一项所述的细胞，其中所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。
实施例144.如实施例125至141中任一项所述的细胞，其中所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
实施例145.如实施例125至144中任一项所述的细胞，其中所述gdf15肽包含亲和标签、融合、缀合、peg化和/或糖基化。
实施例146.如实施例125至145中任一项所述的细胞，其中所述gdf15肽用淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、flag标签或myc标签标记。
实施例147.如实施例125至146中任一项所述的细胞，其中所述gdf15肽与人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、免疫球蛋白恒定区或α-1-抗胰蛋白酶融合。
实施例148.如实施例125至147中任一项所述的细胞，其中所述gdf15肽与脂肪酸缀合。
实施例149.如实施例125至148中任一项所述的细胞，其中所述细胞表面受体激酶是内源细胞表面受体激酶。
实施例150.如实施例125至148中任一项所述的细胞，其中所述细胞表面受体激酶是外源细胞表面受体激酶。
实施例151.如实施例125至150中任一项所述的细胞，其中所述细胞表面受体激酶是ret受体酪氨酸激酶。
实施例152.如实施例125至151中任一项所述的细胞，其中所述细胞不表达内源gfral。
实施例153.如实施例125至152中任一项所述的细胞，其中所述细胞不表达全长gfral。
实施例154.如实施例125至153中任一项所述的细胞，其中所述细胞不表达内源gdf15。
实施例155.如实施例125至154中任一项所述的细胞，其中所述细胞是包含无效gdf15基因的gdf15ko细胞。
实施例156.如实施例125至155中任一项所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
实施例157.如实施例125至156中任一项所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。
实施例158.如实施例125至157中任一项所述的细胞，其中所述细胞是mcf7细胞。
实施例159.如实施例125至157中任一项所述的细胞，其中所述细胞是sh-sy5y细胞。
实施例160.如实施例125至157中任一项所述的细胞，其中所述细胞是hek293a-gdf15ko细胞。
实施例161.一种用于确定gdf15肽的活性的试剂盒，其中所述试剂盒包含如实施例125至160中任一项所述的细胞以用于与所述gdf15肽接触；以及检测所述经接触细胞中的生物学反应的构件。
实施例162.一种治疗肥胖或肥胖相关障碍的方法，所述方法包括向受试者施用gdf15肽，其中所述gdf15肽在与所述gdf15肽接触的细胞中诱导生物学反应，其中所述生物学反应通过或可以通过如实施例1至124中任一项所述方法检测。
实施例163.如实施例162所述的方法，其中所述gdf15肽包含seqidno:13的氨基酸序列或其功能变体。
实施例164.如实施例162所述的方法，其中所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。
实施例165.如实施例162所述的方法，其中所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
实施例166.如实施例162至165中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽包含亲和标签、融合、缀合、peg化和/或糖基化。
实施例167.如实施例162至166中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽用淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、flag标签或myc标签标记。
实施例168.如实施例162至167中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽与人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、免疫球蛋白恒定区或α-1-抗胰蛋白酶融合。
实施例169.如实施例162至168中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽与脂肪酸缀合。
实施例170.如实施例162至169中任一项所述的方法，其中所述生物学反应是信号转导反应。
实施例171.如实施例162至170中任一项所述的方法，其中所述生物学反应是所述细胞中蛋白的表达或活性与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。
实施例172.如实施例162至171中任一项所述的方法，其中所述生物学反应是ret-erk、ret-akt、蛋白激酶c、jak/stat、jnk、p38和rac1路径中的一种或多种中细胞内蛋白的表达或活性增加或减少。
实施例173.如实施例171所述的方法，其中所述蛋白是所述ret-erk路径中选自以下的细胞内蛋白：erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2。
实施例174.如实施例171所述的方法，其中所述蛋白是所述ret-akt路径中选自以下的细胞内蛋白：akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor。
实施例175.如实施例162至170中任一项所述的方法，其中所述生物学反应是所述细胞中蛋白激酶的磷酸化与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白激酶的磷酸化相比增加或减少。
实施例176.如实施例175所述的方法，其中所述蛋白激酶是细胞内蛋白激酶，其中所述细胞内蛋白激酶被所述细胞表面受体激酶直接或间接磷酸化。
实施例177.如实施例162至176中任一项所述的方法，其中所述受试者超重或肥胖。
实施例178.如实施例162至177中任一项所述的方法，其中所述受试者的身体质量指数在25与29.9之间。
实施例179.如实施例162至177中任一项所述的方法，其中所述受试者的身体质量指数为30或更高。
实施例180.如实施例162至179中任一项所述的方法，其中所述肥胖相关障碍是癌症、体重障碍或代谢疾病或障碍。
实施例181.如实施例162至180中任一项所述的方法，其中所述肥胖相关障碍是癌症、ii型糖尿病(t2dm)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、高甘油三酯血症或心血管疾病。
实施例182.gdf15肽在治疗受试者的肥胖或肥胖相关障碍中的用途，其中所述gdf15肽在与所述gdf15肽接触的细胞中诱导生物学反应，其中所述生物学反应通过或可以通过如实施例1至124中任一项所述方法检测。
实施例183.如实施例182所述的用途，其中所述gdf15肽包含seqidno:13的氨基酸序列或其功能变体。
实施例184.如实施例182所述的用途，其中所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。
实施例185.如实施例182所述的用途，其中所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
实施例186.如实施例182至185中任一项所述的用途，其中所述gdf15肽包含亲和标签、融合、缀合、peg化和/或糖基化。
实施例187.如实施例182至186中任一项所述的用途，其中所述gdf15肽用淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、flag标签或myc标签标记。
实施例188.如实施例182至187中任一项所述的用途，其中所述gdf15肽与人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、免疫球蛋白恒定区或α-1-抗胰蛋白酶融合。
实施例189.如实施例182至188中任一项所述的用途，其中所述gdf15肽与脂肪酸缀合。
实施例190.如实施例182至189中任一项所述的用途，其中所述生物学反应是信号转导反应。
实施例191.如实施例182至190中任一项所述的用途，其中所述生物学反应是所述细胞中蛋白的表达或活性与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。
实施例192.如实施例182至191中任一项所述的用途，其中所述生物学反应是ret-erk、ret-akt、蛋白激酶c、jak/stat、jnk、p38和rac1路径中的一种或多种中细胞内蛋白的表达或活性增加或减少。
实施例193.如实施例191所述的用途，其中所述蛋白是所述ret-erk路径中选自以下的细胞内蛋白：erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2。
实施例194.如实施例191所述的用途，其中所述蛋白是所述ret-akt路径中选自以下的细胞内蛋白：akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor。
实施例195.如实施例182至190中任一项所述的用途，其中所述生物学反应是所述细胞中蛋白激酶的磷酸化与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白激酶的磷酸化相比增加或减少。
实施例196.如实施例195所述的用途，其中所述蛋白激酶是细胞内蛋白激酶，其中所述细胞内蛋白激酶被所述细胞表面受体激酶直接或间接磷酸化。
实施例197.如实施例182至196中任一项所述的用途，其中所述受试者超重或肥胖。
实施例198.如实施例182至197中任一项所述的用途，其中所述受试者的身体质量指数在25与29.9之间。
实施例199.如实施例182至197中任一项所述的用途，其中所述受试者的身体质量指数为30或更高。
实施例200.如实施例182至199中任一项所述的用途，其中所述肥胖相关障碍是癌症、体重障碍或代谢疾病或障碍。
实施例201.如实施例182至200中任一项所述的用途，其中所述肥胖相关障碍是癌症、ii型糖尿病(t2dm)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、高甘油三酯血症或心血管疾病。
实施例202.一种降低食欲和/或减轻体重的方法，所述方法包括向受试者施用gdf15肽，其中所述gdf15肽在与所述gdf15肽接触的细胞中诱导生物学反应，其中所述生物学反应通过或可以通过如实施例1至124中任一项所述方法检测。
实施例203.如实施例202所述的方法，其中所述gdf15肽包含seqidno:13的氨基酸序列或其功能变体。
实施例204.如实施例202所述的方法，其中所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。
实施例205.如实施例202所述的方法，其中所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
实施例206.如实施例202至205中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽包含亲和标签、融合、缀合、peg化和/或糖基化。
实施例207.如实施例202至206中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽用淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、flag标签或myc标签标记。
实施例208.如实施例202至207中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽与人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、免疫球蛋白恒定区或α-1-抗胰蛋白酶融合。
实施例209.如实施例202至208中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽与脂肪酸缀合。
实施例210.如实施例202至209中任一项所述的方法，其中所述生物学反应是信号转导反应。
实施例211.如实施例202至210中任一项所述的方法，其中所述生物学反应是所述细胞中蛋白的表达或活性与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。
实施例212.如实施例202至211中任一项所述的方法，其中所述生物学反应是ret-erk、ret-akt、蛋白激酶c、jak/stat、jnk、p38和rac1路径中的一种或多种中细胞内蛋白的表达或活性增加或减少。
实施例213.如实施例211所述的方法，其中所述蛋白是所述ret-erk路径中选自以下的细胞内蛋白：erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2。
实施例214.如实施例211所述的方法，其中所述蛋白是所述ret-akt路径中选自以下的细胞内蛋白：akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor。
实施例215.如实施例202至210中任一项所述的方法，其中所述生物学反应是所述细胞中蛋白激酶的磷酸化与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白激酶的磷酸化相比增加或减少。
实施例216.如实施例215所述的方法，其中所述蛋白激酶是细胞内蛋白激酶，其中所述细胞内蛋白激酶被所述细胞表面受体激酶直接或间接磷酸化。
实施例217.如实施例202至216中任一项所述的方法，其中所述受试者超重或肥胖。
实施例218.如实施例202至217中任一项所述的方法，其中所述受试者的身体质量指数在25与29.9之间。
实施例219.如实施例202至217中任一项所述的方法，其中所述受试者的身体质量指数为30或更高。
实施例220.gdf15肽在降低受试者的食欲和/或减轻体重中的用途，其中所述gdf15肽在与所述gdf15肽接触的细胞中诱导生物学反应，其中所述生物学反应通过或可以通过如实施例1至124中任一项所述方法检测。
实施例221.如实施例220所述的用途，其中所述gdf15肽包含seqidno:13的氨基酸序列或其功能变体。
实施例222.如实施例220所述的用途，其中所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。
实施例223.如实施例220所述的用途，其中所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
实施例224.如实施例220至223中任一项所述的用途，其中所述gdf15肽包含亲和标签、融合、缀合、peg化和/或糖基化。
实施例225.如实施例220至224中任一项所述的用途，其中所述gdf15肽用淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、flag标签或myc标签标记。
实施例226.如实施例220至225中任一项所述的用途，其中所述gdf15肽与人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、免疫球蛋白恒定区或α-1-抗胰蛋白酶融合。
实施例227.如实施例220至226中任一项所述的用途，其中所述gdf15肽与脂肪酸缀合。
实施例228.如实施例220至227中任一项所述的用途，其中所述生物学反应是信号转导反应。
实施例229.如实施例220至228中任一项所述的用途，其中所述生物学反应是所述细胞中蛋白的表达或活性与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。
实施例230.如实施例220至229中任一项所述的用途，其中所述生物学反应是ret-erk、ret-akt、蛋白激酶c、jak/stat、jnk、p38和rac1路径中的一种或多种中细胞内蛋白的表达或活性增加或减少。
实施例231.如实施例229所述的用途，其中所述蛋白是所述ret-erk路径中选自以下的细胞内蛋白：erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2。
实施例232.如实施例229所述的用途，其中所述蛋白是所述ret-akt路径中选自以下的细胞内蛋白：akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor。
实施例233.如实施例220至228中任一项所述的用途，其中所述生物学反应是所述细胞中蛋白激酶的磷酸化与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白激酶的磷酸化相比增加或减少。
实施例234.如实施例233所述的用途，其中所述蛋白激酶是细胞内蛋白激酶，其中所述细胞内蛋白激酶被所述细胞表面受体激酶直接或间接磷酸化。
实施例235.如实施例220至234中任一项所述的用途，其中所述受试者超重或肥胖。
实施例236.如实施例220至235中任一项所述的用途，其中所述受试者的身体质量指数在25与29.9之间。
实施例237.如实施例220至235中任一项所述的用途，其中所述受试者的身体质量指数为30或更高。
实施例238.一种可溶性gfral，其包含有包含结构域d2和d3的gfral细胞外结构域。
实施例239.如实施例238所述的可溶性gfral，其中所述可溶性gfral包含缺乏结构域d1的gfral细胞外结构域。
实施例240.如实施例238或实施例239所述的可溶性gfral，其中所述可溶性gfral进一步包含信号肽。
实施例241.如实施例238至240中任一项所述的可溶性gfral，其中所述可溶性gfral包含seqidno:1的氨基酸序列或其功能变体。
实施例242.如实施例238至240中任一项所述的可溶性gfral，其中所述可溶性gfral或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。
实施例243.如实施例238至240中任一项所述的可溶性gfral，其中所述可溶性gfral或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
实施例244.如实施例238至240中任一项所述的可溶性gfral，其中所述可溶性gfral包含seqidno:2的氨基酸序列或其功能变体。
实施例245.如实施例238至244中任一项所述的可溶性gfral，其中所述可溶性gfral进一步包含(例如，融合至)亲和标签。
实施例246.如实施例245所述的可溶性gfral，其中所述亲和标签包含淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、flag标签或myc标签。
实施例247.一种治疗肥胖或肥胖相关障碍的方法，所述方法包括向受试者施用gdf15肽和可溶性gfral，其中所述gdf15肽在与所述gdf15肽接触的细胞中诱导生物学反应，并且其中所述可溶性gfral包含有包含结构域d2和d3的gfral细胞外结构域。
实施例248.如实施例247所述的方法，其中所述可溶性gfral包含缺乏结构域d1的gfral细胞外结构域。
实施例249.如实施例247或248所述的方法，其中所述可溶性gfral进一步包含信号肽。
实施例250.如实施例247至249中任一项所述的方法，其中所述可溶性gfral包含seqidno:1的氨基酸序列或其功能变体。
实施例251.如实施例247至249中任一项所述的方法，其中所述可溶性gfral或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。
实施例252.如实施例247至249中任一项所述的方法，其中所述可溶性gfral或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
实施例253.如实施例247至249中任一项所述的方法，其中所述可溶性gfral包含seqidno:2的氨基酸序列或其功能变体。
实施例254.如实施例247至253中任一项所述的方法，其中所述可溶性gfral进一步包含(例如，融合至)亲和标签。
实施例255.如实施例254所述的方法，其中所述亲和标签包含淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、flag标签或myc标签。
实施例256.如实施例247至255中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽包含seqidno:13的氨基酸序列或其功能变体。
实施例257.如实施例247至255中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。
实施例258.如实施例247至255中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
实施例259.如实施例247至258中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽包含亲和标签、融合、缀合、peg化和/或糖基化。
实施例260.如实施例247至259中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽用淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、flag标签或myc标签标记。
实施例261.如实施例247至260中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽与人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、免疫球蛋白恒定区或α-1-抗胰蛋白酶融合。
实施例262.如实施例247至261中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽与脂肪酸缀合。
实施例263.如实施例247至262中任一项所述的方法，其中同时施用所述gdf15肽和所述可溶性gfral。
实施例264.如实施例247至262中任一项所述的方法，其中依次施用所述gdf15肽和所述可溶性gfral。
实施例265.如实施例263所述的方法，其中所述gdf15肽和所述可溶性gfral处于相同组合物中。
实施例266.如实施例265所述的方法，其中所述gdf15肽和所述可溶性gfral处于混合物中。
实施例267.如实施例265所述的方法，其中所述gdf15肽和所述可溶性gfral处于二元复合物中。
实施例268.如实施例247至267中任一项所述的方法，其中所述生物学反应是信号转导反应。
实施例269.如实施例247至268中任一项所述的方法，其中所述生物学反应是所述细胞中蛋白的表达或活性与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。
实施例270.如实施例247至269中任一项所述的方法，其中所述生物学反应是ret-erk、ret-akt、蛋白激酶c、jak/stat、jnk、p38和rac1路径中的一种或多种中细胞内蛋白的表达或活性增加或减少。
实施例271.如实施例269所述的方法，其中所述蛋白是所述ret-erk路径中选自以下的细胞内蛋白：erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2。
实施例272.如实施例269所述的方法，其中所述蛋白是所述ret-akt路径中选自以下的细胞内蛋白：akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor。
实施例273.如实施例247至268中任一项所述的方法，其中所述生物学反应是所述细胞中蛋白激酶的磷酸化与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白激酶的磷酸化相比增加或减少。
实施例274.如实施例273所述的方法，其中所述蛋白激酶是细胞内蛋白激酶，其中所述细胞内蛋白激酶被所述细胞表面受体激酶直接或间接磷酸化。
实施例275.如实施例247至274中任一项所述的方法，其中所述受试者超重或肥胖。
实施例276.如实施例247至275中任一项所述的方法，其中所述受试者的身体质量指数在25与29.9之间。
实施例277.如实施例247至275中任一项所述的方法，其中所述受试者的身体质量指数为30或更高。
实施例278.如实施例247至277中任一项所述的方法，其中所述肥胖相关障碍是癌症、体重障碍或代谢疾病或障碍。
实施例279.如实施例247至278中任一项所述的方法，其中所述肥胖相关障碍是癌症、ii型糖尿病(t2dm)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、高甘油三酯血症或心血管疾病。
实施例280.gdf15肽和可溶性gfral在治疗受试者的肥胖或肥胖相关障碍中的用途，其中所述gdf15肽在与所述gdf15肽接触的细胞中诱导生物学反应，并且其中所述可溶性gfral包含有包含结构域d2和d3的gfral细胞外结构域。
实施例281.如实施例280所述的用途，其中所述可溶性gfral包含缺乏结构域d1的gfral细胞外结构域。
实施例282.如实施例280或281所述的用途，其中所述可溶性gfral进一步包含信号肽。
实施例283.如实施例280至282中任一项所述的用途，其中所述可溶性gfral包含seqidno:1的氨基酸序列或其功能变体。
实施例284.如实施例280至282中任一项所述的用途，其中所述可溶性gfral或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。
实施例285.如实施例280至282中任一项所述的用途，其中所述可溶性gfral或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
实施例286.如实施例280至282中任一项所述的用途，其中所述可溶性gfral包含seqidno:2的氨基酸序列或其功能变体。
实施例287.如实施例280至286中任一项所述的用途，其中所述可溶性gfral进一步包含(例如，融合至)亲和标签。
实施例288.如实施例287所述的用途，其中所述亲和标签包含淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、flag标签或myc标签。
实施例289.如实施例280至288中任一项所述的用途，其中所述gdf15肽包含seqidno:13的氨基酸序列或其功能变体。
实施例290.如实施例280至288中任一项所述的用途，其中所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。
实施例291.如实施例280至288中任一项所述的用途，其中所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
实施例292.如实施例280至291中任一项所述的用途，其中所述gdf15肽包含亲和标签、融合、缀合、peg化和/或糖基化。
实施例293.如实施例280至292中任一项所述的用途，其中所述gdf15肽用淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、flag标签或myc标签标记。
实施例294.如实施例280至293中任一项所述的用途，其中所述gdf15肽与人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、免疫球蛋白恒定区或α-1-抗胰蛋白酶融合。
实施例295.如实施例280至294中任一项所述的用途，其中所述gdf15肽与脂肪酸缀合。
实施例296.如实施例280至295中任一项所述的用途，其中同时施用所述gdf15肽和所述可溶性gfral。
实施例297.如实施例280至295中任一项所述的用途，其中依次施用所述gdf15肽和所述可溶性gfral。
实施例298.如实施例296所述的用途，其中所述gdf15肽和所述可溶性gfral处于相同组合物中。
实施例299.如实施例298所述的用途，其中所述gdf15肽和所述可溶性gfral处于混合物中。
实施例300.如实施例298所述的用途，其中所述gdf15肽和所述可溶性gfral处于二元复合物中。
实施例301.如实施例280至300中任一项所述的用途，其中所述生物学反应是信号转导反应。
实施例302.如实施例280至301中任一项所述的用途，其中所述生物学反应是所述细胞中蛋白的表达或活性与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。
实施例303.如实施例280至302中任一项所述的用途，其中所述生物学反应是ret-erk、ret-akt、蛋白激酶c、jak/stat、jnk、p38和rac1路径中的一种或多种中细胞内蛋白的表达或活性增加或减少。
实施例304.如实施例302所述的用途，其中所述蛋白是所述ret-erk路径中选自以下的细胞内蛋白：erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2。
实施例305.如实施例302所述的用途，其中所述蛋白是所述ret-akt路径中选自以下的细胞内蛋白：akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor。
实施例306.如实施例280至301中任一项所述的用途，其中所述生物学反应是所述细胞中蛋白激酶的磷酸化与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白激酶的磷酸化相比增加或减少。
实施例307.如实施例306所述的用途，其中所述蛋白激酶是细胞内蛋白激酶，其中所述细胞内蛋白激酶被所述细胞表面受体激酶直接或间接磷酸化。
实施例308.如实施例280至307中任一项所述的用途，其中所述受试者超重或肥胖。
实施例309.如实施例280至308中任一项所述的用途，其中所述受试者的身体质量指数在25与29.9之间。
实施例310.如实施例280至308中任一项所述的用途，其中所述受试者的身体质量指数为30或更高。
实施例311.如实施例280至310中任一项所述的用途，其中所述肥胖相关障碍是癌症、体重障碍或代谢疾病或障碍。
实施例312.如实施例280至311中任一项所述的用途，其中所述肥胖相关障碍是癌症、ii型糖尿病(t2dm)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、高甘油三酯血症或心血管疾病。
实施例313.一种降低食欲和/或减轻体重的方法，所述方法包括向受试者施用gdf15肽和可溶性gfral，其中所述gdf15肽在与所述gdf15肽接触的细胞中诱导生物学反应，并且其中所述可溶性gfral包含有包含结构域d2和d3的gfral细胞外结构域。
实施例314.如实施例313所述的方法，其中所述可溶性gfral包含缺乏结构域d1的gfral细胞外结构域。
实施例315.如实施例313或314所述的方法，其中所述可溶性gfral进一步包含信号肽。
实施例316.如实施例313至315中任一项所述的方法，其中所述可溶性gfral包含seqidno:1的氨基酸序列或其功能变体。
实施例317.如实施例313至315中任一项所述的方法，其中所述可溶性gfral或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。
实施例318.如实施例313至315中任一项所述的方法，其中所述可溶性gfral或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
实施例319.如实施例313至315中任一项所述的方法，其中所述可溶性gfral包含seqidno:2的氨基酸序列或其功能变体。
实施例320.如实施例313至319中任一项所述的方法，其中所述可溶性gfral进一步包含(例如，融合至)亲和标签。
实施例321.如实施例320所述的方法，其中所述亲和标签包含淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、flag标签或myc标签。
实施例322.如实施例313至321中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽包含seqidno:13的氨基酸序列或其功能变体。
实施例323.如实施例313至321中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。
实施例324.如实施例313至321中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
实施例325.如实施例313至324中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽包含亲和标签、融合、缀合、peg化和/或糖基化。
实施例326.如实施例313至325中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽用淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、flag标签或myc标签标记。
实施例327.如实施例313至326中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽与人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、免疫球蛋白恒定区或α-1-抗胰蛋白酶融合。
实施例328.如实施例313至327中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽与脂肪酸缀合。
实施例329.如实施例313至328中任一项所述的方法，其中同时施用所述gdf15肽和所述可溶性gfral。
实施例330.如实施例313至328中任一项所述的方法，其中依次施用所述gdf15肽和所述可溶性gfral。
实施例331.如实施例329所述的方法，其中所述gdf15肽和所述可溶性gfral处于相同组合物中。
实施例332.如实施例331所述的方法，其中所述gdf15肽和所述可溶性gfral处于混合物中。
实施例333.如实施例331所述的方法，其中所述gdf15肽和所述可溶性gfral处于二元复合物中。
实施例334.如实施例313至333中任一项所述的方法，其中所述生物学反应是信号转导反应。
实施例335.如实施例313至334中任一项所述的方法，其中所述生物学反应是所述细胞中蛋白的表达或活性与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。
实施例336.如实施例313至335中任一项所述的方法，其中所述生物学反应是ret-erk、ret-akt、蛋白激酶c、jak/stat、jnk、p38和rac1路径中的一种或多种中细胞内蛋白的表达或活性增加或减少。
实施例337.如实施例335所述的方法，其中所述蛋白是所述ret-erk路径中选自以下的细胞内蛋白：erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2。
实施例338.如实施例335所述的方法，其中所述蛋白是所述ret-akt路径中选自以下的细胞内蛋白：akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor。
实施例339.如实施例313至334中任一项所述的方法，其中所述生物学反应是所述细胞中蛋白激酶的磷酸化与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白激酶的磷酸化相比增加或减少。
实施例340.如实施例339所述的方法，其中所述蛋白激酶是细胞内蛋白激酶，其中所述细胞内蛋白激酶被所述细胞表面受体激酶直接或间接磷酸化。
实施例341.如实施例313至340中任一项所述的方法，其中所述受试者超重或肥胖。
实施例342.如实施例313至341中任一项所述的方法，其中所述受试者的身体质量指数在25与29.9之间。
实施例343.如实施例313至341中任一项所述的方法，其中所述受试者的身体质量指数为30或更高。
实施例344.gdf15肽和可溶性gfral在降低受试者的食欲和/或减轻体重中的用途，其中所述gdf15肽在与所述gdf15肽接触的细胞中诱导生物学反应，并且其中所述可溶性gfral包含有包含结构域d2和d3的gfral细胞外结构域。
实施例345.如实施例344所述的用途，其中所述可溶性gfral包含缺乏结构域d1的gfral细胞外结构域。
实施例346.如实施例344或345所述的用途，其中所述可溶性gfral进一步包含信号肽。
实施例347.如实施例344至346中任一项所述的用途，其中所述可溶性gfral包含seqidno:1的氨基酸序列或其功能变体。
实施例348.如实施例344至346中任一项所述的用途，其中所述可溶性gfral或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。
实施例349.如实施例344至346中任一项所述的用途，其中所述可溶性gfral或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
实施例350.如实施例344至346中任一项所述的用途，其中所述可溶性gfral包含seqidno:2的氨基酸序列或其功能变体。
实施例351.如实施例344至350中任一项所述的用途，其中所述可溶性gfral进一步包含(例如，融合至)亲和标签。
实施例352.如实施例351所述的用途，其中所述亲和标签包含淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、flag标签或myc标签。
实施例353.如实施例344至352中任一项所述的用途，其中所述gdf15肽包含seqidno:13的氨基酸序列或其功能变体。
实施例354.如实施例344至352中任一项所述的用途，其中所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。
实施例355.如实施例344至352中任一项所述的用途，其中所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
实施例356.如实施例344至355中任一项所述的用途，其中所述gdf15肽包含亲和标签、融合、缀合、peg化和/或糖基化。
实施例357.如实施例344至356中任一项所述的用途，其中所述gdf15肽用淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、flag标签或myc标签标记。
实施例358.如实施例344至357中任一项所述的用途，其中所述gdf15肽与人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、免疫球蛋白恒定区或α-1-抗胰蛋白酶融合。
实施例359.如实施例344至358中任一项所述的用途，其中所述gdf15肽与脂肪酸缀合。
实施例360.如实施例344至359中任一项所述的用途，其中同时施用所述gdf15肽和所述可溶性gfral。
实施例361.如实施例344至359中任一项所述的用途，其中依次施用所述gdf15肽和所述可溶性gfral。
实施例362.如实施例360所述的用途，其中所述gdf15肽和所述可溶性gfral处于相同组合物中。
实施例363.如实施例362所述的用途，其中所述gdf15肽和所述可溶性gfral处于混合物中。
实施例364.如实施例362所述的用途，其中所述gdf15肽和所述可溶性gfral处于二元复合物中。
实施例365.如实施例344至364中任一项所述的用途，其中所述生物学反应是信号转导反应。
实施例366.如实施例344至365中任一项所述的用途，其中所述生物学反应是所述细胞中蛋白的表达或活性与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白的表达或活性相比增加或减少。
实施例367.如实施例344至366中任一项所述的用途，其中所述生物学反应是ret-erk、ret-akt、蛋白激酶c、jak/stat、jnk、p38和rac1路径中的一种或多种中细胞内蛋白的表达或活性增加或减少。
实施例368.如实施例366所述的用途，其中所述蛋白是所述ret-erk路径中选自以下的细胞内蛋白：erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2。
实施例369.如实施例366所述的用途，其中所述蛋白是所述ret-akt路径中选自以下的细胞内蛋白：akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor。
实施例370.如实施例344至365中任一项所述的用途，其中所述生物学反应是所述细胞中蛋白激酶的磷酸化与不与所述gdf15肽接触的对照细胞中相同蛋白激酶的磷酸化相比增加或减少。
实施例371.如实施例370所述的用途，其中所述蛋白激酶是细胞内蛋白激酶，其中所述细胞内蛋白激酶被所述细胞表面受体激酶直接或间接磷酸化。
实施例372.如实施例344至371中任一项所述的用途，其中所述受试者超重或肥胖。
实施例373.如实施例344至372中任一项所述的用途，其中所述受试者的身体质量指数在25与29.9之间。
实施例374.如实施例344至372中任一项所述的用途，其中所述受试者的身体质量指数为30或更高。
实施例375.一种鉴别能够调节gdf15活性的药剂的方法，所述方法包括：
(a)使如实施例125至160中任一项所述的细胞与所述药剂和gdf15肽接触；以及
(b)检测所述经接触细胞中的生物学反应，
其中如果所述经接触细胞中的生物学反应相对于在所述药剂不存在下与所述gdf15肽接触的细胞中的生物学反应增加或减少，则确定所述药剂调节gdf15活性。
实施例376.如实施例375所述的方法，其中所述药剂是抗体。
实施例377.如实施例375或实施例376所述的方法，其中所述药剂是抗gdf15抗体。
实施例378.如实施例375或实施例376所述的方法，其中所述药剂是抗gfral抗体。
实施例379.如实施例375至378中任一项所述的方法，其中所述生物学反应是ret-erk、ret-akt、蛋白激酶c、jak/stat、jnk、p38和rac1路径中的一种或多种中细胞内蛋白的表达、活性或磷酸化水平增加或减少。
实施例380.如实施例379所述的方法，其中所述细胞内蛋白在所述ret-erk路径中并且选自erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2。
实施例381.如实施例379所述的方法，其中所述细胞内蛋白在所述ret-akt路径中并且选自akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor。
实施例382.如实施例375至381中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽包含seqidno:13的氨基酸序列或其功能变体。
实施例383.如实施例375至381中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。
实施例384.如实施例375至381中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
实施例385.如实施例375至384中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽包含亲和标签、融合、缀合、peg化和/或糖基化。
实施例386.如实施例375至385中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽用淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、flag标签或myc标签标记。
实施例387.如实施例375至386中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽与人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、免疫球蛋白恒定区或α-1-抗胰蛋白酶融合。
实施例388.如实施例375至387中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽与脂肪酸缀合。
实施例389.一种鉴别能够调节gdf15活性的药剂的方法，所述方法包括：
(a)提供表达细胞表面受体激酶的细胞；
(b)使所述细胞与gdf15肽和可溶性gfral接触；
(c)使所述细胞与所述药剂接触；以及
(d)检测所述经接触细胞中的生物学反应，
其中所述可溶性gfral包含有包含结构域d2和d3并且缺乏结构域d1的gfral细胞外结构域。
实施例390.如实施例389所述的方法，其中如果在所述gdf15肽、所述可溶性gfral和所述药剂存在下所述经接触细胞中的生物学反应相对于所述药剂不存在下与所述gdf15肽和所述可溶性gfral接触的细胞中的生物学反应增加，则确定所述药剂调节或增加gdf15活性。
实施例391.如实施例389所述的方法，其中如果在所述gdf15肽、所述可溶性gfral和所述药剂存在下所述接触的细胞中的生物学反应相对于所述药剂不存在下与所述gdf15肽和所述可溶性gfral接触的细胞中的生物学反应减少，则确定所述药剂调节或减少gdf15活性。
实施例392.如实施例389至391中任一项所述的方法，其中所述药剂是抗体。
实施例393.如实施例389至392中任一项所述的方法，其中所述药剂是抗gdf15抗体。
实施例394.如实施例389至392中任一项所述的方法，其中所述药剂是抗gfral抗体。
实施例395.如实施例389至394中任一项所述的方法，其中所述生物学反应是ret-erk、ret-akt、蛋白激酶c、jak/stat、jnk、p38和rac1路径中的一种或多种中细胞内蛋白的表达、活性或磷酸化水平增加或减少。
实施例396.如实施例395所述的方法，其中细胞内蛋白在所述ret-erk路径中并且选自erk、shc1、frs2、grb2、gab1、gab2、sos、shank3、grb7、grb10、jak1、jak2、raf、ras、mek1、mek2、rsk1、rsk2、rsk3、mnk1、mnk2、msk1和msk2。
实施例397.如实施例395所述的方法，其中所述细胞内蛋白在所述ret-akt路径中并且选自akt、src、shc1、grb2、cbl、gab1、gab2、shank3、jak1、jak2、ras、pi3k、pdk1、yap、bad、半胱天冬酶-9、foxo1、foxo3、foxo4、ikkα、creb、mdm2、mlk3、ask1、p21cip1、p27kip1、gsk3α、gsk3β和mtor。
实施例398.如实施例389至397中任一项所述的方法，其中所述可溶性gfral包含seqidno:1的氨基酸序列或其功能变体。
实施例399.如实施例389至397中任一项所述的方法，其中所述可溶性gfral或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。
实施例400.如实施例389至397中任一项所述的方法，其中所述可溶性gfral或功能变体与seqidno:1的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
实施例401.如实施例389至400中任一项所述的方法，其中所述可溶性gfral进一步包含(例如，融合至)亲和标签。
实施例402.如实施例401所述的方法，其中所述亲和标签包含淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、flag标签或myc标签。
实施例403.如实施例389至402中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽包含seqidno:13的氨基酸序列或其功能变体。
实施例404.如实施例389至402中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。
实施例405.如实施例389至402中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽或功能变体与seqidno:13的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性。
实施例406.如实施例389至405中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽包含亲和标签、融合、缀合、peg化和/或糖基化。
实施例407.如实施例389至406中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽用淀粉样β前体蛋白标签、组氨酸标签、flag标签或myc标签标记。
实施例408.如实施例389至407中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽与人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、免疫球蛋白恒定区或α-1-抗胰蛋白酶融合。
实施例409.如实施例389至408中任一项所述的方法，其中所述gdf15肽与脂肪酸缀合。
实施例410.一种生产包含药剂的药物组合物的方法，所述方法包括：
(a)通过如实施例375至409中任一项所述的方法鉴别能够调节gdf15活性的药剂；以及
(b)将所述药剂配制在药物组合物中。
实施例411.如实施例410所述的方法，其中所述药剂是抗体。
实施例412.如实施例410或实施例411所述的方法，其中所述药剂是抗gdf15抗体。
实施例413.如实施例410或实施例411所述的方法，其中所述药剂是抗gfral抗体。
实施例414.一种治疗受试者的肥胖或肥胖相关障碍的方法，所述方法包括：
(a)通过如实施例375至409中任一项所述的方法鉴别能够调节gdf15活性的药剂；以及
(b)向所述受试者施用所述药剂。
实施例415.如实施例414所述的方法，其中所述药剂是抗体。
实施例416.如实施例414或实施例415所述的方法，其中所述药剂是抗gdf15抗体。
实施例417.如实施例414或实施例415所述的方法，其中所述药剂是抗gfral抗体。
实施例418.如实施例414至417中任一项所述的方法，其中所述受试者超重或肥胖。
实施例419.如实施例414至418中任一项所述的方法，其中所述受试者的身体质量指数在25与29.9之间。
实施例420.如实施例414至418中任一项所述的方法，其中所述受试者的身体质量指数为30或更高。
实施例421.如实施例414至420中任一项所述的方法，其中所述肥胖相关障碍是癌症、体重障碍或代谢疾病或障碍。
实施例422.如实施例414至421中任一项所述的方法，其中所述肥胖相关障碍是癌症、ii型糖尿病(t2dm)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、高甘油三酯血症或心血管疾病。
实施例423.一种降低受试者的食欲和/或减轻体重的方法，所述方法包括：
(a)通过如实施例375至409中任一项所述的方法鉴别能够调节gdf15活性的药剂；以及
(b)向所述受试者施用所述药剂。
实施例424.如实施例423所述的方法，其中所述药剂是抗体。
实施例425.如实施例423或实施例424所述的方法，其中所述药剂是抗gdf15抗体。
实施例426.如实施例423或实施例424所述的方法，其中所述药剂是抗gfral抗体。
实施例427.如实施例423至426中任一项所述的方法，其中所述受试者超重或肥胖。
实施例428.如实施例423至427中任一项所述的方法，其中所述受试者的身体质量指数在25与29.9之间。
实施例429.如实施例423至427中任一项所述的方法，其中所述受试者的身体质量指数为30或更高。
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