采用颗粒聚集或解聚的均相测定的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年8月16日提交的美国临时专利申请no.62/719,062的优先权的权益，凭借该临时专利申请的内容并且通过引用以其整体并入本文。本文提及的任何出版物或专利文献的全部公开内容通过引用整体并入。

本公开涉及执行生物学和化学测定例如免疫测定和核酸测定的装置和方法。

背景技术：

在生物学和化学测定(例如，诊断测试)中，通常优选不需要洗涤的均相测定。本公开提供用于实现这些目标的装置和方法。

技术实现要素：

在一个或多个实施例中，本公开提供用于采用由分析物引起的颗粒聚集的均相测定的装置和方法，用于采用由分析物引起的颗粒解聚的均相测定的装置和方法，以及用于测量由分析物引起的聚集的或解聚的颗粒的系统。

附图说明

附图仅用于说明目的。这些附图可以是或可以不是按比例绘制的。

图1示出了其中某些颗粒已经聚集在液体样品中的示例性实施例。

图2示出了如何对样品进行成像和分析以获得最佳结果的几个示例性实施例。

图3示出了示例性流程图并说明了所公开的聚集颗粒测定的过程。

图4示出了用于聚集颗粒测定的开放和闭合板构造。

图5示出了聚集颗粒测定的生物化学过程。

图6示出了来自crp聚集颗粒测定的图像。

具体实施方式

以下具体实施方式通过示例而非限制的方式示出了本发明的一些实施例。这里使用的章节标题和任何字幕仅用于组织目的，而不应被解释为以任何方式限制所描述的题材。章节标题和/或子标题下的内容不限于章节标题和/或子标题，而是适用于本公开的整个描述。

本公开的一个目的是在“一步法”中执行均相测定。“一步法”测定是指在测定中，在测定中滴一滴样品，然后读取信号，并且在两者之间没有其它步骤(例如，在步骤之间没有洗涤)。测定包括例如蛋白质测定和核酸测定。

本公开的一个方面是允许在“一步法”中进行均相测定而不使用任何洗涤。在“一步法”测定中，其使用可相对于彼此移动的两个板，将具有分析物的样品滴在板中的一个或两个上，将两个板彼此压靠以将样品的至少一部分压缩成薄层，随后在没有任何洗涤的情况下从板读取信号。

该方法的另一个显著特征可以是，例如，在某些实施例中，测定的两个板由人手按压，并且通过使用如本文所指定的特定组的板和间隔件，样品的至少一部分具有均匀的厚度。

为了实现检测样品中的分析物的一步法测定，本公开的关键方法是通过在添加分析物之后使溶液中的颗粒聚集和/或解聚，然后使用图像或一次性集总光信号来分析测定中的分析物。

在一个实施例中，本公开提供了一种用于采用颗粒聚集的均相测定的装置，其包含：

第一板、第二板以及间隔件，其中：

i.板可相对于彼此移动成不同的构造，包括开放构造和闭合构造；

ii.板中的每个在其相应的内表面上具有用于接触含有或怀疑含有样品的样品接触区域；

iii.板中的一个或两个在样品接触区域内包含具有预定的基本上均匀的高度的一个或多个间隔件；并且

iv.板中的一个或两个在各自的内表面上包含多个分离的颗粒，其中颗粒具有固定在其上的捕获剂，其中捕获剂能够结合并固定分析物，并且在结合至分析物之后引起分离的颗粒的聚集；

其中在开放构造中，两个板是部分或完全分开的，板之间的间距不通过间隔件调节，并且样品沉积在板中的一个或两个上；并且

其中在闭合构造中，闭合构造是在样品沉积在开放构造之后配置的：样品的至少一部分通过两个板压缩成厚度非常均匀的层，并且层的均匀厚度通过板的样品接触表面限定并且通过板和间隔件调节。

在一个实施例中，本公开提供了一种用于采用颗粒聚集的均相测定的装置，其包含：

第一板、第二板以及间隔件，其中：

i.板可相对于彼此移动成不同的构造，包括开放构造和闭合构造；

ii.板中的每个在其相应的内表面上具有用于接触含有或怀疑含有样品的样品接触区域；

iii.板中的一个或两个在样品接触区域内包含具有预定的基本上均匀的高度的一个或多个间隔件；并且

iv.板中的一个或两个在各自的内表面上包含多个聚集的颗粒，其中颗粒具有彼此连接的结合剂；并且其中当分析物与颗粒接触时，分析物能够使聚集的颗粒解聚；

其中在所述开放构造中，所述两个板是部分或完全分开的，所述板之间的间距不通过所述间隔件调节，并且所述样品沉积在所述板中的一个或两个上；以及

其中在闭合构造中，闭合构造是在样品沉积在开放构造之后配置的：样品的至少一部分通过两个板压缩成厚度非常均匀的层，并且层的均匀厚度通过板的样品接触表面限定并且通过板和间隔件调节。

在一个实施例中，本公开提供一种用于测量由分析物引起的聚集颗粒或解聚颗粒的系统，其包含：任何现有设备，发射光的光源，以及成像器，其中成像器被配置为测量透射通过聚集或解聚颗粒，从聚集或解聚颗粒散射或从聚集或解聚颗粒反射的光，或其任何组合。

在一个实施例中，本公开提供了一种执行采用颗粒聚集的均相测定的方法，其包含以下步骤：

(a)获得怀疑含有分析物的样品；

(b)获得第一板和第二板，其中：

i.板可相对于彼此移动成不同的构造，包括开放构造和闭合构造；

ii.板中的每个在其相应的内表面上具有用于接触样品的样品接触区域。

iii.板中的一个或两个包含间隔件，间隔件中的至少一个在样品接触区域内，并且间隔件具有预定的基本上均匀的高度；以及

iv.板中的一个或两个在相应的内表面上包含多个分离的颗粒或聚集的颗粒；

(c)当板处于开放构造时，将样品沉积在板中的一个或两个上，其中，两个板部分地或完全地分开并且板之间的间距不通过间隔件调节；以及

(d)在(c)之后，将两个板结合在一起并且将板按压成闭合构造，其中，样品的至少一部分通过两个板压缩成厚度非常均匀的层，层的均匀厚度通过两个板的样品表面限定并且通过间隔件和板调节；以及

(e)当板处于闭合构造时，通过图像或一次性集总光信号检测和分析均匀厚度层中的颗粒。

根据以上任一实施例所述的装置和方法，其中颗粒在其光学特性上是不同的，光学特性选自：光致发光、电致发光，以及电化学发光，光吸收、反射、透射、衍射、散射、扩散、表面拉曼散射，以及其任何组合。

根据以上任一实施例所述的装置和方法，本公开中的颗粒可以是例如生物的/非生物的、有机的/非有机的、磁性的/非磁性的、金属的/非金属的，或发光的/非发光的。

在一些实施例中，颗粒包括天然颗粒或人造颗粒，或其组合或混合物。例如，颗粒包括天然生物实体，例如但不限于细胞，细胞碎片，大分子(例如，多糖、蛋白质或核酸)，细胞聚集物，组织或病毒颗粒。在一些实施例中，颗粒包括人造物体，例如但不限于聚合物颗粒、金属颗粒、磁性颗粒或半导体颗粒，或其组合或混合物。

在一些实施例中，本公开的颗粒(例如，珠)可以包括聚合物，例如但不限于聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、胶乳或其任何组合。

在一些实施例中，本公开的颗粒(例如，珠粒)包括金属，例如但不限于金、银、铜和铂。

在一些实施例中，本公开的颗粒(例如，珠粒)包括金纳米颗粒、金纳米壳、金纳米管等。

在一些实施例中，本公开的颗粒(例如，珠粒)包括半导体，例如但不限于cdse、cds和cds或采用zns涂覆的cdse。在一些实施例中，本公开的颗粒(例如，珠粒)可以包括磁性材料，例如但不限于磁铁矿，以及磁化的zns、zno、tio2、agi、agbr、hgi2、pbs、pbse、znte、cdte、in2s3、in2se3、cd3p2、cd3as2、inas，以及gaas。

在一些实施例中，颗粒可以具有任何形状，例如，球形(通常称为珠粒)或棒状，或不规则形状，并且颗粒群可以具有相同形状或尺寸的颗粒或具有不同形状或尺寸的颗粒。颗粒可以是尺寸(棒或球的平均直径)在纳米水平的纳米颗粒述颗粒可以是具有微米级尺寸的微粒。在一些实施例中，珠粒群中的珠粒可以具有均匀的直径或不同的直径。

在一些实施例中，颗粒的尺寸可以为约5nm到约10μm。在一些实施例中，颗粒尺寸小于2nm、5nm、10nm、20nm、50nm、100nm、200nm、500nm、1um、2um、5um、10um、20um、50um、100um、200um、500um、1mm、2mm、5mm、10mm、20mm、50mm，或100mm，或在所述任何两个值之间的范围内。在一些实施例中，珠粒可以具有100nm、500nm、1μm、5μm、50μm、500μm、1mm或在所述任何两个值之间的范围内，以及1μm到10μm的优选范围的尺寸。

在一些实施例中，颗粒尺寸优选为约5nm到约10nm。

在一些实施例中，颗粒尺寸优选为约10nm到约50nm。

在一些实施例中，颗粒尺寸优选为约50nm到约100nm。

在一些实施例中，颗粒尺寸优选为约100nm到约500nm。

在一些实施例中，颗粒尺寸优选为约500nm到约1000nm。

在一些实施例中，颗粒尺寸优选为约1μm到约5μm。

在一些实施例中，颗粒尺寸优选为约5μm到约10μm。

在一些实施例中，颗粒尺寸小于2nm、5nm、10nm、20nm、50nm、100nm、200nm、500nm、1um、2um、5um、10um、20um、50um、100um、200um、500um、1mm、2mm、5mm、10mm、20mm、50mm，或100mm，或在所述任何两个值之间的范围内。在一些实施例中，珠粒可以具有100nm、500nm、1μm、5μm、50μm、500μm、1mm或在所述任何两个值之间的范围内，以及1μm到10μm的优选范围的尺寸。

在一个优选实施例中，间隔件高度、板之间的间距，和/或样品厚度在1.5μm到2.5μm之间。

在一个优选实施例中，间隔件高度、板之间的间距，和/或样品厚度在2.5μm到4μm之间。

在一个优选实施例中，间隔件高度、板之间的间距，和/或样品厚度在4μm到6μm之间。

在一个优选实施例中，间隔件高度、板之间的间距，和/或样品厚度在6μm到10μm之间。

在一个优选实施例中，间隔件高度、板之间的间距，和/或样品厚度在10μm到15μm之间。

在一个优选实施例中，间隔件高度、板之间的间距，和/或样品厚度在15μm到25μm之间。

在一个优选实施例中，间隔件高度、板之间的间距，和/或样品厚度在25μm到35μm之间。

在一个优选实施例中，间隔件高度、板之间的间距，和/或样品厚度在35μm到50μm之间。

在一个优选实施例中，间隔件高度、板之间的间距，和/或样品厚度在50μm到100μm之间。

在一个优选实施例中，间隔件高度、板之间的间距，和/或样品厚度在100μm到150μm之间。

在一个优选实施例中，间隔件高度、板之间的间距，和/或样品厚度在150μm到200μm之间。

在一些实施例中，除了结合剂之外，颗粒采用试剂涂覆或衍生化以增强选定分析物的结合。例如，颗粒可以包括二氧化硅涂层或采用链霉亲和素衍生化。

在一些实施例中，本公开的颗粒的聚集可通过颗粒之间或位于颗粒表面上的试剂之间的结合来诱导。

在一些实施例中，试剂的结合是生物、生物化学、化学或物理(例如，磁)效应的结果。例如，试剂之间的结合可以是抗体-抗原结合，核酸(例如dna、rna或其他核酸的互补链)的互补结合，催化剂与其基板之间的结合，针对其靶标的结合或适体，针对其靶标的rna干扰序列的结合，配体-受体结合，或试剂与其激动剂或拮抗剂之间的结合。

在一些实施例中，聚集自然发生或通过诱导发生，例如通过使结合剂与颗粒结合。

在一些实施例中，在接触分析物之前，样品中接近100％的颗粒聚集。在一些实施例中，在接触所述分析物之前，聚集的颗粒的百分比大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％，或在所述任何两个值之间的范围内。在某些实施例中，在接触分析物之前，聚集的颗粒的百分比大于60％、70％、80％、90％、95％或99％，或在所述任何两个值之间的范围内。

在一些实施例中，在接触分析物之后，样品中接近100％的颗粒聚集。在一些实施例中，在接触分析物之后，聚集的颗粒的百分比大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％，或在所述任何两个值之间的范围内。在某些实施例中，在接触所述分析物之后，聚集的颗粒的百分比大于60％、70％、80％、90％、95％或99％，或在所述任何两个值之间的范围内。

参考附图，图1示出了本发明的示例性实施例，其中某些颗粒已经聚集在液体样品中。图1的图(a)示出了液体样品的透视图，图(b)示出了液体样品的顶视图。如图1所示，颗粒可以聚集至不同的水平，导致与聚集体不同的聚集体尺寸和不同的信号强度。

在一些实施例中，对样品成像，并且分析图像以测量靶分析物的浓度。

在一些实施例中，对样品成像，并且对图像中的颗粒聚集进行计数、分级和分析以测量靶分析物的浓度。

在一些实施例中，对样品成像，并且对图像中的单个颗粒和颗粒聚集进行计数、分级和分析以测量靶分析物的浓度。

在一些实施例中，不对样品成像，而是分析通过装置的一次性集总光信号，例如透射率、吸收率、吸收率波长偏移、颜色，以测量目标分析物的浓度。

在某些实施例中，聚集随着分析物浓度的增加而增加。

在某些实施例中，聚集随着分析物浓度的增加而减少。

在一些实施例中，较高浓度的分析物可以导致较大的聚集体尺寸。例如，当分析物处于低浓度时，虽然更多的颗粒不聚集(导致仅包括一个颗粒的聚集体)或仅适度聚集(导致包括少量颗粒的聚集体，例如，2或3)，但更高浓度的分析物诱导更多的聚集，例如，导致更大的聚集体，其在每个聚集体中包括更高的平均颗粒数。

图2示出了如何对样品进行成像和分析以获得最佳结果的几个示例性实施例。在图2的图(a)中，样品处于薄层中，但不附着于任何板；在图2的板(b)中，样品是在板上的薄层；在图2的板(c)中，样品处于在两个板(例如，qmax装置的第一板和第二板)之间压缩的薄层中。

图2示出了样品制备和成像方法：(a)样品处于薄层中，但不附着于任何平板；(b)样品处于板上的薄层中；(c)样品处于在两个板之间压缩的薄层中；(d)成像装置可以捕获样品的层的一个或多个图像(箭头指示成像器定位，未示出)；以及(e)样品可以通过三维(3-d)扫描技术成像，该技术捕获样品整个厚度中的所有聚集体(箭头表示成像器定位，未示出)。

图3示出了示例性流程图并说明了所公开的聚集颗粒测定的过程。

图4示出了用于聚集颗粒测定的开放和闭合板构造：a)是开放构造，其中第一板涂覆有抗体缀合珠粒；和b)处于闭合构造。添加样品时，闭合两板。珠粒在存在来自样品的分析物的情况下形成聚集体。

图5示出了聚集颗粒测定的生物化学过程。利用多克隆抗体涂覆珠粒。在存在分析物的情况下，分析物上的多个表位可以与多克隆抗体结合以形成简单的单一聚集或复合聚集。

在一些实施例中，涂覆在颗粒上的抗体可以是例如一种类型的多克隆抗体、多克隆抗体的混合物，或单克隆抗体的混合物，或单克隆抗体和多克隆抗体的混合物。

在一些实施例中，测定中试剂之间的结合可以是例如抗体-抗原结合，核酸(例如dna、rna或其它核酸的互补链)的互补结合，催化剂与其基板之间的结合，针对其靶标的结合或适体，针对其靶标的rna干扰序列的结合，配体-受体结合，或试剂与其激动剂或拮抗剂之间的结合。

在一些实施例中，颗粒的聚集可例如通过添加激动剂来诱导。

在一些实施例中，颗粒的聚集可以例如通过添加拮抗剂来逆转。

在一些实施例中，成像区域可以是例如单层、多重层或液体样品的整个3d空间。

在一些实施例中，成像可例如通过明场聚集或等离子共振移位来实现。

在一些实施例中，如果样品的厚度小于预定值(例如，约，0.5μm，1μm，2μm，5μm或10μm)，或者如果样品的厚度与颗粒的尺寸之间的比率小于预定值(例如，约，50、20、10、5，或者2微米)，样品可以直接成像，因为样品中聚集体的任何显著重叠是不太可能的。这种重叠取决于样品的厚度和样品厚度与颗粒尺寸之间的比率。当厚度较低时和/或当比率较低时，重叠的可能性也较低。在一些实施例中，该比率可以是例如小于1000、500、200、100、50、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1.5，或1.2，或在所述任何两个值之间的范围内。

在一些实施例中，为了提高结果的准确度，需要对样品的超过一定百分比的横向面积进行成像。

例如，在一些实施例中，成像面积与总样品面积的比率可以为例如大于1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％，或在所述任何两个值之间的范围内。在某些实施例中，成像面积相对于总样品面积的比率可例如在约1％至约10％的范围内。

在图2的图(d)和(e)中，样品的厚度大于预定值(例如，10μm、20μm、50μm或100μm)。在一些实施例中，当样品厚度大于预定值时，或当样品厚度与颗粒尺寸之间的比率高于预定值时(例如10、20、50或100)，样品的成像和分析物的测量可采用替代方法。例如，如图2的图(d)所示，成像装置可捕获样品的层的一个或多个图像，其中图像可用于评估样品中分析物的总浓度。在某些实施例中，如图2的图(e)中所示，样品可以通过三维(3d)扫描技术成像，该技术捕获样品整个厚度中的所有聚集体而不减少任何重叠。本发明中使用的三维扫描技术可以是产生样品的整体扫描结果的任何接触或非接触三维技术。例如，3d扫描技术可以是飞行时间扫描或三角测量扫描，或其任何变化或改进。

其他原理和方法：

在一些实施例中，聚集测定可以使用例如金纳米颗粒或微米颗粒通过与分析物结合来形成聚集物。

在一些实施例中，金颗粒涂覆有对靶分析物具有结合亲和力的试剂。颗粒的尺寸可以是例如从约5nm到约10μm。该形状可以是例如球形(通常称为珠粒)或棒状，或不规则形状，并且颗粒群可以具有相同形状和尺寸的颗粒或不同形状或尺寸的颗粒。

在一些实施例中，涂覆可例如通过共价键或被动吸收实现。金颗粒可以是例如纯金或具有包围例如胶乳或二氧化硅之类的其它材料的核颗粒的金壳。金壳的厚度可以是从约1nm到约10μm。

在一些实施例中，涂覆的金颗粒可以在qmax卡上印刷或喷雾并干燥。

在一些实施例中，聚集可以如下形成：将液体样品加入qmax卡上并闭合该卡。沉积的金颗粒在液体中从qmax卡中释放出来。如果样品含有靶分析物，则涂覆的金颗粒可在靶表面上的多个位置处结合至靶并形成聚集体。聚集可以是其中多个金颗粒结合到单个分析物的简单聚集，或其中在多个金颗粒和多个分析物之间形成“网络”的复杂聚集。

在一些实施例中，形成的颗粒聚集可以例如在可见波长或指定波长范围下成像。

在一些实施例中，分析物浓度和颗粒聚集可例如从颗粒的波长偏移进行分析。

在一些实施例中，可以例如根据聚集颗粒的尺寸分析颗粒的分析物浓度和聚集。

在一些实施例中，可以例如根据解聚颗粒的尺寸分析颗粒的分析物浓度和聚集。

在一些实施例中，可以通过图像分析确定聚集体的颜色(吸收波长范围，荧光波长范围)，尺寸和数量。

或者，在一些实施例中，尺寸或聚集可例如通过金颗粒聚集的等离子共振位移来确定。

在一些实施例中，在解聚测定中，存在的颗粒聚集在分析物存在下解离。

在一些实施例中，颗粒涂覆有对特定试剂具有结合亲和力的试剂。将涂覆的金颗粒与特定试剂预混合，使得在测定前已经形成聚集。

在一些实施例中，通过靶分析物解离聚集的性质可以是预结合试剂的裂解(例如，核酸的酶裂解)，预结合试剂的去除或破坏(例如，预结合蛋白质的变性)，或与预结合试剂的竞争。当这种分析物存在于样品中时，预形成的聚集将解离。

在一些实施例中，聚集的解离可以例如通过去除或破坏预结合试剂(例如，使预结合的蛋白质变性)来完成。

根据以上任一实施例所述的装置、试剂盒、系统、智能电话系统和方法，其中颗粒由选自由以下组成的群组的材料制成：聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、pmmg、pc、coc、cop、玻璃、树脂、铝、金或其它金属或表面可经改性以与捕获剂缔合的任何其它材料。

根据以上任一实施例所述的装置、试剂盒、系统、智能电话系统和方法，其中利用蛋白质稳定剂处理珠粒。

根据以上任一实施例所述的装置、试剂盒、系统、智能电话系统和方法，其中捕获剂与珠粒缀合。

根据以上任一实施例所述的装置、试剂盒、系统、智能电话系统和方法，其中珠粒通过以下步骤制备：利用n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)活化；利用bsa溶液封闭；利用捕获剂溶液孵育。

根据以上任一实施例所述的装置、试剂盒、系统、智能电话系统和方法，其中液体样品是选自由以下组成的群组的生物样品：羊水，房水，玻璃体液，血液(例如，全血、分级分离的血液、血浆或血清)，母乳，脑脊髓液(csf)，耳垢(耳屎)，乳糜，内淋巴，内淋巴，外淋巴，粪便，呼吸，胃酸，胃液，粘液(包括鼻引流和痰)，心包液，腹膜液，胸膜液，脓液，风湿液，唾液，呼出的冷凝物，皮脂，精液，痰，汗液，滑液，泪液，呕吐物，尿液，以及其任何组合。

根据以上任一实施例所述的装置、试剂盒、系统、智能电话系统和方法，其中样品是来自选自由以下组成的群组的来源的环境液体样品：河流，湖泊，池塘，海洋，冰川，冰山，雨水，雪，污水，水库，自来水或饮用水；来自土壤，堆肥，砂，岩石，混凝土，木材，砖，污物等的固体样品，及其任何组合。

示例

用于人crp(c反应蛋白)的均相颗粒聚集

在此，我们描述根据本公开的一个实施例的人crp的均相qmax免疫测定实验。

在该实验中，用于免疫测定的装置包括第一板和第二板。使用常规载玻片作为第一板，并且使用具有10μm间隔件的x板作为第二板，如图4所示。使用带有明场适配器的iphone作为检测器。

该实验根据以下程序进行：

1.抗体缀合。根据制造商手册将兔多克隆抗crp(abcam)缀合至2μm蛋白a聚苯乙烯珠粒(invitrogen)。然后在4℃下利用含4％bsa的pbs封闭缀合的珠粒过夜。

2.将板涂覆。1将μl的缀合珠粒滴入q卡的基板卡片上并空气干燥。

3.添加样品。将具有不同浓度的3μl的crp溶液(在pbs中)添加到基板卡上，然后利用x板(2μm柱高度)覆盖。

4.成像1分钟后，通过iphone6s和明场适配器成像q卡的明场。

图6示出了来自crp聚集颗粒测定的图像。检测不同浓度crp，1min后拍摄明场图像。注意，聚集尺寸与分析物浓度明显相关。

压缩调节开放流(crof)

在测定中，样品或试剂的操作可以导致测定的改进。该操作包括但不限于操作样品和/或试剂的几何形状和位置，样品与试剂的混合或结合，以及试剂样品与板的接触区域。

本发明的许多实施例使用称为“压缩调节开放流(crof)”的方法和执行crof的装置来操作样品和/或试剂的几何尺寸、位置、接触区域以及混合。

术语“压缩开放流(cof)”是指通过以下方式改变沉积在板上的可流动样品的形状的方法：(i)将另一个板放置在样品的至少一部分的顶部上，和(ii)然后通过将两个板朝向彼此推动而在两个板之间压缩样品；其中该压缩减小了样品的至少一部分的厚度并且使得样品流入板之间的开放空间中。

术语“压缩调节开放流”或“crof”(或“自校准压缩开放流”或“scof”或“sccof”)是指特定类型的cof，其中在压缩之后部分或整个样品的最终厚度由间隔件“调节”，其中间隔件放置在两个板之间。

crof中的术语“部分或整个样品的最终厚度通过间隔件调节”是指在crof处理中，一旦达到特定的样品厚度，两个板的相对移动以及因此样品厚度的变化停止，其中特定厚度由间隔件确定。

crof方法的一个实施例包含：

(a)获得可流动的样品；

(b)获得可相对于彼此移动成不同构造的第一板和第二板，其中每个板具有基本上平坦的样品接触表面，其中板中的一个或两个包含间隔件并且间隔件具有预定高度，并且间隔件位于相应的样品接触表面上；

(c)当板被配置为开放构造时，将样品沉积在板中的一个或两个上；其中开放构造是其中两个板部分地或完全地分开并且板之间的间距不通过间隔件调节的构造；和

(d)在(c)之后，通过使板形成闭合构造来铺展样品，其中，在闭合构造中，板彼此面对，间隔件和样品的相关体积在板之间，样品的相关体积的厚度通过板和间隔件调节，其中相关体积是样品的整个体积的至少一部分，并且其中在样品铺展期间，样品在两个板之间横向流动。

除非另外指明，否则术语“板”是指在crof处理中使用的板，其是具有可与另一板一起用于压缩放置在两个板之间的样品以减小样品厚度的表面的固体。

术语“板”或“成对板”是指crof处理中的两个板。

术语“第一板”或“第二板”是指在crof处理中使用的板。

术语“板彼此面对”是指其中成对板至少部分地彼此面对的情况。

除非另有说明，术语“间隔件”或“止动件”是指当放置在两个板之间时对两个板之间的最小间距设定限制的机械物体，当将两个板压缩在一起时可以达到该限制。即，在压缩过程中，间隔件将停止两个板的相对运动，以防止板间距变得小于预设(即预定)值。有两种类型的间隔件：“开放间隔件”和“封闭间隔件”。

术语“开放间隔件”意指间隔件具有允许液体围绕间隔件的整个周边流动并流动通过间隔件的形状。例如，柱是开放间隔件。

术语“封闭间隔件”是指具有液体不能流过间隔件的整个周边并且不能流过间隔件的形状的间隔件。例如，环形间隔件是用于环内的液体的封闭间隔件，其中，环形间隔件内的液体保持在环内，并且不能流到外部(外周边)。

术语“间隔件具有预定高度”和“间隔件具有预定间隔件间距”分别意指间隔件高度和间隔件间距的值在crof处理之前是已知的。如果在crof处理之前间隔件高度和间隔件间距的值未知，则其不是预定的。例如，在将珠粒作为间隔件喷射在板上的情况下，在珠粒落在板的随机位置上的情况下，间隔件间距不是预定的。不预定的间隔件间距的另一示例是间隔件在crof处理期间移动。

在crof处理中，术语“间隔件固定在其相应的板上”意味着间隔件附接到板的位置，并且在crof处理中保持到该位置的附接(即，间隔件在相应的板上的位置不改变)。“间隔件与其相应的板固定”的示例是间隔件由板的一件材料整体制成，并且间隔件相对于板表面的位置在crof期间不改变。“间隔件不与其相应的板固定”的示例是间隔件通过粘合剂粘合到板，但是在板的使用期间，在crof期间，粘合剂不能将间隔件保持在板表面上的原始位置，并且间隔件移动离开板表面上的原始位置。

术语“间隔件整体地固定至板”是指间隔件和板的行为类似于单件物体，其中，在使用期间，间隔件不从其在板上的原始位置移动或分离。

在crof处理中的两个板的术语“开放构造”是指这样的构造，其中两个板部分地或完全地分开，并且板之间的间隔不通过间隔件调节。

在crof处理中的两个板的术语“闭合构造”意指其中板彼此面对，间隔件和样品的相关体积在板之间，样品的相关体积的厚度通过板和间隔件调节的构造，其中相关体积是样品的整个体积的至少一部分。

在crof处理中，术语“样品厚度通过板和间隔件调节”是指，对于板、样品、间隔件和板压缩方法的给定条件，在板的闭合构造下样品的至少一个端口的厚度可以根据间隔件和板的性质预定。

在crof装置中，板的术语“内表面”或“样品表面”是指板的接触样品的表面，而板的另一表面(不接触样品)称为“外表面”。

crof装置的术语“x板”是指包含位于板的样品表面上的间隔的板，其中间隔件具有预定间隔件间距和间隔件高度，并且其中间隔件中的至少一个在样品接触区域内。

术语“crof装置”是指执行crof处理的装置。术语“crofed”是指使用crof处理。例如，术语“样品是crofed”意指将样品放置在crof装置内，进行crof处理，并且除非另外说明，否则将样品保持在crof的最终构造。

术语“crof板”是指用于进行crof处理的两个板。

术语平坦表面的“表面平滑度”或“表面平滑度变化”是指平坦表面在大约或小于几微米的短距离上与完美平坦平面的平均偏差。表面平滑度与表面平整度变化不同。平坦表面可具有良好的表面平整度，但表面光滑度差。

术语平坦表面的“表面平整度”或“表面平整度变化”是指在大约或大于10μm的长距离上平坦表面与完美平坦平面的平均偏差。表面平整度变化与表面光滑度不同。平坦表面可以具有良好的表面光滑度，但是较差的表面平整度(即，较大的表面平整度变化)。

术语板或样品的“相对表面平整度”是板表面平整度变化与最终样品厚度的比率。

除非另外指明，否则crof处理中的术语“最终样品厚度”是指corf处理中板的闭合构造处的样品厚度。

crof中的术语“压缩方法”是指将两个板从开放构造到闭合构造的方法。

术语板的“目标区域”或“关注区域”是指与板执行的功能相关的板的区域。

术语“至多”意指“等于或小于”。例如，间隔件高度至多为1μm，这意味着间隔件高度等于或小于1μm。

术语“样品面积”是指样品在大致平行于板之间的空间并垂直于样品厚度的方向上的面积。

术语“样品厚度”是指垂直于彼此面对的板的表面的方向(例如，板之间的间距的方向)上的样品尺寸。

术语“板间距”是指两个板的内表面之间的距离。

crof中的术语“最终样品厚度的偏差”意指预定间隔件高度(由间隔件的制造确定)与最终样品厚度的平均值之间的差，其中在给定面积(例如，在1.6cm×1.6cm面积上方，25个不同点(间隔4mm)的平均值)上平均最终样品厚度。

crof处理中的术语“测量的最终样品厚度的均匀性”意指在给定样品区域上测量的最终样品厚度的标准偏差(例如，相对于平均值的标准偏差)。

crof处理中的术语“样品的相关体积”和“样品的相关面积”分别指crof处理中沉积在板上的部分或全部体积的样品的体积和面积，其与通过相应的方法或装置进行功能相关，其中功能包括但不限于减少分析物或实体的结合时间，检测分析物，定量体积，定量浓度，混合试剂或控制浓度(分析物、实体或试剂)。

除非另外具体说明，否则本发明中的术语“一些实施例”，“在一些实施例中”，“在本发明的一些实施例中”，“实施例”，“一个实施例”，“另一实施例”，“某些实施例”，“许多实施例”等是指应用于整个公开(整个发明)的实施例。

除非特别说明，否则在crof处理中物体的术语“高度”或“厚度”是指物体在垂直于板表面的方向上的尺寸。例如，间隔件高度是间隔件在垂直于板表面的方向上的尺寸，并且间隔件高度和间隔件厚度意味着相同的事情。

除非特别说明，否则在crof处理中物体的术语“区域”是指与板的表面平行的物体的区域。例如，间隔件区域是平行于板表面的间隔件区域。

除非特别说明，否则crof处理中的术语“横向”是指平行于板表面的方向。

除非特别说明，否则在crof处理中间隔件的术语“宽度”是指间隔件的横向尺寸。

术语“样品内部的间隔件”意指间隔件被样品包围(例如，样品内部的柱间隔件)。

在crof处理中板的术语“临界弯曲跨距”是指两个支撑件之间的板的跨距(即距离)，在该跨距下，对于给定的柔性板、样品和压缩力，板的弯曲等于所允许的弯曲。例如，对于给定的柔性板、样品和压缩力，如果允许的弯曲为50nm并且临界弯曲跨度为40μm，则间隔开的两个相邻间隔件40μm之间的板的弯曲将为50nm，并且如果两个相邻间隔件小于40μm，则弯曲将小于50nm。

用于样品的术语“可流动的”意指当样品的厚度减少时，横向尺寸增加。例如，粪便样品被认为是可流动的。

在本发明的一些实施例中，crof处理的样品不能流动以受益于该处理，只要经crof处理下可以减小样品厚度即可。例如，为了通过将染料放置在crof板的表面上来染色组织，crof处理可以减小组织厚度并且因此加速用于染料染色的饱和孵育时间。

“crof卡(或卡)”，“cof卡”，“qmax-card”，“q卡”，“crof装置”，“cof装置”，“qmax装置”，“crof板”，“cof板”和“qmax板”可互换，但在一些实施例中cof卡不包含间隔件；并且术语是指包含第一板和第二板的装置，第一板和第二板可相对于彼此移动成不同的构造(包括开放构造和闭合构造)，并且包含调节板之间的间隔的间隔件(cof的一些实施例除外)。术语“x板”是指crof卡中的两个板之一，其中间隔件固定到所述板。cof卡、crof卡和x板的更多描述在2017年2月7日提交的临时申请序列第62/456065号中进行描述，出于所有目的将该申请的全部内容并入本文。

本公开的进一步方面包括crof装置，crof装置包括多个捕获剂，每个捕获剂结合样品中的多个分析物，即多路复用crof装置。在这种情况下，含有多个捕获剂的crof装置可以被配置为检测不同类型的分析物(蛋白质、核酸、抗体、病原体等)。基于阵列内的位置、与不同分析物结合的可检测标记的发射波长或上述的组合，不同分析物可在阵列上彼此区分。

可通过本发明方法、装置和系统诊断或测量的健康状况包括，例如：化学平衡；营养保健；锻炼；疲劳；睡眠；应力；前驱糖尿病；过敏；老化；暴露于环境毒素，杀虫剂，除草剂，合成激素类似物；妊娠；女性更年期；男人更年期。

在某些实施例中，可以使用上述方法获得两种或更多种不同核酸样品中核酸的相对水平，并进行比较。在这些实施例中，通常将从上述方法获得的结果归一化为样品(例如，组成型rna)中核酸的总量，并进行比较。这可以通过比较比率或通过任何其他方式来完成。在特定实施例中，可以比较两个或更多个不同样品的核酸谱以识别与特定疾病或病症相关的核酸。

在一些实例中，不同样品可以由“实验”样品(即，目标样品)和“对照”样品组成，实验样品可以与“对照”样品比较。在许多实施例中，不同的样品是成对的细胞类型或其部分，一种细胞类型是目标细胞类型，例如异常细胞，另一种是对照细胞，例如正常细胞。如果比较细胞的两个部分，则所述部分通常是来自两个细胞中的每一个的相同部分。然而，在某些实施例中，可以比较相同细胞的两个部分。示例性细胞类型对包括，例如，从组织活检(例如，来自患有疾病的组织，例如结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、皮肤癌，或感染病原体等的组织)分离的细胞，以及来自相同组织，通常来自相同患者的正常细胞；在组织培养物中生长的细胞是永生的(例如，具有增殖突变或永生化转基因的细胞)，利用病原体感染的，或(利用环境或化学剂，例如，肽，激素、改变的温度、生长条件、物理应力、细胞转化)处理的；以及正常细胞(例如，除了它不是永生的、感染的或处理的以外与实验细胞相同的细胞，等等)；从患有癌症、疾病、老年哺乳动物或暴露于病症的哺乳动物分离的细胞，和来自相同物种，优选来自相同家族的健康或年轻的哺乳动物的细胞；以及来自同一哺乳动物的分化的细胞和未分化的细胞(例如，在哺乳动物中一个细胞是另一个的祖细胞，)。在一个实施例中，可以使用不同类型的细胞，神经元和非神经元细胞，或不同状态的细胞(例如，在对细胞进行刺激之前和之后)。在本发明的另一个实施例中，实验材料是易受病原体感染的细胞，所述病原体例如病毒，例如人免疫缺陷病毒(hiv感染)等，并且对照材料是抵抗病原体感染的细胞。在本发明的另一个实施例中，样品对由未分化的细胞，例如干细胞和分化的细胞代表。

在不使用间隔件的情况下对照和测量样品厚度

在本发明的一些实施例中，用于调节样品或样品的相关体积的间隔件由(a)能够测量板的内间距的定位传感器和(b)装置代替，所述装置能够基于传感器提供的信息控制板的位置并将板移动到期望的板内间距。在一些实施例中，所有间隔件由平移台、监测传感器和反馈系统代替。

使用光学方法测量间距和/或样品厚度。在一些实施例中，内表面之间的间距的测量(f)包括使用光学干涉。光干涉可以使用多个波长。例如，由于在第一板和第二板的内表面处反射的光的干涉而产生的光信号随光的波长振荡。根据振荡，可以确定内表面之间的间距。为增强干涉信号，内表面中的一者或两者可涂覆有光反射材料。

在一些实施例中，内表面之间的间距的测量(f)包括获取光学成像(例如，获取样品的2d(二维)或3d(三维)图像，并且获取的图像可以是具有不同视角、不同波长、不同相位和/或不同偏振的多次以及图像处理。

使用光学方法测量整个样品面积或体积。在一些实施例中，整个样品面积或体积的测量(f)包括获取光学成像(例如，获取样品的2d(二维)或3d(三维)图像，并且获取的图像可以是具有不同视角、不同波长、不同相位和/或不同偏振的多次以及图像处理。样品面积意指在大致平行于第一板和第二板的方向上的面积。csd成像可以采用条纹投影轮廓术(fpp)方法，fpp是获取物体三维图像最常用的方法之一。

测定速度。在一些实施例中，释放时间控制材料涂覆有板上的试剂或与其混合，其中释放时间控制材料延迟试剂释放至样品的时间。在一些实施例中，释放时间控制材料将干试剂释放到血液样品中的时间延迟至少3秒，例如至少5秒或至少10秒，或至少20秒，或至少60秒，或至少90秒，或在所述两者范围内的值。

在一些实施例中，装置被配置为在60秒或更短，90秒或更短，120秒或更短，240秒或更短，300秒或更短，或所述两者的范围内的值后分析样品。

在一些实施例中，在闭合构造下，最终样品厚度装置被配置为在60秒或更短时间内分析样品。

在一些实施例中，在闭合构造下，最终样品厚度装置被配置为试剂与样品的饱和时间在10秒或更短，30秒或更短，60秒或更短，90秒或更短，120秒或更短，240秒或更短，300秒或更短，或所述两者的范围内的值。

qmax卡的更多示例。根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中间隔件具有柱形形状和几乎均匀的横截面。

根据以上任一实施例所述的方法或装置，其中间隔件间距(sd)等于或小于约120μm(微米)。

根据以上任一实施例所述的方法或装置，其中间隔件间距(sd)等于或小于约100μm(微米)。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中间隔件间距(isd)的四次方除以柔性板的厚度(h)和杨氏模量(e)(isd⁴/(he))为5x10⁶um³/gpa或更小。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中间隔件间距(isd)的四次方除以柔性板的厚度(h)和杨氏模量(e)(isd⁴/(he))为5x10⁵um³/gpa或更小。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中间隔件具有柱状形状、基本上平坦的顶表面、预定的基本上均匀的高度，以及预定的恒定间隔件间距，间隔件间距比分析物的尺寸大至少约2倍，其中间隔件的杨氏模量乘以间隔件的填充因子等于或大于2mpa，其中填充因子是间隔件接触区域与总板区域的比率，并且其中对于每一间隔件，间隔件的横向尺寸与其高度的比率为至少1(一)。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中间隔件(例如，柱)是固定间隔的或非固定间隔的。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中间隔件具有柱状形状、基本上平坦的顶表面、预定的基本上均匀的高度，以及预定的恒定间隔件间距，间隔件间距比分析物的尺寸大至少约2倍，其中间隔件的杨氏模量乘以间隔件的填充因子等于或大于2mpa，其中填充因子是间隔件接触区域与总板区域的比率，且其中对于每一间隔件，间隔件的横向尺寸与其高度的比率为至少1(一)，其中间隔件间距(isd)的四次方除以柔性板的厚度(h)和杨氏模量(e)(isd⁴/(he))为5x10⁶μm³/gpa或更小。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中间隔件的间隔件间距与间隔件的平均宽度的比率为2或更大，并且间隔件的填充因子乘以间隔件的杨氏模量为2mpa或更大。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中分析物是蛋白质、肽、核酸、合成化合物或无机化合物。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中样品选自以下的生物样品：羊水，房水，玻璃体液，血液(例如，全血、分级分离的血液、血浆或血清)，母乳，脑脊髓液(csf)，耳垢(耳屎)，乳糜，食糜，内淋巴，外淋巴，粪便，呼吸，胃酸，胃液，淋巴液，粘液(包括鼻引流和痰)，心包液，腹膜液，胸膜液，脓液，风湿液，唾液，呼出的冷凝物，皮脂，精液，痰，汗液，滑液，泪液，呕吐物和尿液。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中间隔件具有柱的形状，并且柱的宽度与高度的比率等于或大于1。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中沉积在一个或两个板上的样品具有未知的体积。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中间隔件具有柱的形状，并且柱具有基本上均匀的横截面。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中样品用于检测、纯化和定量与某些疾病的阶段相关的化学化合物或生物分子。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中样品涉及感染性和寄生虫病、损伤、心血管疾病、癌症、精神障碍、神经精神障碍、肺部疾病、肾脏疾病，和其他和器质性疾病。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中样品涉及微生物的检测、纯化和定量。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中样品涉及来自环境(例如，食物、水、土壤)的病毒，真菌和细菌。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中样品涉及对食品安全或国家安全造成危害的化学化合物或生物样品(例如，有毒废物、炭疽热)的检测，定量。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中，样品与医学或生理监视器中的生命参数的量化相关。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中样品与葡萄糖、血液、氧水平、全血细胞计数相关。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中样品涉及检测和定量来自生物样品的特异性dna或rna。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中样品涉及用于基因组分析的染色体和线粒体中的dna中的遗传序列的测序和比较。

根据以上任一实施例所述的方法或装置，其中样品涉及例如在药物合成或纯化期间检测反应产物。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中样品是细胞、组织、体液和粪便。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中样品是人、兽、农业、食品、环境和药物测试领域中的样品。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中样品是选自毛发、指甲、耳屎、呼吸、结缔组织、肌肉组织、神经组织、上皮组织、软骨、癌性样品或骨的生物样品。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中间隔件间距在5μm到120μm的范围内。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中间隔件间距离在120μm至200μm的范围内。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中柔性板具有20μm到250μm范围内的厚度和0.1gpa到5gpa范围内的杨氏模量。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中对于柔性板，柔性板的厚度乘以柔性板的杨氏模量在60到750gpa-μm的范围内。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中均匀厚度样品层在至少1mm²的横向面积上是均匀的。

根据以上任一实施例所述的方法和装置，其中均匀厚度样品层在至少3mm²的横向面积上是均匀的。

在一些实施例中，通过成像来测量样品面积或体积包括(a)通过使用已知面积或体积的样品来校准图像比例(例如，成像器是智能手机，并且可以通过比较在同一手机上拍摄的已知尺寸的样品的图像来校准由手机拍摄的图像的尺寸)；(b)将图像与置于第一板和第二板上或其附近的刻度标记物(标尺)进行比较(本文将进一步讨论)，以及(c)它们的组合。

如本文所用，光可以包括可见光、紫外光、红外光和/或近红外光。光可以包括在20nm到20,000nm范围内的波长。

必须注意，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数指示对象，除非上下文另外明确指出，例如当使用词语“单个”时。例如，提到“分析物”包括单个分析物和多个分析物，提到“捕获剂”包括单个捕获剂和多个捕获剂，提到“检测剂”包括单个检测剂和多个检测剂，提到“试剂”包括单个试剂和多个试剂，提到“照相机”包括单个照相机和多个照相机。

如在此使用的，术语“适配”和“配置”意味着元件、组件或其他主题被设计和/或旨在执行给定功能。因此，术语“适配”和“配置”的使用不应被解读为意味着给定的元件、组件或其他主题简单地“能够”执行给定的功能。类似地，被陈述为被配置为执行特定功能的主题可以附加地或可选地描述为可操作以执行该功能。

如本文所用，当参考根据本公开的一个或多个组件、特征、细节、结构、实施例和/或方法使用时，短语“例如”，短语“作为示例”和/或简称为术语“示例”和“示例性”旨在传达所描述的组件、特征、细节、结构、实施例和/或方法是根据本公开的组件、特征、细节、结构、实施例和/或方法的说明性、非排他示例。因此，所描述的组件、特征、细节、结构、实施例和/或方法不旨在是限制性的，必需的或排他性/穷尽性的；以及其它组件、特征、细节、结构、实施例和/或方法，包括结构上和/或功能上类似和/或等效的组件、特征、细节、结构、实施例和/或方法，也在本公开的范围内。

如本文所用，关于多于一个实体的列表的短语“至少一个”和“一个或多个”是指实体列表中的任何一个或多个实体，并且不限于实体列表中具体列出的每个和每一实体中的至少一个。例如，“a和b中的至少一个”(或等效地，“a或b中的至少一个”，或等效地，“a和/或b中的至少一个”)可指单独的a、单独的b，或a和b的组合。

如这里所使用的，置于第一实体和第二实体之间的术语“和/或”是指(1)第一实体，(2)第二实体，以及(3)第一实体和第二实体中的一个。使用“和/或”列出的多个实体应当以相同的方式来解读，即如此结合的实体的“一个或多个”。除了由“和/或”子句具体标识的实体之外，可以任选地存在其他实体，无论其与具体标识的那些实体相关还是无关。因此，作为非限制性示例，在一些实施例中，当结合诸如“包含”之类的开放式语言使用时，对“a和/或b”的引用可仅指a(可选地包括除b之外的实体)；在某些实施例中，仅指b(可选地包括a以外的实体)；在又一些实施例中，指a和b两者(可选地包括另外的实体)。这些实体可以指元件、动作、结构、步骤、操作、值等。

如果任何专利、专利申请或其它参考文献通过引用并入本文并且(1)定义术语的方式与本公开的未并入部分或其他并入的参考文献不一致和/或(2)以其他方式与本公开的未并入部分或其他并入的参考文献不一致，应当以本公开的未并入部分为准，而所述术语或其中并入的公开应当仅以所述术语被首次定义和/或并入的公开内容最初出现的参考文献为准。

相信所附权利要求书特别指出涉及所公开发明之一的某些组合和子组合，并且是新颖的和非显而易见的。在特征、功能、元件和/或特性的其他组合和子组合中体现的发明可以通过修改本权利要求书或在本申请或相关申请中呈现新权利要求来要求保护。这样的修改的或新的权利要求，无论它们是针对不同的发明还是针对相同的发明，无论与原始权利要求的范围不同、更宽、更窄或相等，也被认为包括在本公开的发明主题内。