图像引导显微拉曼光谱分析的制作方法

图像引导显微拉曼光谱分析
1.相关申请的交叉引用
2.本申请要求2018年9月4日提交的且标题为“micro
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raman spectroscopy with simultaneous reflectance confocal microscopy monitoring using a single laser”的美国申请号62/726746的优先权，该美国申请为了所有目的特此通过引用被并入本文。为了美利坚合众国的目的，本申请根据《美国法典》第35编第119条要求2018年9月4日提交的且标题为“micro
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raman spectroscopy with simultaneous reflectance confocal microscopy monitoring using a single laser”的美国申请号62/726746的权益，该美国申请为了所有目的特此通过引用被并入本文。
3.领域
4.各种类型的癌症是死亡和健康不佳的主要原因。检测组织异常例如癌症和早期癌症的位置是在为受多种形式的癌症影响的患者改善结果时的重要步骤。以找到有效和高效的方式来识别异常组织为目的探索了范围广泛的技术。
5.用于描绘组织的特征的一种有前途的技术是拉曼光谱分析(raman spectroscopy)。拉曼光谱分析可用于通过将光指向组织来研究组织。一些光从组织非弹性地散射。与组织标本的非弹性相互作用可以使散射光具有相对于入射光的波长移动(拉曼频移)的波长。散射光的波长光谱(拉曼光谱)包含关于组织的性质的信息。拉曼峰一般很窄，且在许多情况下可归因于在分子中的特定化学键(或由官能团的振动主导的正常模式)的振动。因此，拉曼光谱为各种分子种类的存在提供“指纹”。拉曼光谱的分析可以提供关于组织的详细生化信息。拉曼光谱分析可以既用于分子种类的定性鉴定又用于定量测定。
6.一些拉曼光谱分析技术提供非常高的空间分辨率。例如，共焦拉曼光谱分析(crs)可以在高空间分辨率的情况下提供分子指纹信息。crs已广泛用在用于癌症检测、皮肤评估、细胞生物化学和其他应用的生命科学研究中。
7.拉曼散射光一般相对微弱。当单色光照在样本上时，几乎所有观察到的光都在没有能量(或波长)的变化的情况下被弹性地散射(瑞利散射)。只有散射光的非常小的部分(一般大约108中的1份)被非弹性地散射(拉曼散射)。由于这个原因，在特定点处获取组织的拉曼光谱通常相当慢。例如，获得拉曼光谱常常花费至少几秒。
8.与其他技术(例如磁共振成像(mri)、x射线成像、计算机断层(ct)扫描或摄影成像)不同，基于点的技术例如crs不能快速询问大体积的组织或大面积的组织表面。因为使用crs或其他基于点的技术来测量大面积的组织通常不是实际的，特别是对于体内应用，存在对识别哪些点要使用crs来询问的方式的需要。在待研究的组织在身体内部(例如在肺或其他器官内的通道中)时，情况尤其如此。
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68.所有这些参考文献特此通过引用被并入本文。
69.概述
70.本发明具有许多方面，这些方面包括：
71.·
用于光谱分析测量的图像引导瞄准的装置；
72.·
用于光谱分析测量的图像引导瞄准的方法；
73.·
用于并发的光学成像和poi拉曼光谱分析的装置；
74.·
用于并发的光学成像和poi拉曼光谱分析的方法；
75.·
用于并发的全视场(fov)光学成像和感兴趣区域(roi)拉曼光谱分析的装置；以及
76.·
用于并发的全fov成像和roi拉曼光谱分析的方法。
77.本发明的一个方面提供了允许在实时全视场(fov)rcm引导下在特定感兴趣点(poi)处获取共焦拉曼信号的一种新类型的集成共焦拉曼系统。该系统具有用于离体样本和体内组织测量的示例应用。该系统应用光隔离器以分离入射激光束并返回反射共焦光束。
78.本发明的另一方面提供了用于疾病的检测和诊断的设备和方法，其将rcm引导应用于患者的离体样本和/或体内组织测量的拉曼光谱分析。
79.本发明的另一方面提供了包含光学法拉第隔离器的设备，其被布置成将入射激光束的光与返回反射共焦光束的光分开。
80.本发明的另一方面提供了一种用于图像引导光谱分析的系统。该系统可以包括被布置成将第一光发射到延伸到物镜的第一光路中的第一光源。第一光路可以包括扫描仪和在扫描仪和物镜之间的光组合器。第一光路还可以包括包含法拉第旋转器的光隔离器。法拉第旋转器可以位于第一光源和扫描仪之间。光隔离器可以被配置为将正向传播的光传递到物镜，并将反向传播的光引导到光检测器。该系统还可以包括被布置成将第二光发射到延伸到物镜的第二光路中的第二光源。第二光路可以在光组合器处与第一光路合并。该系统还可以包括在第二光路中的波长选择器。波长选择器可以被布置成将对应于在拉曼频移之后的第二光的波长引导到光谱仪。
81.在一些实施例中，第一光和第二光在光组合器处具有正交偏振态。
82.在一些实施例中，光组合器包括偏振分束器。
83.在一些实施例中，光组合器包括偏振带通滤波器，该偏振带通滤波器具有在第二光的波长和对应于在拉曼频移之后的第二光的波长之间的截止波长。
84.在一些实施例中，第一光和第二光具有相同的波长。
85.在一些实施例中，第一光和第二光发源于单个激光器。该系统可以包括被布置成将来自该激光器的光束分成第一光和第二光的分束器。
86.在一些实施例中，分束器是偏振分束器。该系统还可以包括被安装成在激光器和分束器之间旋转的半波片。
87.在一些实施例中，波长选择器位于物镜和光组合器之间。
88.在一些实施例中，波长选择器位于第二光源和光组合器之间。
89.在一些实施例中，该系统包括被布置成将由波长选择器引导的拉曼频移光聚焦到光纤中的一个或更多个光学元件，该光纤被连接以将拉曼频移光传送到光谱仪。
90.在一些实施例中，该系统包括在第二光路中的转向光学器件。转向光学器件可以被配置成选择性地定位第二光在物镜的视场内由物镜聚焦于的点。
91.在一些实施例中，波长选择器在转向光学器件和第二光源之间。
92.在一些实施例中，该系统包括光纤束，该光纤束包括被布置成将由波长选择器引导的拉曼频移光传送到光谱仪的多根光纤。每根光纤可以对应于第二光在物镜的视场内由物镜聚焦于的点的位置。
93.在一些实施例中，波长选择器位于物镜和光组合器之间。
94.在一些实施例中，该系统包括控制单元，该控制单元被连接以控制扫描仪以扫描图案扫过第一光在成像区域上由物镜聚焦于的点，并被配置为处理光检测器的输出以生成图像并将图像显示在显示器上。
95.在一些实施例中，控制单元被配置为在所显示的图像中包括标记，该标记指示第二光由物镜聚焦于的在成像区域内的位置。
96.在一些实施例中，控制单元被配置为监控图像以得到指示物镜相对于样本的移动的变化。
97.在一些实施例中，控制单元被配置为调整第二光由物镜聚焦于的在成像区域内的位置以补偿任何检测到的移动。
98.在一些实施例中，控制单元被配置为响应于检测到物镜相对于样本的移动而生成警报信号。
99.在一些实施例中，控制单元被配置为以每秒至少1帧的帧速率生成图像。
100.在一些实施例中，该系统包括沿着第二光路的第二扫描仪，其中第二扫描仪能够用来以扫描图案扫描第二光由物镜聚焦到样本上的点，该扫描图案包括在感兴趣区域中的多个位置。
101.在一些实施例中，第二扫描仪能够用来连续地在多个位置中的不同位置之间扫描第二光聚焦于的点。
102.在一些实施例中，第二扫描仪在第二光源和光组合器之间。
103.在一些实施例中，第二扫描仪包括电子控制扫描仪。
104.在一些实施例中，第二扫描仪包括mems扫描仪、谐振扫描仪或一对振镜扫描仪(galvo scanner)。
105.本发明的另一方面提供了一种用于图像引导光谱分析的方法。该方法包括通过下列操作来对样本成像：将第一光发射到延伸到物镜的第一光路中，在第一光路中使第一光在正向方向上穿过光隔离器的法拉第旋转器到达扫描仪；以及操作扫描仪以扫描第一光在样本上的成像区域上由物镜聚焦于的点，沿着第一光路向后传递由样本反射的反射光以在反向方向上穿过法拉第旋转器，并在法拉第旋转器的输入偏振器处将反射光引导到光检测器。该方法还包括，当对样本成像时，通过下列步骤为样本上的点获得拉曼光谱：将第二光引导到延伸到物镜的第二光路中，第二光路在光组合器处与第一光路合并；在该点处由物镜将第二光聚焦到样本上；以及从该点收集拉曼散射光，并沿着第二光路将拉曼散射光引
导回到波长选择器，以及通过波长选择器将拉曼散射光引导到光谱仪以获得对应于样本上的该点的拉曼光谱。
106.在一些实施例中，该方法包括通过分离来自单个激光器的光束来生成第一光和第二光。
107.在一些实施例中，第一光相对于第二光是交叉偏振的。
108.在一些实施例中，该方法包括处理光检测器的输出以产生样本的成像区域的图像，并在图像上显示指示第二光被聚焦于的点的标记。
109.在一些实施例中，该方法包括监控图像以检测物镜相对于样本的运动。
110.在一些实施例中，该方法包括调整第二光被聚焦于的点的位置以补偿任何检测到的运动。
111.在一些实施例中，监控图像以检测物镜相对于样本的运动包括关联在不同时间获得的图像帧。
112.在一些实施例中，该方法包括响应于检测到物镜相对于样本的运动而生成警报信号。
113.在一些实施例中，当拉曼光谱的获取被发起时，监控图像以检测运动被发起。
114.在一些实施例中，该方法包括将由波长选择器引导的拉曼频移光聚焦到光纤中，该光纤被连接以将拉曼频移光传送到光谱仪。
115.在一些实施例中，该方法包括将第二光引导到在第二光路中的转向光学器件，并且通过转向光学器件选择性地定位第二光在物镜的视场内由物镜聚焦于的点。
116.在一些实施例中，该方法包括将与第二光在物镜的视场内由物镜聚焦于的点的每个位置对应的拉曼频移光聚焦到光纤束的不同光纤中，该光纤束包括被布置成将由波长选择器引导的拉曼频移光传送到光谱仪的多根光纤。
117.在一些实施例中，该方法包括在光组合器处使具有等同于第一光的偏振态的偏振态的光通过，并阻挡具有等同于第二光或拉曼频移光的偏振态的偏振态的光。
118.在一些实施例中，该方法包括在光组合器处阻挡具有比第一光的波长更长的波长的光。
119.在一些实施例中，该方法包括通过旋转被安装成在激光器和偏振分束器之间旋转的半波片来相对于第二光调整第一光的强度。
120.在一些实施例中，图像以每秒至少1帧的帧速率生成。
121.在一些实施例中，该方法包括在第二点处将第二光聚焦到样本上。该方法还可以包括从第二点收集拉曼散射光，并沿着第二光路将第二拉曼散射光引导回到波长选择器，并且通过波长选择器将第二拉曼散射光引导到光谱仪以获得对应于样本上的第二点的第二拉曼光谱。
122.在一些实施例中，该方法包括在样本的感兴趣区域上连续地扫描第二光被聚焦到样本上的点。
123.在一些实施例中，扫描第二光被聚焦于的点包括操作在第二光路中的电子控制扫描仪以根据感兴趣区域的扫描图案扫描第二光被聚焦于的点。
124.在一些实施例中，样本的感兴趣区域是线性或二维感兴趣区域。
125.在附图中示出和/或在下面的描述中描述另外的方面和示例实施例。本领域中的
技术人员将认识到，本发明的其他实施例是可能的，并且本发明的细节可以在多个方面中被修改，所有方面不偏离创造性概念。因此，附图、描述和示例被视为在本质上是说明性的而不是限制性的。
126.附图简述
127.附图示出了本发明的非限制性示例实施例。
128.图1是示出组合的crs和rcm系统的示例架构的示意图。
129.图1a示出了可用于为皮肤上的感兴趣点获得拉曼光谱的示例定位器。
130.图2是示出根据示例实施例的光学装置的示意图。
131.图3a、3b和3c是曲线图，示出了用于评估具有图2所示的结构的原型系统的分辨率的测试的结果。
132.图4a和4b是人的皮肤的区域的示例rcm图像。图4c是示出为在图4a和4b中指示的感兴趣点获得的拉曼光谱的曲线图。
133.图5是示出根据另一示例实施例的光学装置的示意图。
134.图6是示出根据另一示例实施例的光学装置的示意图。
135.图6a是示出可以代替偏振分束器被使用以将拉曼频移光与rcm光分离的偏振带通滤波器的示意图。
136.图6b示出了偏振带通滤波器的示例透射光谱。
137.图7是示出根据另一示例实施例的光学装置的示意图。
138.图7a和7b分别示出了在图7所示系统的光纤束的输入端和输出端中的光纤的示例配置。
139.详细描述
140.在整个下面的描述中，阐述了特定细节，以便提供对本发明的更彻底的理解。然而，本发明可以在没有这些细节的情况下被实践。在其它实例中，没有详细示出或描述公知的元件，以避免不必要地使本发明模糊。因此，说明书和附图在说明性的而不是限制性的意义上被考虑。
141.图1是被配置为利用图像引导来执行拉曼光谱分析的系统10的简化示意图。系统10包括光源12。在所示的实施例中，光源12包括用于拉曼光谱分析的光源12a和用于图像引导的光源12b。这些光源可以发射具有相同或不同特性的光。在一些实施例中，同一光源用于既为拉曼光谱分析又为图像引导(例如rcm)提供光。为两种成像模式提供一个光源有利地比提供单独的光源更简单并且潜在地更便宜。由于这个原因，使用单个光源的实施例可能在许多应用中是优选的。
142.光源12发射沿着为拉曼光谱分析配置的第一光路行进的光13a和沿着为成像配置的第二光路行进的光13b。第一光路和第二光路在光束组合器14处合并。
143.光13a是单色光。光源12可以包括发射光13a(或光13a和13b两者)的激光器。在第一光路中，光13a行进到组合器14并继续到波长选择器16(例如分色镜)，波长选择器16将光13a引导到物镜18中。光13a穿过物镜18以照亮受验者19。例如，受验者19可以包括体内组织或离体组织样本。
144.在样本中，一些光13a被非弹性地散射，且因此相对于光13a移动到更长的波长。一些波长移动的散射光13c穿过物镜18。光13c穿过波长选择器16到达光谱仪20。光谱仪20分
析光13c以检测拉曼峰(如果任何峰存在)。如在本文所提到的，拉曼峰的排列提供指示样本19的化学组成的“指纹”。因为组织病理中的变化可能伴随有化学变化，拉曼光谱是可应用于评估在样本19中的特定点处的组织的病理的工具。
145.有利地，在物镜18聚焦拉曼光13a的点处可以为样本19中的非常小的体积获得拉曼光谱。在一些实施例中，物镜18聚焦拉曼光13a的点的位置相对于物镜18是固定的。在这样的实施例中，可以通过改变物镜18相对于样本19的位置来移动所获取的拉曼光谱涉及的在样本19中的特定点。
146.系统10可以包括能够用来在二维或三维(例如xy或xyz)中移动物镜18以设置位置的定位器21(例如压电定位器)，拉曼光谱针对该位置被获取。在一些实施例中，系统10提供用于使物镜18在由物镜18实现的视场内将拉曼光13a聚焦于的点转向的机制。在这样的实施例中，可以通过改变物镜18相对于样本19的位置和/或使拉曼光13a的聚焦的点转向到在物镜18的视场中的不同位置来移动所获取的拉曼光谱涉及的在样本19中的特定点。
147.用于转向的机制可以包括电子控制扫描仪。扫描仪可以被电子地控制以扫描图案(例如光栅图案)扫描物镜18将拉曼光13a聚焦于的点，使得拉曼光13在视场内的感兴趣区域上被扫描。如本文描述的系统可以包括允许用户调整感兴趣区域的边界(例如，通过改变尺寸、长度、宽度、顶点的位置、形状、纵横比、旋转角度或定义感兴趣区域的边界的其他特征)的控件。如本文所讨论的，当视场被成像时，这样的调整可以实时地被执行。
148.成像光13b穿过光隔离器22到达2d扫描仪24，2d扫描仪24将光13b引导到光组合器14内。光13b由波长选择器16从光组合器14引导到物镜18中。光13b由物镜18聚焦到样本19上的点，该点由扫描仪24的设置确定。扫描仪24由控制单元25控制。控制单元25可以例如使扫描仪24在期望分辨率处执行光栅扫描，使得光13b由物镜18聚焦到的点扫出覆盖样本19的视场的图案。
149.一些光13b由样本19散射/反射回到物镜18中。该散射/反射光由波长选择器16引导回到光组合器14。光组合器14将散射/反射光返回到扫描仪24，扫描仪24朝着光源12b发送散射/反射光13b。
150.光隔离器22分离散射/反射光13b，并将散射/反射光13b引导到光检测器26。光隔离器22可以例如包括法拉第隔离器。光检测器26可以具有任何合适的设计。例如，光检测器26可以由雪崩光电二极管提供。
151.光检测器26产生指示散射/反射光13b的强度的输出信号27。信号27被提供到控制单元25。控制单元25生成视场的图像，该图像实时地显示在显示器29上。
152.显示器29包括指示所显示的视场中的位置的标记30，拉曼光13a在该位置处被聚焦到样本19上。用户可以观察显示器29上的视场，选择特定点(在该特定点处将需要进行拉曼测量)，并调整定位器21和/或拉曼光13a的转向系统(在图1中未示出)以使拉曼光13a被引导到样本19上的期望位置。在系统10被配置成为感兴趣区域(与点相对)获得拉曼光谱的情况下，标记30可以指示感兴趣区域的边界。
153.使用光隔离器以在去扫描之后分离返回的rcm信号的图1中所示的架构在理论上不对照明光13b或返回的rcm信号都引入损耗。许多其他配置在照明功率或共焦成像信号检测中的任一个或两个中引入损耗。
154.不同类型的定位器可用于不同的应用。例如，用于获取在患者的皮肤上的感兴趣
点的拉曼光谱的系统可以包括能够用来在相对于物镜18的横向方向上移动在测量下的目标皮肤的xy平移台。对于体内皮肤测量，可以首先将配备有盖玻片的皮肤窗口附着到皮肤表面。皮肤窗口可以磁性地耦合到xy平台。例如，皮肤窗口可以包括金属形状，例如用合适的粘合剂例如双面胶带附着到皮肤的环。这个结构可以抑制无意识的运动，且皮肤也可以在水平面中由平台拉伸/移动。
155.图1a示出了用于在人的手臂的皮肤上的感兴趣点处收集拉曼光谱的示例装置。在图1a中，定位器21包括致动器21a和xy平台21b，致动器21a可控制来在垂直(z)方向上移动物镜18。物镜18通过窗口23观看人的皮肤。
156.具有图1所示的一般架构的系统可以以多种方式实现。现在将描述这样的系统可以被实现的不同方式的示例。在示出这些示例的附图中，也在图1中示出的功能部件用在图1中使用的相同参考数字来指示。这样的功能部件可以在不同的特定实施例中采取不同的形式。
157.图2是描绘给crs提供实时rcm成像监控的系统10a的示意图。在这个示例中，用于crs和rcm两者的光由同一光源12提供。光源12可以例如包括发射光13的激光器。例如，光12可以包括发射在合适波长(例如785nm)处的光的连续波激光源。原型实施例使用从starbrightlaser ab(瑞典)可得到的starbright 785 xm
tm
激光器作为光源12。
158.图2示出了一种配置，其中：
159.·
来自单个激光器的光13可以通过使用偏振分束器来有效地被分离和再次合并以在相同的波长下执行rcm和crs；
160.·
偏振相关光隔离器22可以有效地将反向散射/反射的rcm信号与rcm照明光束分离。
161.来自光源12的光13在空间上被滤波和准直以提供均匀的光束13。在图2所示的实施例中，这通过用透镜36将来自光源12的光聚焦到空间滤波器35(例如针孔，例如10μm直径针孔)上并用透镜37准直由空间滤波器35在空间上滤波的光来实现。因而产生的光束13然后通过半波片38a被引导到分束器39内，分束器39将光13分成crs光13a和rcm光13b。可选的反射镜40折叠光的路径13。
162.在图2的实施例中，分束器39由偏振分束器立方体提供。作为结果，光13a和13b在偏振方面不同。可以通过旋转半波片38a来调整光束13a和13b的强度比。
163.用于rcm成像的光13b穿过光隔离器22。在原型实施例中，光隔离器22由法拉第隔离器(从thorlabs可得到的型号io
‑5‑
780
‑
hp)提供。在光隔离器22之后，光13b穿过第二半波片38b，并由扫描仪24扫描。扫描仪24可以例如包括检流计扫描仪、共振扫描仪或诸如此类。
164.扫描光束13b穿过光组合器14，在图2中，光组合器14由偏振分束器提供。透镜42a将光束13b聚集到光组合器24上，且透镜42b扩展由光组合器24输出的光。扩展的光由波长选择器16分程传递(relay)到物镜18的后孔。在原型实施例中，波长选择器16由二向色分束器(razoredge
tm
二向色分束器lpd02
‑
785ru
‑
25，semrock)提供。物镜18将光13b聚焦到样本19上。
165.在原型实施例中，物镜18由从olympus canada可得到的型号为lumpfln 60x/w、数值孔径＝1.0的物镜提供，并安装在压电致动器(从piezo system jena gmbh,jena可得到
的mipos 500)上。压电致动器能够用来改变物镜18在z方向上的聚焦位置。
166.半波片38b和光隔离器22组合地起作用以将背反射共焦信号与入射光13b分离。光隔离器22可以包括法拉第隔离器。法拉第隔离器包括位于输入偏振器和输出偏振器之间的法拉第旋转器。输入偏振器和输出偏振器具有未对准的偏振轴。例如，输入偏振器和输出偏振器的偏振轴可以彼此成45度角。例如，输入偏振器可以使水平地偏振的光通过，而输出偏振器可以使在45
°
角下偏振的光通过。法拉第旋转器可以将穿过它的光的偏振旋转45
°
。
167.在图2的实施例中，由分束器39发射的光13b可以是水平地偏振的。当该光穿过法拉第旋转器时，偏振方向旋转45
°
，且因此光13b由光隔离器22的输出偏振器透射。半波片38b将从光隔离器22发射的光13b的偏振旋转回到水平偏振。构成rcm信号的背反射光也是水平地偏振的。背反射光的偏振在它穿过半波片38b时旋转45
°
，并由法拉第旋转器旋转另一45
°
。背反射光不能穿过光隔离器22的输入偏振器，因为共焦信号现在是垂直地偏振的。背反射光在输入偏振器处从光隔离器22反射出去，并由透镜44聚焦到光检测器26上。
168.在原型实施例中，光检测器26由从新泽西州bridgewater的hamamatsu公司可得到的型号为c10508的雪崩光电二极管提供。透镜44具有f＝35mm的焦距。针孔45可以放置在光检测器26的前面以拒绝离焦信号。在原型实施例中，针孔45是15μm直径针孔。
169.在原型实施例中，rcm成像过程(控制扫描仪24以在样本19的聚焦区域上扫过光13b的聚焦的点，并处理光检测器26的输出以产生rcm图像)由定制的labview
tm
程序控制。成像速度为每秒一帧。
170.在图2的实施例中，用于感兴趣点(poi)crs测量的光13a与用于rcm成像的光13b交叉偏振。例如，光13a可以是垂直地偏振的。光13a通过反射镜40a和分束器39绕过扫描仪24，保持作为固定光束(stationary beam)，并在光组合器14处与扫描rcm成像光13b合并。在所示的实施例中，光组合器14在该实施例中由偏振分束器提供。透镜42c将光13a聚集到光组合器14上。
171.然后，光13a由波长选择器16分程传递到物镜18中。构成拉曼信号的光13c穿过波长选择器16，由透镜46收集，并被传递到光纤47用于传送到光谱仪20。在原型实施例中，透镜46具有f＝75mm的焦距。可以提供长通滤波器48以减少在传递到光谱仪20的期望拉曼光谱的波长范围之外的光的量。在原型实施例中，长通滤波器是从semrock可得到的razoredge lp01
‑
785ru
‑
25，且光纤47是50μm多模光纤。在原型实施例中，光纤47起检测针孔的作用。可选地，可以提供单独的针孔以拒绝离焦光。
172.在原型实施例中，光谱仪20是包括液氮冷却的、背照式深度耗尽ccd的定制光谱仪。原型光谱仪的结构在h.wang等人的sci.rep.,3(2013)中被详述。
173.通过经由垂直地扫描硅晶片测量crs和rcm通道的共配准来测试原型系统的性能。当物镜18横越样本表面垂直地移动时，来自crs和rcm的信号同时被记录。图3a示出了当物镜通过硅晶片扫描时作为垂直位置的函数的归一化rcm信号50b和crs信号50a(硅的520cm
‑1拉曼峰)。两个信号峰的垂直位置的差异是rcm和crs通道的分段能力的度量。两个峰的紧密重叠指示良好的共配准(在0.2μm内)。发现crs和rcm通道的垂直分辨率分别为4.4μm和1.4μm。如图3b和3c所示，通过穿过硅晶片的边缘扫描来确定crs和rcm的横向分辨率。最大信号的10％和90％的横向位置的差异是横向分辨率的度量。发现rcm和crs通道的横向分辨率分别为0.45μm和2.7μm。520cm
‑1硅拉曼在这里再次被用作crs信号。
174.原型被测试以确定用于rcm的光13b对在光检测器26处检测到的拉曼信号贡献有多大。对于这个实验，扫描仪24被控制以在具有200μm
×
200μm的尺寸的视场上扫描rcm光13b。光束13a和13b的光功率都被设置为相同的光功率。构成光13a和13b的光束被单独地阻挡。
175.在光束13b被阻挡的一秒曝光中，光谱仪20检测到55881个计数。在光束13a被阻挡的情况下，光谱仪20检测到仅101个计数。这表明由光13b导致的对检测到的拉曼光谱的贡献非常小。小贡献被预期，因为在拉曼测量期间光13a总是聚焦在poi上，而光13b在视场上被扫描。只有当光13b横越poi被扫描时，光13b才能对拉曼信号做出贡献。在光13a和13b具有相同波长的情况下，甚至由rcm光束生成的非常少量的信号将不使拉曼信号失真。
176.可以通过相对于光13b增加光13a的强度并观察在因而得到的rcm图像中的亮斑的位置来确定光13a相对于由光13b扫描的视场被聚焦于的poi的位置。亮斑的位置可以由十字线或其他标记30来标记，该标记30将与rcm图像叠加地实时地显示。标记30可用于将用于拉曼光谱分析的poi放置在样本19上的特定位置处，并确保poi在拉曼光谱的收集期间保持在样本19上的期望位置处。
177.原型系统用于检查人皮肤。图4a和4b分别示出了图4a的皮脂腺管和围绕皮脂腺管的皮肤区域的体内rcm图像。十字线指示共焦拉曼测量的poi。图4a中的poi在皮脂腺管内部。图4b中的poi在皮脂腺管的左侧上的皮肤表皮上。
178.图4c示出了分别对应于图4a和4b的共焦拉曼光谱51a和51b。为了说明目的，光谱在y轴上移动。
179.对于在图4a至4c中的测量，rcm通道和crs通道的激光器功率都被设置为25mw。共焦拉曼测量的积分时间为15秒。rcm通道的成像速度为每秒一帧。fov是200μm乘200μm。
180.拉曼光谱51a和51b都示出了在855、1002、1128、1445和1655cm
‑1处的主要拉曼带。拉曼光谱51a包括棕榈酸的特征拉曼峰52，其出现在1296cm
‑1的波数处。该实验证明了如本文所述的实时图像引导拉曼光谱分析将不同的组织彼此区分开的能力。
181.本领域中的技术人员将认识到可以应用于图2的系统10a的范围广泛的变型。例如，每个通道的分辨率取决于物镜18、聚焦透镜44、46、光纤47的直径和/或针孔45的尺寸的组合。这些部件的选择可以针对特定应用被修改。物镜18可以集成到适合于在实时rcm成像引导下进入不同身体部位用于体内共焦拉曼测量的类型的探针中。
182.图5示出了类似于图2的系统10a的系统10b，除了光学隔离由这样的法拉第隔离器提供以外，该法拉第隔离器由与偏振分束器14和39结合的法拉第旋转器组成，偏振分束器14和39分别充当法拉第隔离器的输出偏振器和输入偏振器。图5的配置比图2的配置稍微简单，但是可以提供相同的功能。
183.系统10a优于系统10b的一个优点是，使用具有与在系统10a中存在的其他偏振器分离的输入偏振器的光隔离器22提供了照明激光束13b的偏振的增强净化，而光隔离器22的输出偏振器提供了去偏振的非共焦的多散射光子的进一步抑制。
184.提供如本文所述的系统是可能的，其中用于crs的poi相对于用于rcm的视场可移动。在图6中示出了示例系统10c的示意图，系统10c类似于图2的系统10a，但是允许用于收集拉曼光谱的poi相对于rcm的视场移动。
185.使用相同的参考数字来指示具有与系统10、10a和10b的相应部分相同或相似的功
能的系统10c的部分。
186.系统10c不同于系统10a，因为光13a被分程传递到光组合器14所沿着的光路包括可调反射镜60。可以手动地和/或通过电子定位系统(未示出)来定位反射镜60。反射镜60可以在两个方向上可倾斜和/或可以包括一对反射镜，每一个反射镜都是可调整的，以移动用于聚焦光13和收集相对于rcm成像的视场在不同方向上的拉曼散射光的poi。
187.在系统10c中，在poi的位置处从样本19拉曼散射并由物镜18捕获的光13a通过光组合器14被引导回到反射镜60，该光组合器14在该实施例中是偏振分束器。如在系统10a中的，光13a和13b具有正交偏振。与系统10a不同，在系统10c中，检测到的拉曼信号是偏振相关的。拉曼信号由反射镜60去扫描，并传递到波长选择器16，波长选择器16通过透镜46和长通滤波器48将拉曼信号传递到光纤47。
188.系统10c使用单个激光源来允许在rcm的视场中的任意感兴趣点处的共焦拉曼测量。
189.系统10c包括可调四分之一波片62，该波片62可用于确定crs光束在rcm的视场中的聚焦位置。当四分之一波片62的光轴与rcm光13b的偏振对准时，四分之一波片62的存在不影响rcm成像。
190.为了可视化crs的poi的位置，四分之一波片62可以旋转45度。在该旋转配置中，四分之一波片62使入射在物镜18上的光13a和光13b都是圆偏振的。在这种情况下，所反射的rcm光束在穿过四分之一波片62之后再次变成垂直偏振的(垂直于入射光13b的偏振)。因此，大多数所反射的rcm信号将不在光检测器26处被检测到。以这种方式，crs光束13a在样本19上的焦点位置将被显示为在rcm的视场(暗背景)中的亮斑。为了改变用于拉曼成像的poi的位置，可以调整反射镜60的角位置。
191.由系统10c检测到的拉曼信号是偏振相关的。在没有四分之一波片62的情况下，只有垂直偏振拉曼信号被检测到。当四分之一波片62存在时，拉曼信号的偏振将首先由四分之一波片62移动，且在那之后垂直偏振分量将被检测到。可以安装四分之一波片62，使得它可以选择性地从光路中移除。
192.可以修改系统10c以允许从多个点收集crs和/或允许从线性或二维感兴趣区域(roi)收集积分crs信号。例如，反射镜60可以由mems扫描仪、谐振扫描仪、一对振镜扫描仪或另一种电子控制扫描仪提供，电子控制扫描仪被控制以在roi上扫描光13a被聚焦到样本19上的点和/或分步执行在多个离散poi处收集拉曼光谱。
193.系统10c可以被修改以使用光学系统，其中光隔离器22如在系统10b中那样被实现。
194.可以修改系统10c，以通过使用光组合器14的特殊设计的偏振带通滤波器以非偏振相关的方式来促进拉曼信号的检测。偏振带通滤波器14a(例如见图6a)应该使具有用于rcm的偏振态(例如水平偏振)的光13b在任一方向上通过，并且应该阻挡(反射)具有其他偏振态(特别是光13a的偏振态)的光13b的波长处的光以及已经拉曼频移的光(即光13c)。合适的偏振带通滤波器从美国罗切斯特的semrock可得到。
195.如图6b所示，滤波器14a的通带55可以被选择为包括光13b的波长，并且排除具有更长波长(例如在区域56中)的拉曼频移光的波长。
196.图6a示出了偏振带通滤波器14a。
197.使用如图6a所示的偏振带通滤波器14a可以通过不将所收集的拉曼信号限制到单个偏振状态来使拉曼信号收集效率加倍。在激光光源12的波长处，滤波器14a可以根据偏振来分离或合并光。在滤波器14a的通带55之外的拉曼信号都被反射，用于由光谱仪20进行的去扫描检测和最终检测。
198.图7示出了根据另一示例实施例的系统10d。使用相同的参考数字来指示系统10d的具有与系统10、10a、10b或10c的相应部件相同或相似的功能的部件。
199.系统10d类似于系统10c，除了它使用光纤束来将拉曼散射光传送到光谱仪20a并且它使用具有多个通道的光谱仪20a以外。系统10d可以在rcm成像的视场中的任意感兴趣点处执行共焦拉曼测量。拉曼信号的检测不是偏振相关的。
200.在系统10d中，光13a可以通过调整反射镜60来聚焦到样本19上的任意感兴趣点上。拉曼散射光13c穿过波长选择器16(由于具有与光13a不同的波长)，并通过透镜46聚焦到光纤束47a的端部49a上。
201.光纤束47a包括大量单独的光纤70(例如100或更多根光纤70)。在端部49a处，光纤70布置在二维阵列中(见图7a)。该阵列可以例如是圆形的、矩形的、正方形的或梯形的。样本19上的不同位置对应于光纤70中不同光纤70的位置。来自样本19上的一个位置的光可以聚焦到光纤70a上，而来自样本19上的不同位置的光可以聚焦到光纤70b上。
202.在光纤束47a的相对端49b处，光被传送到光谱仪20a，光纤70布置在一维阵列(例如一条线)中(见图7b)。因此，由任何光纤70收集的拉曼信号都将被传送到光谱仪20a的光检测器(例如ccd)的相应行。因为每根光纤70对应于在rcm图像的视场内的一个位置，可以将poi的位置关联到ccd行索引。这个关联可以提前被完成。当反射镜60将光13a引导到样本19上的不同位置时，因而得到的拉曼散射光通过光纤束47a的不同光纤70到达光谱仪20a。通过对应于poi的光纤70接收的光13c可以由光谱仪20a分析以产生poi的拉曼光谱。
203.系统10d的限制是空间分辨率被光纤70的数量和光谱仪20a的ccd的列数限制。
204.系统10d可以被修改以使用光学系统，其中光隔离器22如在系统10b中那样被实现。
205.在本文所述的任何实施例中，控制器可以处理实时rcm图像以检测所成像的样本相对于物镜18的运动。例如，可以通过执行在不同时间获得的帧之间的相关性来检测运动。在检测到运动时，控制器可以可选地生成指示运动已经被检测到的警报信号。在一些实施例中，响应于拉曼光谱的获取被发起，用于生成这样的信号的触发被“装备好(armed)”。例如，用户可以激活控件以为选定感兴趣点获取拉曼光谱。如果在拉曼光谱获取时期(其可以可选地是预定时间)期间检测到样本的运动，则生成警报信号。然后，用户可以重复拉曼光谱的获取。
206.在允许感兴趣点的自动控制的转向用于获取拉曼光谱的实施例中，如本文描述的系统可以自动确定物镜18相对于样本的运动的方向和幅度，并且可以使crs光自动转向以补偿运动。
207.在本文描述的任何实施例中，小心注意避免在光学元件中的表面反射可以帮助避免污染共焦成像信号。例如，光组合器14可以稍微倾斜以防止它的表面的反射进入在光检测器26前面的针孔。可能帮助获得良好结果的其他细节包括高质量抗反射涂层或偏振板分束器。
208.本领域中的技术人员将理解，有许多替代的方式来引导光。例如，可以通过使用反射元件(例如反射镜)、折射元件(例如棱镜)和/或光波导来引导光以遵循期望的路径。作为另一个示例，可以使用透镜、所成形的反射镜、菲涅耳元件或全息元件来聚焦光。作为另一个示例，单个光学元件可以由光学元件组代替，反之亦然。本领域中的技术人员将认识到，在附图中示出的特定实施例可以以诸如这些方式的方式改变，而不改变区分本技术的操作原理或整体架构。
209.可以看到，上述实施例每个提供用于成像(例如rcm成像)的光路和用于crs的光路。在不失一般性的情况下，这些光路可以分别被标识为“第一光路”和“第二光路”。成像光路和crs光路在光组合器处合并，该光组合器例如由分束器(例如偏振分束器)、其他合适光学元件的偏振带通滤波器或合并来自成像光路和crs光路的光的元件提供。每条光路将光从光源12带到物镜18。从光源到物镜的方向可以被称为“正向”方向。在任一光路中在正向方向上传播的光可以被称为“正向传播光”。在第一光路中在正向方向上通过或已经通过的光可以被称为“第一光”，以及在第二光路中在正向方向上通过或已经通过的光可以被称为第二光。在任一光路中从物镜到光源的方向可以被称为“反向”方向。第一光的源可以被称为“第一光源”，以及第二光的源可以被称为“第二光源”。第一光源和第二光源可以彼此相同或不同。例如，单个部件(例如激光器)可以既用作第一光源又用作第二光源。光可以通过拉曼散射与样本相互作用。拉曼散射可以通过拉曼频移来移动光的波长。经历拉曼散射的光可以被称为“拉曼散射光”。
210.术语的解释
211.除非上下文另有明确要求，否则在整个说明书和权利要求书中：
212.·“comprise(包括)”、“comprising(包括)”和诸如此类应在与排他的或无遗漏的意义相反的包含界限的意义上，也就是说，在“包括但不限于”的意义上被解释；
213.·“连接”、“耦合”或其任何变形意在指两个或更多个元件之间的要么直接要么间接的任何连接或耦合；在元件之间的耦合或连接可以是物理的、逻辑的或其组合；
214.·“在本文”、“上面”、“下面”和类似含义的词当用于描述本说明书时应指作为整体的这个说明书，而不是指本说明书的任何特定部分；
215.·“或”对于两个或更多个项目的列表涵盖该词的所有下列解释：在列表中的任何项目、在列表中的所有项目以及在列表中的项目的任何组合；
216.·
单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“这个(the)”也包括任何适当的复数形式的含义。
217.在本描述和任何所附权利要求中使用的指示方向的词例如“垂直”、“横向”、“水平”、“向上”、“向下”、“向前”、“向后”、“向内”、“向外”、“左”、“右”、“前”、“后”、“顶部”、“底部”、“在
…
下方”、“在
…
上方”、“在
…
之下”和诸如此类(在存在的情况下)取决于所描述和示出的装置的特定定向。本文描述的主题可以采取各种可选的定向。因此，这些方向性术语没有被严格地定义，且不应狭义地解释。
218.在本发明的任何实施例中使用的控制器可以使用专门设计的硬件、可配置的硬件、通过提供能够在数据处理器上执行的软件(其可以可选地包括“固件”)来配置的可编程数据处理器、被专门编程、配置或构造来执行如在本文详细解释的方法中的一个或更多个步骤的专用计算机或数据处理器和/或这些中的两个或更多个的组合来实现。专门设计的
硬件的示例是：逻辑电路、专用集成电路(“asic”)、大规模集成电路(“lsi”)、超大规模集成电路(“vlsi”)和诸如此类。可配置硬件的示例是：一个或更多个可编程逻辑器件，例如可编程阵列逻辑(“pal”)、可编程逻辑阵列(“pla”)和现场可编程门阵列(“fpga”)。可编程数据处理器的示例是：微处理器、数字信号处理器(“dsp”)、嵌入式处理器、图形处理器、数学协处理器、通用计算机、服务器计算机、云计算机、大型计算机、计算机工作站和诸如此类。例如，在设备的控制电路中的一个或更多个数据处理器可以通过执行在处理器可访问的程序存储器中的软件指令来实现如本文描述的方法。
219.处理可以是集中式的或分布式的。在处理是分布式的情况下，包括软件和/或数据的信息可以集中式地或分布式地被保存。这样的信息可以通过通信网络(例如局域网(lan)、广域网(wan)或因特网)、有线或无线数据链路、电磁信号或其他数据通信信道在不同的功能单元之间交换。
220.虽然过程或块以给定的顺序呈现，但是替代示例可以以不同的顺序执行具有步骤的例程或者采用具有块的系统，并且一些过程或块可以被删除、移动、添加、细分、组合和/或修改以提供替代或子组合。这些过程或块中的每一个可以以各种不同的方式实现。此外，虽然过程或块有时被示为连续地被执行，但是这些过程或块可以替代地并行地被执行，或者可以在不同的时间被执行。
221.此外，虽然元素有时被显示为顺序地被执行，但是它们可以替代地同时或者以不同的顺序被执行。因此，意图是下面的权利要求被解释为包括如在它们的预期范围内的所有这样的变型。
222.涉及计算机指令的本发明的一些方面也可以以程序产品的形式被提供。该程序产品可以包括携带一组计算机可读指令的任何非暂时性介质，指令当由数据处理器执行时使数据处理器执行本发明的方法。根据本发明的程序产品可以是多种形式中的任一个。该程序产品可以包括例如非暂时性介质，例如包括软盘、硬盘驱动器的磁性数据存储介质、包括cd rom、dvd的光学数据存储介质、包括rom、闪存ram、eprom的电子数据存储介质、硬连线或预编程芯片(例如eeprom半导体芯片)、纳米技术存储器或诸如此类。在程序产品上的计算机可读信号可以可选地被压缩或加密。
223.在一些实施例中，本发明的方面可以用软件实现。为了更加清楚，“软件”包括在处理器上执行的任何指令，并且可以包括(但不限于)固件、常驻软件、微码和诸如此类。如本领域中的技术人员已知的，处理硬件和软件都可以全部或部分地被集中或分布(或其组合)。例如，可以经由本地存储器、经由网络、经由在分布式计算环境中的浏览器或其他应用或者经由适合于上面所述目的的其他手段来访问软件和其他模块。
224.在部件(例如软件模块、处理器、组件、设备、电路等)指上述部件的场合，除非另有指示，对该部件的提及(包括对“装置”的提及)应被解释为包括执行所述部件的功能的任何部件(即，在功能上相当的部件)作为该部件的等同物，包括在结构上不等同于在本发明的所示示例性实施例中执行功能的所公开结构的部件。
225.为了说明的目的，在本文描述了系统、方法和装置的特定示例。这些仅仅是示例。本文提供的技术可以应用于除上述示例系统之外的系统。在本发明的实践中，许多改变、修改、添加、省略和置换是可能的。本发明包括对技术人员明显的所述实施例的变型，包括通过以下方式获得的变型：用等效的特征、元件和/或行动代替特征、元件和/或行动；来自不
同实施例的特征、元件和/或行动的混合和匹配；将来自如本文所述的实施例的特征、元件和/或行动与其他技术的特征、元件和/或行动组合；和/或从所描述的实施例省略组合特征、元件和/或行动。
226.各种特征在本文被描述为存在于“一些实施例”中。这样的特征不是强制性的，并且可以不存在于所有实施例中。本发明的实施例可以包括两个或更多个这样的特征的零个、任一个或任何组合。这在下面的意义上仅被限制到这样的特征中的某些特征与这样的特征中的其他特征不兼容的程度：本领域中的普通技术人员不可能构造组合这样的不兼容特征的实际实施例。因此，“一些实施例”拥有特征a以及“一些实施例”拥有特征b的描述应被解释为发明人也设想组合特征a和b的实施例(除非描述另有说明或者特征a和b从根本上是不兼容的)的明确指示。
227.因此，意图是下面的所附权利要求和此后引入的权利要求被解释为包括如可以合理地被推断出的所有这样的修改、置换、添加、省略和子组合。权利要求的范围不应被在示例中阐述的优选实施例限制，而是应被给予与作为整体的说明书一致的最广泛的解释。