自动聚焦样本成像设备和方法与流程
相关申请的交叉引用
本pct申请要求于2018年9月10日提交的美国临时专利申请号62/729,239的优先权，出于所有目的其全部内容通过引用并入本文。
本发明涉及在激光消融之后使用质谱成像(ims)对样本进行成像，以及通过成像质量细胞计数(imctm)对生物样本进行成像。
背景技术：
聚焦是许多测量技术中的重要参数。能够自动聚焦辐射的系统(自动聚焦系统)已用于生物物质的成像，并用于使激光辐射能够消融(ablate)样本的不同位置。
一组现有的自动聚焦系统利用孔径，辐射通过该孔径被引导到一个或多个透镜中，然后入射到样本上并反射回传感器。测试了孔径和样本的几个不同的相对位置，并选择了强度最大的位置作为最聚焦的位置。这种自动聚焦系统可能会因生物样本而失效。对于依赖于从样本中去除(例如通过激光消融)样本材料的系统而言，这是一个特别的问题，因为如果激光与自动聚焦系统共聚焦，则自动聚焦失败会危及数据质量和样本完整性。
本发明的目的是提供进一步的和改进的用于样本成像的设备和技术。
技术实现要素：
总体而言，本文公开的分析仪设备包含三个用于执行成像元素质量分析的广泛表征的系统。
该设备可以包括自动聚焦系统。自动聚焦系统可以包括照明源和自动聚焦传感器。该设备可以进一步包括采样系统、光学显微镜和可移动样本台中的一项或多项。采样系统和自动聚焦系统(以及任选地另外的光学显微镜)可以是共焦的。该设备可以包括另外的系统，如本文所述。
第一个是自动聚焦系统，将样本放置在样本室中的正确位置，以便通过采样和电离系统的激光器进行最佳采样。
第二个是采样和电离系统。该系统包含样本室，该样本室是在对样本进行分析时放置样本的组件。样本室包含载物台，载物台保持样本(通常将样本放在样本载体上，诸如显微镜载玻片(例如组织切片、单层细胞或单个细胞)，诸如细胞悬液已被滴到显微镜载玻片上，并将载玻片放置在载物台上)。采样和电离系统中的激光用于从样本室中的样本中去除材料(去除的材料在本文中称为样本材料)，然后将其转换成离子，或作为导致从样本中去除材料的过程的一部分，或通过采样系统下游的单独电离系统。为了产生元素离子，使用了硬电离技术。然后，通过作为检测器系统的第三个系统对电离的材料进行分析。检测器系统可以采用不同的形式，这取决于所确定的电离样本材料的特定特性，例如，基于质谱的分析仪设备中的质量检测器。
本发明通过在自动聚焦系统中包括的多个孔径(诸如以二维布置的多个孔径)的自动聚焦组件，提供了对当前的ims和imc设备和方法的改进。自动聚焦系统的照明源将辐射引导到要通过多个孔径被消融的样本上。由于使用多个孔径(即，多于一个孔径可用于聚焦分析)，在通过一个或多个孔径的照明辐射对样本的聚焦测量失败的情况下，则自动聚焦系统会提供冗余(例如，因为具有不同成分、不规则拓扑结构或空隙的组织，可能在某些位置无法反射照明辐射，使得可以通过单个孔径将其很好地检测出来以进行自动聚焦)，从而减少了不成功的自动聚焦尝试的次数。
因此，在操作中，将样本放入设备中，并且针对照明辐射的焦点与样本的给定相对位置，测量如何聚焦样本(例如，通过分配焦点分数)。然后改变照明辐射的焦点与样本的相对位置，并且针对一个或多个改变的位置进行焦点的测量。然后可以比较这些位置，并确定增加焦点的方向或位置。然后可以再次改变相对位置，并且可选地进行另外的测量。可以重复该过程以进一步提高焦点分数。一旦达到期望的焦点分数，就可以使用激光源对样本进行采样(例如，通过激光消融)以产生电离的材料(采样可以产生蒸气/特殊材料，随后由电离系统将其电离)，并且样本材料中的离子被传递到检测器系统中。尽管检测器系统可以检测许多离子，但其中大多数将是自然构成样本的原子的离子。在一些应用中，诸如在地质或考古应用中进行矿物分析，这可能就足够了。
在一些情况下，例如在分析生物样本时，样本的天然元素成分可能无法提供适当的信息。这是因为通常所有蛋白质和核酸都由相同的主要组成原子组成，因此尽管可以从不包含蛋白质或核酸物质的区域中分辨出包含蛋白质/核酸的区域，但是无法将特定蛋白质与所有其他蛋白质区分开。然而，通过在正常条件下用不存在于被分析材料中的原子或至少不大量存在的原子(例如某些过渡金属原子，诸如稀土金属；有关更多详细信息，请参见下面的标记部分)来标记样本，可以确定样本的特定特性。与ihc和fish一样，可检测的标记可以附着到样本上或样本中的特定靶标上(诸如载玻片上的固定细胞或组织样本)，特别是通过使用sbp(诸如抗体、核酸或凝集素)来靶向样本上或样本中的分子。为了检测电离的标记，使用了检测器系统，因为它将检测来自样本中自然存在的原子的离子。通过将检测到的信号链接到产生这些信号的样本采样的已知位置，可以产生存在于每个位置的原子的图像，包括天然元素组成和任何标记原子。在检测之前样本的天然元素组成被耗尽这方面，图像可能仅具有标记原子。该技术允许并行分析许多标记(也称为多路复用)，这在生物样本分析中具有很大优点。
本发明提供了一种自动聚焦组件，该自动聚焦组件包含多个孔径。
本发明还提供了一种用于聚焦在样本上的自动聚焦系统，该系统包含：
照明源，用于发射辐射以照亮样本；
本发明的自动聚焦组件，允许来自照明源的辐射穿过多个孔径；
物镜，设置在辐射的光路上，以将辐射聚焦在样本上；以及
自动聚焦传感器，布置成接收从样本反射的辐射，并布置成与自动聚焦组件共焦。
本发明还提供了一种用于分析生物样本的设备，设备包含：
自动聚焦系统，以及
采样和电离系统，用于从样本中去除材料并电离所述材料以形成元素离子，其中，采样和电离系统包含用于对样本进行采样的激光源；
其中，采样和电离系统的激光源的焦点与自动聚焦设备的自动聚焦组件和自动聚焦传感器共焦。
在一些实施例中，采样和电离系统包含采样系统和电离系统，其中，采样系统包含激光源和样本台，并且其中该电离系统适于接收由采样系统从样本中去除的材料，并且电离所述材料以形成元素离子。
本发明的各方面还提供了一种自动聚焦方法，方法包含：
确定样本的第一位置的焦点分数，
将样本移到第二位置，
确定第二位置的焦点分数，以及
将焦点分数进行相互比较，
其中确定焦点分数包含用来自照明源的辐射来照射样本，使照明辐射穿过包含多个孔径的自动聚焦组件，并检测从样本反射的照明辐射，并且其中移动样本是平行于将照明辐射引导到样本上的轴的移动(即，移动是在z轴上)。
本发明的各方面还提供了一种自动聚焦方法，方法包含：
确定样本的位置n的聚焦方向，
将样本沿聚焦方向移动到位置(n+1)，
其中确定聚焦方向包含用来自照明源的辐射照射样本，使照明辐射穿过包含多个孔径的自动聚焦组件，其中自动聚焦组件的至少两个孔径在照明辐射穿过自动聚焦组件的轴上偏移，并使用自动聚焦传感器检测从样本反射的照明辐射，以及
其中移动样本是平行于将照明辐射引导到样本上的轴的移动(即，移动是在z轴上)。
本发明的方面还提供了一种映射表面的拓扑的方法，该方法包含：执行自动聚焦的方法(例如，包含自动聚焦方法的方法)，在样本的平面内(即，在x和/或y轴上)移动样本至样本平面中的第二位置，并分别执行包含本发明的自动聚焦方法的方法，再次记录样本平面中的第二位置处的最佳聚焦位置。
本发明还提供了一种分析样本的方法，该方法包含：
执行本发明的方法以将样本放置在用于激光消融的激光的焦点处；
在样本台上于多个位置处对样本进行激光消融；以及
对羽状物(plumes)进行电离和质谱分析，从而检测羽状物中的原子，允许构建样本的图像，可选地，其中多个位置是多个已知位置。
附图说明
图1-现有技术自动聚焦系统中照明辐射路径的示意图，该系统包含单孔径自动聚焦组件，样本在该组件中处于完全聚焦状态。
图2-在包含单孔径自动聚焦组件的现有技术自动聚焦系统中，从照明源到离焦样本的光的照明辐射路径的示意图。
图3-在包含单孔径自动聚焦组件的现有技术自动聚焦系统中，从离焦样本到自动聚焦传感器的光的照明辐射路径的示意图。
图4-现有技术自动聚焦系统中的照明辐射路径的示意图，该系统包含本发明的多孔径自动聚焦组件，其中样本在该组件中处于完全聚焦状态。
图5-现有技术自动聚焦系统中的照明辐射路径的示意图，该系统包含本发明的具有偏移孔径的多孔径自动聚焦组件，其中样本在该组件中处于完全聚焦状态。
图6-在根据本发明的实施例的在自动聚焦系统的制造期间将自动聚焦组件与自动聚焦传感器置于共焦位置的过程的示意图。
图7-在本发明的设备的制造期间，该设备包含根据本发明实施例的自动聚焦系统和基于激光的采样和电离系统，将激光辐射的焦点与自动聚焦组件和自动聚焦传感器置于共焦位置的过程的示意图。
图8-来自本发明实施例的自动聚焦系统中的自动聚焦传感器的图像，该系统检测来自本发明的9孔径自动聚焦组件的反射照明辐射，该图像示出了在9个预期位置(即受关注区域)处检测到的反射辐射。
图9-来自本发明实施例的自动聚焦系统中的自动聚焦传感器的图像，该系统检测来自本发明的9孔径自动聚焦组件的反射照明辐射，该图像示出了在多个但并非全部预期位置(即受关注区域)处检测到的反射辐射。
图10-本发明实施例的混合自动聚焦组件的布置的图示。
图11-使用本发明实施例的样本拓扑映射方法产生的样本的z-轮廓曲线图。该曲线图以阴影表示，以图示最佳焦点处的z位置，每个阴影的数值范围位于图表的右侧。在此实例中，x或y坐标的增加对应于此z位置的增加。
图12-根据本发明的实施例的自动聚焦设置的示意图。使用了两个光源，它们的光被引导通过与物镜焦平面聚焦的小孔径。如果样本散焦，则相机将观察来自每个led的图像变得模糊以及根据样本上每个led的照明角度的偏移。
图13-上图：根据本发明的实施例，在+60μm的散焦距离处获取的led图像。对于每个led，两个图像类似地模糊并沿照明方向偏移。下图：计算的两个图像之间的相关函数。抛物线形的峰拟合给出了-512.08像素的峰位置，该峰位置对应于+60μm的焦点偏移。
具体实施方式
在操作中，辐射从照明源发出，穿过包含多个孔径的自动聚焦组件的孔径，并被引导向载物台上的样本。照明辐射被样本反射。反射的辐射被引导至与自动聚焦组件共焦的自动聚焦传感器。基于激光的采样和电离系统的激光(如果存在)也与自动聚焦组件和自动聚焦传感器共焦。可以在自动聚焦传感器上的多个位置处检测反射的辐射，每个位置都与辐射穿过的自动聚焦组件中的孔径相关。分析在传感器处检测到的反射辐射(例如，诸如通过评估与孔径相关的每个位置处的辐射强度——来自与所有孔径对应的位置的强度总和，来计算焦点分数)。然后改变照射辐射的焦点与样本的相对位置，并通过自动聚焦传感器对从样本反射的辐射进行焦点的进一步测量。然后可以重复该过程，第三次调节照明辐射的焦点与样本的相对位置，并测量第三焦点，依此类推。该循环可以迭代地重复，直到达到最大焦点为止。然后，可以通过包含激光(如果存在)的采样和电离系统对样本进行采样和电离，这是由于将样本定位在激光的焦点处(与自动聚焦传感器和自动聚焦的孔径对准)，从而具有最大的效果。因此，包含本发明的自动聚焦组件(该自动聚焦组件包含多个孔径)的各种类型的自动聚焦设备可以用于实施本公开，下面将详细讨论其中的许多。
基于质量检测的分析仪设备
本申请的自动聚焦系统和方法可以提供一个或多个益处，诸如不需要预处理、快速自动聚焦、自动聚焦的低成本解决方案、特征创建、产生聚焦图和/或改进的精度。在某些方面，自动聚焦系统和方法可以为基于激光消融的质谱法提供自动聚焦。自动聚焦系统和方法还可以提供用于引导基于激光消融的质谱法的光学显微镜(例如检查系统)的聚焦。样本可以是表面拓扑变化的生物组织。在某些方面，样本可以用质量标签化的sbp染色。与传统的荧光显微术不同，成像质量细胞计数无法同时在大视野范围内获取图像。而是，通过辐射(诸如激光消融)从样本中去除单独的斑点(例如，像素)，并将斑点递送至质谱仪。为了获得具有单细胞分辨率或更佳分辨率的图像，单独的斑点要小(例如，在微米的数量级内)。这样，将辐射精确地聚焦在样本上就很重要。样本(或支撑载玻片)的倾斜度变化、样本台控制的变化、系统漂移和/或样本拓扑结构的变化都可能导致焦点与样本表面之间的关系发生变化，对采样和采样一致性产生不利影响。
本申请的设备可以包括根据本文描述的任何实施例的自动聚焦系统。自动聚焦系统可以包括照明源和自动聚焦传感器。如本文进一步讨论的，该设备可以包括附加组件。
在某些方面，该设备还包括采样系统，诸如激光消融系统。采样系统和自动聚焦系统可以是共焦的。该设备可以进一步包括用于检查样本的光学显微镜，以便识别受关注区域。该设备可以进一步包括可移动样本台。
例如，自动聚焦系统的照明源可以是具有适当光束整形光学器件的激光二极管，或具有特定透镜系统和孔径或孔径组的明亮led。检测器可以是与用于检查相同的一台相机(自动聚焦光和照明光之间的区别可以通过led脉冲、光学滤波来实时实现，或通过在每行的开始或结尾处执行自动聚焦来非实时实现)，例如，沿预期的平移方向定向的线传感器或位置敏感型光电二极管。在某些方面，自动聚焦系统的照明源可以与光学显微镜共享。可替代地，自动聚焦系统的照明源可以与光学显微镜的照明源分立。
自动聚焦系统可以提供一种照明方案，其中条带或其他模式的光以一定角度入射到载玻片上，然后使用某些检测器(相机或其他位置敏感装置)检测载玻片表面上的模式光的xy位置。由于入射光和载玻片法线之间的角度，与某些校准的最佳聚焦位置相比，返回光的位移将线性依赖于散焦量，因此可以直接找到最佳聚焦位置(无需要完整扫描)。
自动聚焦系统
自动聚焦系统通常包含一系列组件，诸如包含多个孔径的自动聚焦组件、照明源和自动聚焦传感器。基于这些组件的布置，可以适当地包括各种光学组件。
本文描述的自动聚焦系统可以用于采用自动聚焦步骤的本文描述的本发明的方法中。因此，本发明提供了本发明的自动聚焦系统用于自动聚焦设备(例如，质谱成像仪的成像质量细胞仪)的用途。
该设备可以被配置为通过移动样本台和/或调节光学元件来提供自动聚焦(例如，自动聚焦校正)。在某些方面，该设备可以被配置为通过响应于来自自动聚焦组件的读出而移动样本台来提供自动聚焦。在某些方面，该设备未被配置用于通过调节光学器件进行自动聚焦，诸如当仅移动样本台的z位置时。这样，光学器件可能无法移动以提供聚焦。
该设备可以提供与样本无关的自动聚焦，例如，自动聚焦不取决于样本所提供的特征或对比。自动聚焦系统可以在样本运行期间提供自动聚焦，例如，当样本台已将样本放置在不同的x、y坐标上时。
在某些方面，自动聚焦系统提供快速自动聚焦(例如，快速自动聚焦校正)。例如，自动聚焦系统可以以100hz以上、200hz以上、500hz以上、1khz以上、2khz以上、5khz以上、或10khz以上的速度提供自动聚焦反馈。
在某些方面，自动聚焦可以被执行为闭环，诸如pid回路，其中自动聚焦向致动器提供即时调节。在某些方面，pid控制器连续计算误差值作为期望设定点和测量过程变量之间的差，并基于比例项、积分项和微分项应用校正。
在某些方面，可以在硬件级别执行自动聚焦，而无需在软件级别处理自动聚焦数据。基于硬件的自动聚焦可能会大大减少自动聚焦的周期时间。
可以通过调节光学器件(例如，光学元件之间的距离)，经由在z方向上调节焦点的定位器和/或在z方向上调节样本台，来执行自动聚焦校正。在某些方面，可以通过调节样本台的z位置来执行自动聚焦校正。
在某些方面，自动聚焦系统可以在x、y或x-y坐标上投影聚焦图(例如，可以创建在整个坐标范围内引导自动聚焦校正的聚焦图)。聚焦图可以在多个坐标上提供或用于提供对激光消融光学器件的焦点的调节，而无需在每个坐标上进行自动聚焦。在某些情况下，坐标可以是样本坐标(例如，跨组织样本的坐标)。样本台可以被移动以将样本定位在新坐标上。可替代地或附加地，可以通过一个或多个定位器在坐标上连续扫描激光。定位器可以是基于镜子的定位器(诸如检流计镜、多面扫描仪、mems镜、压电器件镜)或固态定位器(诸如aod或eod)。聚焦图(focusmap)可以提供跨(例如，在)多个坐标的最佳聚焦点(例如，在z方向上)，或可以提供对光学器件的调节，以从初始位置获得最佳聚焦。这样，聚焦图可以基于相对的(例如，起始)或目标的参考系。在某些方面，当沿着x、y平面中的焦点线扫描激光时，样本台可以在z方向上移动。
在某些方面，自动聚焦可以允许对与周围材料相比处于更高z位置的表面材料进行选择性采样或去除，从而获得平坦的样本表面以用于随后的询问。
该设备可以进一步被配置为在样本运行期间提供光学图像。例如，该设备可以包括提供样本的光学图像的图像传感器，诸如ccd或cmos。该设备可以包括光学显微镜(图像传感器是光学显微镜的一部分)，诸如明视野/宽视野显微镜或荧光显微镜。光学显微镜可用于检查样本，诸如以通过激光消融来识别样本的受关注区域。
自动聚焦系统可以包含至少一个孔径。撞击在孔径上的照明源(诸如来自led的照明源)可以提供从样本(或样本支撑物)反射到自动聚焦传感器上的特征。在某些方面，自动聚焦系统包含多个孔径，诸如以二维布置的三个以上孔径。
自动聚焦系统可以提供撞击在自动聚焦传感器上的多个特征(即，任何形状的斑点)。自动聚焦系统可以通过使用多个孔径、交替的照明源(诸如2个以上led或激光二极管)和/或衍射分束器来提供多个特征。
包含多个孔径的自动聚焦组件
本发明提供了一种自动聚焦组件，该自动聚焦组件包含多个孔径。孔径允许辐射穿过它们。通常，自动聚焦组件的材料另外不允许辐射穿过它。
现有的自动聚焦方法的特征在于对单个孔径的依赖，当穿过单个孔径的照明辐射被遮挡或以其他方式受到阻碍时(从而使来自孔径的照明辐射无法正确到达传感器)，这会导致徒劳的自动聚焦尝试。因此检测到错误的强度(或强度不存在)。例如，照明辐射被引导通过单个孔径到达在样本上的点可能不是反射性的，例如因为那里没有生物材料(由于准备过程或由于细胞涂片中将细胞随机分布到载玻片上而将空隙引入组织切片中时，可能会发生这种情况)。
通过提供多个孔径，自动聚焦组件将冗余引入自动聚焦系统中，使得照明辐射无法从样本反射可以通过从其余孔径中检测到的反射照明辐射来补偿。因此，自动聚焦系统变得更加鲁棒性，减少了失败的自动聚焦尝试所花费的时间，并提高了效率。通过在其他孔径失败的情况下提供可用的附加的孔径，孔径数量的增加提高了自动聚焦的鲁棒性。因此，在一些情况下，自动聚焦组件包括至少2个孔径，例如至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少16个或至少25个孔径。
在一些情况下，自动聚焦组件的孔径以规则形状布置。规则的形状可以有效覆盖样本区域。因此，在一些情况下，自动聚焦组件的孔径布置在规则多边形的顶点处，例如，三角形的3个顶点、正方形或矩形的4个顶点、五边形的5个顶点、六边形的6个顶点、七边形的7个顶点、八边形的8个顶点、九边形的9个顶点或十边形的10个顶点。
在自动聚焦组件的孔径以规则形状布置的一些情况下，可以将规则形状的顶点布置成与多边形的质心相距恒定的距离。具有较短的此类距离的多边形在样本的较小区域上会产生更大的冗余。相反，如下所述，具有较大距离的多边形使得能够在样本的更宽区域上和/或更快速地进行拓扑分析。在一些情况下，从多边形的质心到每个顶点的距离小于10μm、15μm、20μm、25μm、50μm、75μm、100μm、150μm、200μm、250μm、500μm、750μm或1mm。在某些情况下，从多边形的质心到每个顶点的距离大于10μm、15μm、20μm、25μm、50μm、75μm、100μm、150μm、200μm、250μm、500μm、750μm或1mm。
在自动聚焦组件的孔径以规则形状布置的优选情况下，该组件除了上述顶点孔径之外还可以包含其他孔径。在一种此类情况下，在多边形的质心处存在另一个孔径。该质心孔径通常被布置成将照明辐射传输到样本上将发生样本消融的点，例如通过本文所述的激光消融采样系统。因此，在多个孔径(减去质心孔径)允许测量围绕采样位置的焦点的情况下，质心孔径通过来自消融的精确点读数而有助于焦点计算。在另一种此类情况中，组件在由顶点孔径限定的多边形的侧边的中点处包含另外的孔径。这些外围孔径通过提供可用于计算焦点的其他位置，增强了样本区域的有效覆盖范围。
在其他情况下，孔径被布置在规则的网格中。规则的网格可以提供相同的样本区域有效覆盖范围，但对于某些样本形状和/或拓扑可能更优选。在一些情况下，孔径位于规则间隔的网格中，诸如2×2网格、3×3网格、4×4网格、5×5网格、6×6网格、7×7网格、8×8网格、9×9网格、10×10网格或超过10×10的网格。
在自动聚焦组件的孔径被布置在规则网格中的情况下，相邻的网格孔径可以从孔径的中心点散开一定的孔径间距离。具有较短的此类距离的网格在样本的较小区域上会产生更大的冗余度。相反，具有较大距离的网格使得能够在样本的更宽区域上和/或更快速地进行拓扑分析，如下文更详细地讨论的。在一些情况下，从孔径的中心点测量的相邻网格孔径之间的孔径间距离为10μm、15μm、20μm、25μm、50μm、75μm、100μm、150μm、200μm、250μm、500μm、750μm或1mm。在一些情况下，孔径是多边形的，诸如三角形或正方形。
在一些情况下，选择孔径的形状以使焦点分数测量的鲁棒性最大化。在一些情况下，这些孔径是圆形的，并且直径等于或小于1μm、2.5μm、5μm、7.5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、50μm、75μm或100μm。在一些情况下，孔径是圆形的，并且直径等于或大于1μm、2.5μm、5μm、7.5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、50μm、75μm或100μm。
为了在本文所述的一些方法中应用，这些方法涉及基于通过单个焦平面中的多个孔径聚焦的照明辐射的收集来计算最佳聚焦位置，需要具有这种孔径布置的自动聚焦组件。因此，在一些实施例中，自动聚焦组件是平面的(使得所有孔径都在同一焦平面中)。
在一些实施例中，自动聚焦组件包含在照明辐射的轴上相对于彼此偏移的孔径。也就是说，自动聚焦组件包含一个或更多个台阶，或者进一步而言，包含两个以上孔径平面。参见例如图5中的特征502。在一些实施例中，自动聚焦组件包含两个孔径平面。在一些实施例中，自动聚焦组件包含三个孔径平面。在一些实施例中，自动聚焦组件包含四个以上孔径平面。在一些实施例中，每个孔径平面包含多于一个的孔径，例如，每个孔径平面三个孔径。在一些实例中，包含两个孔径平面，这些平面将在与检测器共焦的平面的任一侧均等地偏移。因此，在使用中，当孔径的两个平面均等地散焦时，此自动聚焦组件将指示完美的聚焦。当一个级别的孔径比另一个级别的孔径散焦更大时，将指示聚焦平面从样本出发的方向。在具有三个孔径平面的实施例中，一个孔径平面可以与自动聚焦检测器共焦，并且另外两个平面将在与检测器共焦的孔径平面的任一侧均等地偏移。因此，在使用中，当第一个孔径平面聚焦时，此自动聚焦组件将指示完美的聚焦，并且另外两个孔径平面两者均等地散焦。
在一些实施例中，自动聚焦组件用作照明源的混合掩模。此类混合自动聚焦组件包含不透明区域，该不透明区域阻挡照明辐射，在该不透明区域中定位有多个孔径，但是另外包含允许照明辐射透射到样本上的区域(通过使用辐射透明材料或通过在自动聚焦组件中简单地留下较大的空隙)。区域的大小与自动聚焦组件中的孔径不同。因此，通过使用此类自动聚焦组件，可以根据本文的描述进行自动聚焦，但是同时允许将照明辐射照射到样本上，从而可以通过自动聚焦传感器(当它是相机或具有类似功能的装置时)对样本进行可视检查。在一些实施例中，混合自动聚焦组件的孔径在照明辐射的轴上相对于彼此偏移。因此，在一些实施例中，混合自动聚焦组件包含偏移孔径，诸如孔径的偏移平面，如前段中的任何实施例中所述。使用此类混合自动聚焦组件可实现“实时”自动聚焦——即，当样本沿垂直于光轴的方向移动时可保持最佳聚焦(即，在消融样本期间，用于“实时”自动聚焦)。这种自动聚焦组件和方法将允许消融、样本观察和聚焦跟踪同时进行。
本发明提供了如上所述的自动聚焦组件在本文所述的方法中的使用(例如，在第25页的“用于自动聚焦的方法”和第29页的“样本拓扑映射方法”部分中，包括在那些部分中讨论的每个具体实施例)。
照明源
如本文所述的自动聚焦系统包括照明源。照明源可以包括至少一个led或激光二极管，但是可以包括两个以上led、两个以上激光二极管、或led和激光二极管的组合。在某些方面，两个以上led或激光二极管提供了撞击到自动聚焦传感器上的不同特征。当使用led时，位于led和样本之间的孔径可以提供特征。在某些方面，该设备可能不需要在自动聚焦和检查孔径之间切换。
在某些方面，两个led或激光二极管可以提供交替照明。可以配置自动聚焦系统，使得当系统(例如，激光消融系统)聚焦时，由交替的照明产生的特征重叠。交替的激光二极管辐射可能比交替的led辐射更快。此外，与通过孔径的led辐射相比，激光二极管可以提供更亮和/或更小的特征。然而，激光二极管的成本可能高于led。
在某些方面，照明源可以是彩色多路复用的照明源。照明源可以包括可编程led阵列。例如，由两种颜色的led照明产生的图像的过渡转变可用于动态聚焦校正。jiangshaowei等人“rapidandrobustwholeslideimagingbasedonled-arrayilluminationandcolor-multiplexedsingle-shotautofocusing”arxiv:1905.03371(2019)在整个载玻片成像的上下文中讨论了彩色多路复用自动聚焦。
在某些方面，一个或多个照明源以相对于样本法线的非零角度提供照明。假设非零角度的照明可以来自被引导通过孔径的一个或多个激光二极管和/或led。照明提供的特征可能从样本和/或样本支撑物反射并撞击到自动聚焦传感器上。
在某些方面，自动聚焦系统可以包括多个孔径，并且可以可选地仅包括一个光源，诸如led。该系统可以被配置为使得行进通过多个孔径的照明提供入射在自动聚焦传感器上的多个特征(例如，在从样本或样本支撑物反射之后)。
照明源发出的辐射被引导通过自动聚焦组件的多个孔径，然后继续朝向样本。
在某些情况下，照明源是发光二极管(led)。此类照明源可以从例如olympus(日本)、euromex(荷兰)商购获得。
在某些情况下，照明源是散热器或白炽灯，例如白炽卤钨灯泡。该灯可以包含封闭的玻璃灯泡，该玻璃灯泡填充有惰性气体并且包含由dc电流激励的钨丝灯丝，该灯泡可以设有包含一层或多层散热器的壳体，以帮助散发多余的热量。此类照明源可以从例如cairnresearch(英国)商购获得。
在某些情况下，照明源是弧光灯。实例包括金属卤化物、汞蒸气、氙气和锆弧灯。此类照明源可以从例如worldprecisioninstruments(英国)商购获得。
在某些情况下，激光源被用作照明源，例如氩离子激光器或氪激光器。此类照明源可以从例如laser2000(英国)商购获得。
自动聚焦传感器
其中，自动聚焦传感器包含至少一个图像传感器(诸如ccd或cmos)、线传感器、位置敏感光电二极管、相邻光电二极管和分离式光电二极管(诸如正交光电二极管)。在某些方面，自动聚焦传感器是图像传感器，并且可以与检查系统(例如，诸如光学显微镜)共享。
在某些方面，自动聚焦传感器是线传感器。当系统包括光学显微镜时，光学显微镜具有与自动聚焦传感器分开的传感器。包括线传感器的自动聚焦系统可以进一步包括柱面透镜。
当在提供特征的两个以上光源之间交替时，自动聚焦可以包括校正(例如，通过调节样本台的z位置)，直到特征在检测器上重叠。这样，可以使用ccd、cmos或线扫描检测器来检查特征的重合性。通常，检测形式在最佳焦点处可能与x、y坐标无关，并且可能不包括检测器，诸如正交光电二极管。
在某些方面，照明源可以是彩色多路复用照明源。照明源可以包括可编程led阵列。例如，由两种颜色的led照明产生的图像的过渡转移可用于动态聚焦校正。jiangshaowei等人“rapidandrobustwholeslideimagingbasedonled-arrayilluminationandcolor-multiplexedsingle-shotautofocusing”arxiv:1905.03371(2019)在整个载玻片成像的上下文中讨论了彩色多路复用自动聚焦。
在某些方面，一个或多个照明源以相对于样本法线的非零角度提供照明。假设非零角度的照明可以来自被引导通过孔径的一个或多个激光二极管和/或led。照明提供的特征可能从样本和/或样本支撑物反射并撞击到自动聚焦传感器上。可以对系统进行预先校准，使得撞击到自动聚焦传感器上特定坐标的特征表明系统处于聚焦状态。然后，自动聚焦可以包括调节焦点(例如，通过移动光学部件和/或调节可移动载物台)，检查特征在自动聚焦传感器上的入射，以及重复直到特征在预定坐标的公差内。在此类情况下，自动聚焦传感器可以是ccd、cmos、线阵列或分离式光电二极管。
在某些方面，自动聚焦系统可以包括多个孔径，并且可以可选地仅包括一个光源，诸如led。在此类情况下，自动聚焦传感器可以是图像传感器，诸如ccd或cmos。该系统可以被配置为使得行进通过多个孔径的照明提供入射在自动聚焦传感器上的多个特征(例如，在从样本或样本支撑物反射之后)。这些特征的存在可以用于确定系统是否处于聚焦状态，和/或确定用于使系统聚焦的校正。特征的存在可以指检测特征的能力、特征的聚焦(例如，检测到特征的区域和/或该区域上的强度分布)、特征的强度、和/或特征的强度的一致性。基于此类系统的自动聚焦校正可以是迭代的。
由自动聚焦传感器提供的数据可以由asic、fpga或在软件级别进行处理，并用于执行自动聚焦校正(例如，通过定位光学器件和/或移动样本台)。
自动聚焦传感器检测从样本反射的辐射，该辐射用于测量焦点分数。自动聚焦传感器可以是相机，例如基于电荷耦合器件图像传感器(ccd)的相机、基于有源像素传感器(aps)的相机或自动聚焦系统中的任何其他辐射检测装置。
在一些实施例中，传感器是(或基于)ccd。ccd是一种用于检测光并将光转换为可用于产生图像的数字信息的装置。ccd包含含有光敏像素阵列的硅芯片。在曝光期间，每个像素都产生与入射到像素上的光强度成比例的电荷。在曝光后，控制电路将产生一系列电荷转移，以产生一系列电压。然后可以分析这些电压以产生图像。合适的ccd可从例如细胞生物科学公司(cellbiosciences)获得。在一些实施例中，传感器是有源像素传感器(aps)。aps是一种图像传感器，由包含像素传感器阵列的集成电路组成，每个像素均包含光电检测器和有源放大器，例如cmos传感器。合适的aps可以从例如安森美半导体(onsemiconductor)获得。
在一些实施例中，传感器是光电检测器。光电检测器可以用于在通过元素质谱仪成像之前对样本成像和/或识别受关注特征/区域。光电倍增管可以从例如thorlabs获得。
在一些实施例中，传感器是光电倍增管。光电倍增管包含真空室，该真空室包含一个光电阴极、几个倍增电极和一个阳极。由于光电效应，入射在光电阴极上的光子使光电阴极发射电子。由于二次发射的过程，电子被倍增电极倍增以产生倍增的电子电流，然后阳极检测到倍增的电子电流，从而提供了检测入射在光电阴极上的电磁辐射的措施。光电倍增管可以从例如thorlabs获得。
相机的使用提供了以下优点：自动聚焦传感器可以用于记录样本的图像，并且因此可以用作以下关于本发明的设备的各种采样和电离系统组件所讨论的相机。
其他组件
自动聚焦系统还可包含物镜。物镜将照明辐射聚焦(例如25x缩倍)到样本上。在本发明的包含基于激光的采样系统的设备中，可以通过同一物镜将来自采样系统的激光的辐射聚焦到样本上。
自动聚焦系统还可以包含管透镜(tubelenses)。在一些实施例中，可以将管透镜放置在自动聚焦组件与样本之间的照明辐射的路径中，诸如在自动聚焦组件与一个或多个分束器组件之间。如此放置的透镜可以使照明辐射在其穿过自动聚焦组件的孔径之后准直。在一些实施例中，可以将管透镜放置在样本与自动聚焦传感器之间的照明辐射的路径中，诸如在一个或多个分束器组件与自动聚焦传感器之间。如此放置的透镜可以使从样本反射的照明辐射聚焦到自动聚焦传感器上。
自动聚焦系统可以包含一个或多个分束器，其以指定的比率将入射辐射分成两个分开的光束，布置成将来自照明源的辐射引导到样本上并将从样本反射的照明辐射引导到自动聚焦传感器。分束器通常采用以下两种形式中的一种：平板分束器(薄的平板玻璃板，已在基板的第一表面上进行了涂层)和立方体分束器(使用两个典型的直角棱镜构造)。分束器可广泛地例如从rp-photonics、thorlabs和edmund光学公司商用获得。
自动聚焦系统可以包括样本台，该样本台在系统的操作中支撑样本(通常，样本在样本载体上)。样本台可以是可移动的。在一些实施例中，载物台可以在x、y和z轴上移动。当自动聚焦系统所在的设备还包含采样和电离系统时，自动聚焦系统的样本台也是采样和电离系统的样本台，如下所述(例如，其中样本台在样本室内)。
自动聚焦系统还可以包含控制器模块。控制器模块控制并协调自动聚焦系统各组件的力矩。在一些实施例中。控制器模块从自动聚焦传感器接收输入，并基于接收到的输入在自动聚焦过程中控制样本台的位置。控制器模块可以包含可编程存储器，用指令对该可编程存储器进行编程，该指令用于执行如本文所述的本发明的自动聚焦方法，包括在那些部分中讨论的每个具体实施例。例如，在一些实施例中，控制器模块包含用于执行提供自动聚焦方法的指令，该方法包含：
确定样本的第一位置的焦点分数，
将样本移到第二位置，
确定第二位置的焦点分数，以及
将焦点分数进行相互比较，
其中确定焦点分数的步骤包含用来自照明源的辐射照射样本，该照明辐射穿过包含多个孔径的自动聚焦组件，并用自动聚焦传感器检测从样本反射的照明辐射(诸如其中检测从样本反射的照明辐射包含检测自动聚焦传感器上已知位置(也称为受关注区域)处的辐射，以及
其中移动样本是平行于将照明辐射引导到样本上的轴的移动(即，移动是在z轴上的)。
在一些实施例中，控制器模块包含用于执行提供自动聚焦方法的指令，该方法包括：
确定样本的位置n的聚焦方向，
将样本沿聚焦方向移动到位置(n+1)，
其中确定聚焦方向包含用来自照明源的辐射来照射样本，该照明辐射穿过包含多个孔径的自动聚焦组件，其中自动聚焦组件的至少两个孔径沿照明辐射穿过自动聚焦组件的轴偏移，并用自动聚焦传感器检测从样本反射的照明辐射(诸如其中检测从样本反射的照明辐射包含检测自动聚焦传感器上已知位置(也称为受关注区域)处的辐射)，以及
其中移动样本是平行于将照明辐射引导到样本上的轴的移动(即，移动是在z轴上的)。
在一些实施例中，控制器模块包含指令，该指令用于执行以提供一种映射样本表面的拓扑的方法，该方法包含：
执行自动聚焦方法，
将样本在样本的平面内(即在x和/或y轴上)移动到样本平面内的第二位置，以及
执行本发明的自动聚焦方法，再次在样本平面中的第二位置处记录最佳聚焦位置，诸如其中自动聚焦方法是在控制器模块中编程的如前段所述的自动聚焦方法。
在一些实施例中，可编程存储器是硬盘驱动器、光盘、cd-rom、dvd-rom、rom、ram、eprom、eeprom、磁卡或光卡、固态存储设备或适用于存储电子指令的其他类型的介质/计算机可读介质。
在一些实施例中，用于la-icp-ms的自动聚焦设备可以包括该设备不需要在自动聚焦和检查孔径之间切换，并且可以进一步包括一个或多个可移动样本台、用于检查样本的光学显微镜、激光消融采样系统、将激光消融采样系统耦合到icp电离系统的气体导管、和/或质谱仪(例如飞行时间或磁扇质谱仪)。质谱仪可以被配置为同时检测质量标签(诸如质量标签的镧系元素)。自动聚焦系统可以提供撞击在自动聚焦传感器上的多个斑点。采样系统和自动聚焦系统可以是共焦的。该系统可以被配置为在样本运行期间通过基于多个照明点调节样本台的位置来提供自动聚焦。
组件的布置
参考图1(是自动聚焦组件(102)中仅包含一个孔径的现有技术系统)，照明源(101)发射照明辐射，该照明辐射透射通过自动聚焦组件(102)中的孔径。然后，该照明辐射被管透镜(103)准直，并被分束器(104)引导到样本上。照明辐射通过物镜(105)聚焦在样本(106)上，通常为25x缩倍。从聚焦样本(106)反射回来的照明辐射沿着光路返回，然后穿过物镜(105)返回，并穿过分束器(104)朝向自动聚焦传感器(107)。在撞击到自动聚焦传感器上之前，反射的照明辐射穿过管透镜(108)。在这种布置中，自动聚焦组件和自动聚焦检测器是共焦的，使得当样本也在焦平面中时，从样本反射的照明辐射在检测器处显示为清晰的斑点。
当它们不共焦时，将不会检测到清晰的斑点。参考图2，照明源(201)发射照明辐射，该照明辐射透射通过自动聚焦组件(202)中的孔径。然后，该照明辐射被管透镜(203)准直，并被分束器(204)引导到样本上。照明辐射通过物镜(205)朝向样本(206)聚焦。因为样本不在照明辐射的焦平面上，所以照明辐射散焦在样本上(206)。现在转到图3，散焦的照明辐射从离焦样本(306)沿光路反射回来，然后穿过物镜(305)返回，并穿过分束器(304)朝向自动聚焦传感器(307)，在该处进一步散焦。因此，当样本与自动聚焦传感器(207/307)不共焦时，自动聚焦组件(202/302)也将处于散焦状态，因此来自自动聚焦组件(202/302)孔径的照明辐射将变为在样本(206/306)上散焦，并且进一步在自动聚焦传感器(207/307)上散焦。通过移动样本台，可以移动样本以使样本聚焦。然而，如果照明辐射被引导到达的特定区域不是反射性的，则如上所述，现有技术的设备和方法将无法实现聚焦。
参考图4，本发明的设备基于类似原理进行操作。然而，在自动聚焦传感器(407)上检测到的预期斑点数量与自动聚焦组件(402)中的孔径数量相对应；图4中显示了三个孔径。由于使用了多个孔径，照明辐射束聚焦到样本(406)上的单独的点，并反射到被检测的样本(407)上的单独的点，这些点是已知的(并且在本文也称为受关注区域)。因此，可以在期望的区域中检测反射的照明辐射(例如，参见图8，其使用9孔径自动聚焦组件，并且孔径被布置在网格中)。使用本发明的自动聚焦组件，即使样本上照明辐射被引导所至的一些点没有将照明辐射反射回自动聚焦传感器，其他孔径也会(参见图9，该图示出了9孔径自动聚焦组件的使用，来自外围孔径的信号中有7个被聚焦到一个点，但是中间孔径没有返回任何反射的照明辐射)。在这种情况下，一个孔径的自动聚焦组件将无法聚焦，但是本发明的自动聚焦组件使得自动聚焦系统成功。
如图5所示，在进一步的发展中，发明人已经确定自动聚焦组件(502)可以包含孔径的多个平面。与前面的描述一致，照明源(501)发射照明辐射，该照明辐射透射通过自动聚焦组件(502)中的孔径，该孔径包含两个孔径平面，这两个平面与自动聚焦传感器(507)共焦平面的任一侧距离相等。由于孔径位于不同平面上，因此穿过它们的照明辐射在样本处具有不同的焦平面，因此，在自动聚焦传感器处，从样本反射的照明辐射也具有不同的焦平面。然后通过管透镜(503)准直照明辐射，并通过分束器(504)将照明辐射引导到样本上。照明辐射通过物镜(505)朝向样本聚焦。因为样本不在照明辐射的焦平面上，所以照明辐射在样本(506)上散焦，来自不同焦平面的孔径的照明辐射被均等地散焦(509)。散焦的照明在样本(506)处从自动聚焦组件(502)的每个平面上的孔径均等地散焦，然而，这意味着样本处于聚焦状态。散焦的照明辐射(509)从样本(506)沿光路反射回来，然后经过物镜(505)返回，并经过分束器(504)朝向自动聚焦传感器(507)，在此处也被散焦，但是检测到的从孔径的每个平面反射的照明辐射被均等地散焦，指示样本(506)处于聚焦状态。当样本(506)未聚焦时，自动聚焦传感器(507)将检测来自具有不同聚焦度的自动聚焦组件(502)的孔径的每个平面的反射的照明辐射。来自自动聚焦组件(502)的孔径的不同平面的反射的照明辐射之间的聚焦方式的不同，可用于计算样本应当被移动的方向，以使来自自动聚焦组件(502)的孔径的不同平面的反射的照明辐射为相等程度的散焦。
因此，自动聚焦系统功能的关键是确保自动聚焦组件和自动聚焦传感器共焦。通常在制造系统时执行此过程，例如，通过将自动聚焦组件沿照明辐射的轴平移，如图6所示(图6的组件与前面的图相对应，仅组件编号的第一个数字变更为与附图编号匹配；此处可平移的自动聚焦组件为602)。该系统还包括激光准直透镜(609)和用于将激光辐射引导到样本上的另一分束器(610)。如图7所示，当包含自动聚焦系统的设备还包含采样和电离系统，该采样和电离系统包含撞击到样本上的激光时，消融激光也通过轴向平移准直透镜(709)而聚焦在与自动聚焦组件和自动聚焦传感器相同的焦平面上。基于对所观察到的消融斑点尺寸和形状，将激光理解为在自动聚焦系统的焦平面中具有清晰的焦点。用于将照明辐射聚焦到样本上的物镜，也用于将用于激光消融的激光辐射聚焦到样本上。
各方面包括自动聚焦系统，并且方法可以结合多种自动聚焦方法(通常用于整个载玻片成像)的优点，以在用于质谱成像分析的大范围初始样本位置上实现快速、可靠和准确的自动聚焦。例如，自动聚焦方法和/或系统可以结合两种独立的技术，诸如将孔径投影到样本平面上，其中当样本同样处于完全聚焦状态时，先验对准孔径以使其处于完全聚焦状态，并且用两个可单独控制的具有相对较小立体角的光源照亮该孔径。图12中示出了一个实例，该实例提供了自动聚焦设置的示意图。使用了两个光源，它们的光被引导通过与物镜焦平面聚焦的小孔径。如果样本散焦，相机将观察来自每个led的图像变得模糊以及根据样本上每个led的照明角度而偏移。
如图12所示，样本1206可以被放置在物镜焦平面附近。两个光源(例如led1201)可以通过聚光镜聚焦通过孔径，然后被引导(例如，通过一个或多个反射镜1204和/或物镜1205)到样本上。从样本反射的光可以撞击到图像传感器1208上，例如，在穿过管透镜1207之后。元件1209用光源的图像标记物镜后焦平面。
依次打开两个光源中的每个光源，并使用相机为每个led捕获图像。如果样本未完全聚焦，则两个图像将出现类似的模糊，但在照明角度方向上彼此偏移(参见图13)。可以使用fft快速计算这两个帧之间的相关性，并且该函数在某些像素偏移处将达到最大。该像素偏移与样本到焦点的距离成正比，并且可以沿着焦点方向使用平移载物台上已经存在的编码器直接校准比例。因此，原则上，自动聚焦机制只需要获取两个相机帧即可确定样本的最佳聚焦位置，这比我们当前的实现要快几个数量级。
我们设想可以使用许多孔径形状和尺寸。如图13所示，可以预期一种简单直接而坚固的形状是狭缝，其小开口沿平移方向取向。值得注意的是，也可以使用小的圆形或矩形孔径。可以使用多个孔径(狭缝、圆或其他)。可以使用“倒置孔径”，这意味着小的模糊度将导致某些区域中的图像变暗，这意味着样本结构将保留在聚焦图像中，因此也可以用于散焦确定。此外，可以相对于完美的样本聚焦使孔径散焦，以便在两个led图像之间产生非零的目标偏移。最后，两个led不需要具有相同的颜色。使用两个不同颜色的led使得可以通过使用一台彩色相机、或通过使用适当的滤镜将这两种颜色投影到一台单色相机的不同区域上，来进行聚焦数据的单帧采集。值得注意的是，可以使用激光二极管代替led(或与孔径组合的led)。
图13的上图：散焦距离为+60μm处获得的led图像。对于每个led，两个图像类似地模糊并沿照明方向偏移。下图：两个图像之间的计算的相关函数。抛物线形的峰拟合给出了-512.08像素的峰位置，对应于+60μm的焦点偏移。
在实践中，该算法通过朝着最佳焦点采取迭代步骤而可能会牺牲部分速度来提高鲁棒性。例如，可以采取提取的散焦值的95％的步骤，并重复自动聚焦方法。随后的重复应当非常迅速地收敛到正确的聚焦位置。
对于这种自动聚焦方法的高速操作，必不可少的是使用电子触发器来触发相机上的帧捕获，这与在自由运行模式下使用相机相反。这可以使用标准的工业视觉相机来实现，这些相机通常将异步触发作为其功能集的一部分。
使用相机的硬件触发的一个附加好处是，它还有益于其他一些imc功能，尤其是全景采集。全景拍摄的当前实施方式(使用自由运行的相机)被称为“停止并凝视(stop-and-stare)”，其中载物台移动到每个连续的目标位置，并在继续移动前进之前等待相机到达下一帧。使用基于目标载物台位置或结合载物台位置的高速套准的硬件相机触发，以及强烈的led照明(允许在相机上很短的集成时间)，可以使载物台保持连续移动，而沿移动轮廓的特定位置获取相机帧。这样可以大大提高imc中全景图的获取速度。
当激光、自动聚焦组件和自动聚焦传感器共焦时，则在设备使用过程中，可以通过将样本移动到焦点上，通过将其移动到反射照明辐射在自动聚焦传感器上聚焦的点，来聚焦激光。因此，自动聚焦系统可以聚焦光学成像组件/系统以及电离和采样系统。
用于自动聚焦的方法
本文描述了多种自动聚焦方法，包括使用本文描述的自动聚焦系统的任何方法。
在某些方面，自动聚焦基于撞击自动聚焦传感器的一个或多个斑点或线的位置。自动聚焦系统可能不需要在撞击自动聚焦传感器的一个或多个斑点或线处的预先校准的(例如，最佳聚焦)坐标。可替代地，可以预校准自动聚焦系统，使得特征与自动聚焦传感器上处于最佳聚焦的已知坐标重合。
自动聚焦可以基于由自动聚焦传感器检测到的特征(斑点或线)的对准。例如，自动聚焦(例如，自动聚焦校正)可以基于撞击自动聚焦传感器的斑点或线之间的偏移。自动聚焦基于自动聚焦传感器上特征的一致性，使得重复进行自动聚焦校正，直到这些特征一致为止。与来自此类led和/或激光二极管的恒定辐射相比，提供单独的特征的交替的led和/或激光二极管可以使得提高准确性(例如，当分别检测这些特征时，特征之间的轻微的位置偏移才仅是明显的)。
在某些实施例中，多个孔径可以提供来自单个led的多个特征。然后，可以基于由自动聚焦传感器检测到的斑点的数量和/或由自动聚焦传感器检测到的斑点的均匀性，来进行自动聚焦。
自动聚焦可以通过多种方法来实现。例如，一方面，可以实现追溯确定。广义上讲，这种方法的工作方式是：以相对粗略的方式在一个位置范围内扫描样本，并在两个位置之间留有较大的距离，并选择最接近自动聚焦系统的焦平面的位置(即最高焦点分数)。一旦确定了最接近的位置，就可以通过再次将样本移动经过一系列位置来执行对该位置的进一步细化，其中，与先前的较粗略步骤相比，在细化步骤中这些位置更靠近在一起。从这些位置中选择最接近焦平面的位置(再次是具有最高焦点分数的位置)。因此，第一种方法依赖于扫描一定范围的样本位置，并追溯选择最佳位置。
因此，本发明提供了一种自动聚焦方法，该方法包含
确定样本的第一位置的焦点分数，
将样本移动到第二位置，
确定第二位置的焦点分数，以及
将焦点分数进行相互比较，
其中确定焦点分数的步骤包含用来自照明源的辐射来照射样本，该照明辐射穿过包含多个孔径的自动聚焦组件，并用自动聚焦传感器检测从样本反射的照明辐射(诸如其中检测从样本反射的照明辐射包含检测自动聚焦传感器上已知位置(也称为受关注区域)处的辐射，以及
其中移动样本是平行于将照明辐射引导到样本上的轴的移动(即，移动是在z轴上的)。
如上所述，在本发明方法的一些实施例中，样本被移动到多个位置。因此，有时该方法还包含在将第一位置的焦点分数与第二位置的焦点分数进行比较的步骤之前，将样本移动到至少第三位置并确定至少第三位置的焦点分数。因此，在此，将第一位置的焦点分数与第二位置的焦点分数进行比较的步骤还包括将第三焦点分数与第一和第二焦点分数进行比较。在一些情况下，该方法包含，在将第一位置的焦点分数与第二位置的焦点分数进行比较的步骤之前，将样本移动到至少第4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、250、500或1000个位置处并确定焦点分数。因此，在此，将第一位置的焦点分数与第二位置的焦点分数进行比较的步骤还包括将第4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、250、500或1000个位置与其他确定的焦点分数进行比较。
因此，该方法通过追溯搜索最高焦点分数来自动聚焦。焦点分数是可以以多种方式确定的参数。例如，可以将从多个孔径检测到的反射的照明辐射的强度相加以产生焦点分数。可替代地，可以通过测量反射的照明辐射的散焦程度来计算焦点分数(例如，当样本聚焦时，即在预期的受关注区域周围，检测反射的照明辐射预期会撞击到自动聚焦传感器的区域处及其周围的反射的照明辐射的传感器上的像素总数)。
在一些实施例中，在将焦点分数进行相互比较的步骤之后，将样本台移动到第一轮最佳聚焦位置，该位置是具有最高焦点分数的位置。如果检测到自动聚焦传感器上任何像素的饱和度，则降低光源强度，并重复该方法。
如上所注意到的，在一些情况下，该方法包含聚焦位置的第一粗略估计，随后是一个或多个其他轮次，其他轮次对样本的位置进行细化以使其更靠近焦平面。因此，在一些实施例中，该方法进一步包含在以在第一轮中确定的第一轮最佳位置为中心的第二组位置处重复该方法。作为细化，第二组中的位置之间的距离比用于计算第一轮最佳聚焦位置的位置之间的距离短。有时，位置之间的距离等于或小于用于计算第一轮最佳聚焦位置的位置之间的距离除以第二组位置中的位置数量。然后将焦点分数进行比较以产生第二轮最佳聚焦位置。在一些实施例中，第二轮最佳聚焦位置仅仅是具有最高焦点分数的第二轮位置，并且样本移动到该位置(即，如在第一轮之后的移动中所做的那样)。然而，在一些实施例中，将第二轮焦点分数进行相互比较的步骤包含以下步骤：将抛物线拟合到每个位置处的焦点分数，并计算曲线的导数为零的位置作为第二轮最佳聚焦位置。然后可以将样本台移动到由抛物线拟合确定的第二轮最佳聚焦位置。
在一些实施例中，将焦点分数进行相互比较的步骤包含以下步骤：将抛物线拟合到每个位置处的焦点分数，并计算曲线的导数为零的位置作为第一轮最佳聚焦位置。然后可以将样本台移动到第一轮最佳聚焦位置。然后可以在以确定为第一轮最佳聚焦位置的位置为中心的第二组位置处重复该方法，其中第二组位置之间的距离比用于计算第一轮最佳聚焦位置的位置之间的距离短。有时，位置之间的距离等于或小于用于计算第一轮最佳聚焦位置的位置之间的距离除以第二组位置中的位置数量，以产生第二轮最佳聚焦位置。因此，在一些实施例中，产生第二轮最佳聚焦位置包含将第二轮焦点分数进行相互比较的步骤，包含将抛物线拟合到每个位置处的焦点分数并计算曲线的导数为零的位置作为第二轮最佳聚焦位置的步骤。然后可以将样本台移动到由抛物线拟合确定的第二轮最佳聚焦位置。
本发明还提供了自动聚焦的方法，包含迭代地重复上述方法。
可替代地，可以在迭代过程中使用收敛算法以使样本聚焦，由此在任何位置处检测到的反射的照明辐射对于样本和焦平面的相对位置是信息量大的。因此，通过确定位置的读数，计算样本应移动的方向以使样本向焦平面移动以及在某些情况下估计距离，来操作这种方法。然后移动样本并确定进一步的读数。然后迭代地重复该过程以回到焦平面上。
本发明还提供了一种自动聚焦方法，该方法包含
确定样本的位置n的聚焦方向，
将样本沿聚焦方向移动到位置(n+1)，
其中确定聚焦方向包含用来自照明源的辐射照亮样本，该照明辐射穿过包含多个孔径的自动聚焦组件，其中自动聚焦组件的至少两个孔径在照明辐射穿过自动聚焦组件的轴上偏移，并用自动聚焦传感器检测从样本反射的照明辐射(诸如，其中检测从样本反射的照明辐射包含检测自动聚焦传感器上已知位置(也称为受关注区域)处的辐射)，以及
其中移动样本是平行于将照明辐射引导到样本上的轴的移动(即，移动是在z轴上的)。
在一些实施例中，该方法包含重复前一段的方法至少又1次，诸如至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次、至少10次、至少20次或至少50次。
在一些实施例中，确定在位置n处的聚焦方向的步骤包含：当来自至少两个偏移孔径的反射的照明辐射撞击到自动聚焦传感器上时，比较其散焦的程度。
样本拓扑映射方法
本发明还提供了一种映射样本表面的拓扑结构的方法，该方法包含执行自动聚焦方法，将样本在样本平面内(即，在x和/或y轴上)移动到样本平面内的第二位置，并执行本发明的自动聚焦方法，再次记录样本平面中第二位置处的最佳聚焦位置。在一些实施例中，自动聚焦方法是本发明的自动聚焦方法。在一些实施例中，该方法进一步包含将样本在样本平面中移动到一个或多个其他位置，诸如在样本平面中的至少第3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、250、500或1000个位置，并记录这些位置中每个位置处的最佳聚焦位置。有时，该方法进一步包含在样本平面中的每个位置处绘制最佳聚焦位置。有时，该方法进一步包含在样本平面中的每个位置处的最佳聚焦位置之间进行插值，以产生样本的表面表示。图11提供了根据本发明的方法的样本表面的曲线图。在一些实施例中，插值是多项式插值、样条插值或经由高斯过程的插值。
在某些方面，该方法可以包括创建跨x、y或x-y坐标的最佳焦点的聚焦图。
包含使用自动聚焦系统的采样方法
如上所注意到的，例如当系统位于本发明的设备中时，自动聚焦系统可以用于将样本带到最佳聚焦位置以进行采样。
使用以上实施例中的任一个的设备的自动聚焦的方法可以进一步包括采样。例如，自动聚焦的方法可以包括对激光进行自动聚焦以消融样本材料，并且可以包括分析样本材料(例如，通过icp-ms)。样本材料可以包括质量标签。
因此，本发明提供了一种分析样本(诸如生物样本)的方法，该方法包含：
执行本发明的自动聚焦方法，以将样本放置在采样和电离系统的焦点处；
例如通过成像质谱细胞仪或质谱成像仪确定样本的元素组成。
本发明还提供了一种分析样本的方法，该方法包含：
执行本发明的自动聚焦方法，以将样本(诸如生物样本)放置在采样和电离系统的焦点处；
在多个位置处对样本台上的样本执行采样和电离；以及
从样本上的位置检测离子，从而离子的检测允许构建样本的图像，可选地，其中多个位置是多个已知位置。
因此，更具体地，本发明提供了一种分析样本的方法，该方法包含：
执行本发明的自动聚焦方法，以将样本放置在用于激光消融的采样激光的焦点处；
在多个位置处对样本台上的样本执行激光消融；以及
对羽状物进行电离和质谱分析，从而检测羽状物中的原子可以构建样本的图像，可选地，其中多个位置是多个已知位置。
在成像质量细胞计数中，在分析之前对样本进行标记。因此，本发明还提供了一种对包含多个细胞的样本进行质量细胞计数的方法，该方法包含：
用一个或多个不同的标记原子标记样本中的多个不同目标分子，以提供标记的样本；
执行本发明的自动聚焦方法，以将样本放置在用于激光消融的采样激光的焦点处；
在多个位置处对样本台上的样本进行激光消融；以及
对羽状物进行电离和质谱分析，从而检测羽状物中的原子可以构建样本的图像，可选地，其中多个位置是多个已知位置。
如本领域技术人员所理解的，这些方法中的激光消融是通过将激光辐射引导至样本来实现的。在一些实施例中，在每个位置处，对样本发射多个激光束，并且在每个束到达该位置处之后，样本台上的样本在z轴上朝向激光的焦点移动以影响样本在该位置消融的深度。在一些实施例中，用于消融样本的z轴上的起始位置是通过本发明的样本拓扑映射方法确定的样本上该位置处的最佳聚焦位置，并且其中在样本上的位置处从z轴上某个位置处的每个束产生的每个羽状物可以被单独地检测，诸如允许构建样本的3d图像。
在一些实施例中，该方法包含使用本发明的自动聚焦组件。
在一些实施例中，该方法包含使用本发明的自动聚焦系统。
在一些实施例中，该方法包含使用本发明的设备。
方法的其他方面
在基于自动聚焦的自动聚焦和/或采样之前，本申请的方法可以包括提供已标记的生物样本。在某些方面，一种方法可以包括标记生物样本。如本文所述，可以用缀合至特异性结合对(sbp)成员的标记原子来标记生物样本。例如，sbp成员可以包括抗体和/或标记原子可以包括金属标签(诸如富集金属同位素)。本文进一步描述了合适的样本、标记原子、sbp成员和标记方法。
自动聚焦系统中的注意事项
成像质谱细胞仪系统的一项重要功能是能够在相机视图中对样本进行自动聚焦。自动聚焦系统的主要性能特征是执行自动聚焦所需的平均时间、系统在各种样本上的鲁棒性/可靠性以及自动聚焦系统将产生可靠结果的聚焦范围。当前，大多数可用的自动聚焦系统(包括在第一代imc中实现的自动聚焦系统)在这三个要求中的至少一个方面表现不佳。
例如，使用多个孔径和单个led光源的imc自动聚焦系统是鲁棒的且通常可靠的，并且能够在较长的平移范围内找到最佳焦点，但是它可能很慢(例如，在毫秒级别)。当激光消融和质量分析的速度可比时，这可能不是问题。
许多售后商业系统都受到相反的局限性：它们速度快且大多稳定(某些浸没型样本除外)，但仅当样本已经相对接近最佳焦点时才起作用，并且在整个装置寿命过程中可能会出现焦点漂移。
自动聚焦系统可以分为两种主要类型：基于硬件或基于图像分析。后一类从清晰度、对比度等方面分析了样本的当前图像，并尝试通过移动样本来最大化这些特征。此类系统倾向于对一部分样本而言工作得很好，但是不能与本质上缺乏对比度的样本一起工作。此外，自动聚焦方法的工作范围受到限制，并且系统将需要“寻找”以找到最佳焦点。总体而言，这种类型的自动聚焦速度可能很快，但对于imc中的无人监督应用而言，通常不够可靠。
基于硬件的自动聚焦系统(尤其是针对标准显微镜的售后解决方案)通常使用不可见光将照明的孔径投影到样本上，而照明仅来自显微镜物镜后孔径的一侧。这种单侧照明的效果是，当样本移动通过焦点时，在物镜的图像平面中，孔径会从一侧移到另一侧(除了散焦之外)。位置敏感型检测器用于量化此横向偏移，并以此方式可以保持最佳聚焦位置。该方法的工作范围很有限，因此该方法的应用通常是使样本保持聚焦，而不是首先寻找最佳焦点。这些自动聚焦方法难以随时间、温度以及各种样本和物镜保持校准，这使情况更加恶化。其次，样本的结构可能会对在物镜图像平面上观察到的图像产生影响。因此，当样本处于完全聚焦状态时，检测器的输出对于所有样本而言都不相同。同样，这将这些系统的应用限制为“锁定”到特定的聚焦位置，并且只能长时间观察一个样本的一个区域。
在某些方面，自动聚焦系统或方法可以提供与样本表面质量无关的快速自动聚焦，并且可以进行动态校正以聚焦质量，这可以减轻样本倾斜、载物台平坦度问题和/或样本表面拓扑结构的影响。
在某些方面，来自led的光可以被传送通过孔径，然后进入物镜本身(外延照明)。当系统处于聚焦状态时，使用孔径可以通过产生具有高对比度的清晰图像来提高系统性能。
1.采样和电离系统
样本的采样涉及通过聚焦在样本上并激发样本的一束粒子(例如光子)从样本中去除材料，从而使材料从样本中移出。粒子束(例如光子)的焦点与上一部分中介绍的自动聚焦系统共焦，因此，当自动聚焦系统将样本置于焦点时，样本将置于样本的最佳位置。
这样，本申请的设备可以包括采样系统(诸如激光消融采样系统)、电离系统(诸如icp系统)或两者。例如，该设备可以包括自动聚焦系统、可移动样本台和激光消融采样系统，其可以耦合到诸如icp-ms系统的质谱仪。在某些情况下，此类设备可以进一步包括icp-ms系统。
在某些方面，采样系统是激光消融采样系统。该设备可以进一步包括电离系统，诸如通过气体导管耦合到激光消融采样系统的icp电离系统。该设备可以进一步包括质谱仪。质谱仪可以被配置为同时检测多个质量标签。
a.激光消融采样和电离系统
基于激光消融的分析仪通常包含三个组件。第一个是激光消融采样系统，用于从待分析样本中产生气态和颗粒状物质的羽状物。在被检测器系统–质谱仪组件(ms组件；第三个组件)检测到被消融的样本材料的羽状物中的原子(包括如下所述的任何可检测的标记原子)之前，必须将样本电离(并雾化)。因此，该设备包含第二个组件，该组件是一个电离系统，可将原子电离形成元素离子，从而使它们能够被ms组件根据质荷比检测(样本材料的某些电离可能发生在消融斑点处，但是空间电荷效应会导致电荷几乎立即中和)。激光消融采样系统通过输送导管连接到电离系统。
激光消融采样系统
简而言之，激光消融采样系统的组件包括激光源，该激光源发射被引导到样本上的激光辐射束。将样本放置在激光消融采样系统的腔室(样本室)内的一个载物台上。该载物台通常是平移载物台，因此样本可以相对于激光辐射束移动，从而可以对样本上的不同位置进行采样以进行分析。如以下更详细讨论的那样，气体流过样本室，并且气流带走了激光源消融样本时产生的雾化材料羽状物，用于基于其元素的组成(包括标记原子，诸如来自元素标签的标记原子)分析和构建图像。如下面进一步解释的，在一种可替代的作用方式中，激光消融采样系统的激光系统也可以用于从样本中解吸材料。
特别是对于生物样本(细胞、组织切片等)，样本通常是异质的(尽管异质样本在本公开的其他应用领域中是已知的，即非生物性质的样本)。异质样本是包含由不同材料组成的区域的样本，因此在给定的波长下，样本的某些区域可以以比其他区域更低的阈值能量密度进行消融。影响消融阈值的因素是材料的吸收系数和材料的机械强度。对于生物组织，吸收系数将起主要作用，因为它会随激光辐射波长变化几个数量级。例如，在生物样本中，当使用纳秒激光脉冲时，含有蛋白质物质的区域将在200-230nm波长范围内更容易吸收，而主要包含dna的区域将在260-280nm波长范围内更容易吸收。
可以以接近样本材料的消融阈值的能量密度(fluence)进行激光消融。以这种方式消融通常可以改善气溶胶的形成，进而有助于改善分析后的数据质量。通常为了获得最小的坑(crater)，以使所得图像的分辨率最大化，采用了高斯光束。高斯光束的横截面记录了具有高斯分布的能量密度曲线。在这种情况下，光束的能量密度会随着距中心的距离而变化。结果，消融斑点尺寸的直径是两个参数的函数：(i)高斯光束腰(1/e2)，以及(ii)施加的能量密度和阈值能量密度之间的比率。
因此，为了确保用每个消融激光脉冲一致地去除可再现量的材料，从而最大程度地提高成像数据的质量，保持一致的消融直径是有用的，这进而又意味着调节激光脉冲对目标提供的能量与被消融的材料的消融阈值能量的比率。当消融异质样本时，其中阈值消融能量在整个样本中变化，诸如dna和蛋白质材料的比率变化的生物组织，或在地质样本中，其随样本区域中的特定矿物组成而变化，此要求表示一个问题。为了解决这个问题，可以将一个以上波长的激光辐射聚焦到样本上的相同消融位置上，以基于该位置处的样本组成更有效地消融样本。
激光消融采样系统的激光系统
可以将激光系统设置为产生单个或多个(即两个以上)波长的激光辐射。通常，所讨论的激光辐射的波长是指具有最高强度的波长(“峰值”波长)。如果系统产生不同的波长，则它们可用于不同的目的，例如，以样本中的不同材料作为目标(此处作为目标是指所选波长是被材料良好吸收的波长)。
在使用多个波长的情况下，激光辐射的两个以上波长中的至少两个可以是离散波长。因此，当第一激光源发射出与第二辐射波长离散的第一辐射波长时，这意味着第一激光源在第一波长的脉冲中不产生第二波长的辐射，或仅产生非常低水平的第二波长的辐射，例如，小于第一波长处的强度的10％，诸如小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。通常，当通过谐波生成或其他非线性频率转换过程产生不同波长的激光辐射时，则当在本文中提及特定波长时，本领域技术人员将理解，关于在激光产生的光谱中的特定波长将存在一定程度的变化。例如，对xnm的提及包括产生在x±10nm范围内(诸如x±5nm，例如x±3nm)的光谱的激光。
激光器
通常，用于消融样本的激光的波长和功率的选择可以遵循细胞分析中的常规用法。激光必须具有足够的能量密度，以使得消融至所需的深度，而又不会实质地消融样本载体。在0.1-5j/cm2之间的激光能量密度通常是合适的，例如从3-4j/cm2或约3.5j/cm2开始，并且理想情况下激光将能够以200hz或更高的频率产生具有这种能量密度的脉冲。在一些情况下，来自这种激光器的单个激光脉冲应足以消融用于分析的细胞材料，从而使激光脉冲频率与产生消融羽状物的频率相匹配。通常，要成为可用于对生物样本成像的激光，激光器应产生持续时间少于100ns(优选少于1ns)的脉冲，该脉冲可以聚焦到例如本文讨论的特定斑点尺寸。在本发明的一些实施例中，消融速率(即激光消融样本表面上的斑点的速率)为200hz以上，诸如500hz以上、750hz以上、1khz以上、1.5khz以上、2khz以上、2.5khz以上、3khz以上、3.5khz以上、4khz以上、4.5khz以上、5khz以上、10khz以上、100khz以上、1mhz以上、10mhz以上、或100mhz以上。许多激光器的重复频率超过激光消融频率，因此可以采用适当的组件，诸如脉冲选择器等来适当地控制消融速率。因此，在一些实施例中，激光重复率是至少1khz，诸如至少10khz、至少100khz、至少1mhz、至少10mhz、约80mhz或至少100mhz，可选地，其中采样系统进一步包含脉冲选择器，诸如其中脉冲选择器由控制模块控制，该控制模块还控制样本台和/或定位器的移动。在其他情况下，可以使用多个紧密间隔的脉冲群(pulseburst)(例如，一列3个紧密间隔的脉冲)来消融一个单个斑点。例如，通过在每个斑点中使用100个由3个紧密间隔的脉冲组成的群，可以消融10×10μm的区域；这对于具有有限消融深度的激光器(例如飞秒激光器)很有用，并且可以在不损失分辨率的情况下产生消融的蜂窝状材料的连续的羽状物。
例如，激光系统的消融频率在200hz-100mhz、200hz-10mhz、200hz-1mhz、200hz100khz范围内、在500-50khz范围内、或在1khz-10khz范围内。
在这些频率下，如果需要单独解决每个消融的羽状物(如下面所述，在对样本发射一连串脉冲时可能不一定需要)，则仪器必须能够足够迅速地分析消融材料，以免连续消融之间存在明显的信号重叠。优选的是，源自连续羽状物的信号之间的重叠强度＜10％，更优选＜5％，并且理想地＜2％。分析羽状物所需的时间将取决于样本室的冲洗时间(请参见下面的样本室部分)，羽状物气溶胶进出并通过激光电离系统的通过时间、以及分析电离物质所需的时间。可以将每个激光脉冲与随后建立的样本图像上的像素相关联，如下面更详细地讨论。
在一些实施例中，激光源包含具有纳秒脉冲持续时间的激光或超快激光(脉冲持续时间为1ps(10-12s))或更快速的激光，诸如飞秒激光。超快脉冲持续时间具有许多优点，因为它们限制了热量从消融区域的扩散，从而提供了更精确、更可靠的消融坑，并最大程度地减少了每个消融事件产生的碎屑飞散。
在某些情况下，飞秒激光器被用作激光源。飞秒激光器是发射持续时间低于1ps的光脉冲的激光器。这种短脉冲的产生通常采用被动模式锁定技术。可以使用多种类型的激光器来产生飞秒激光。使用被动锁模固态体激光器可以实现介于30fs和30ps之间的典型持续时间。类似地，在这种情况下工作的各种二极管泵浦激光器，例如基于钕掺杂或镱掺杂的增益介质。具有改进色散补偿的钛-蓝宝石激光器甚至适用于脉冲持续时间低于10fs，在极端情况下可低至约5fs。在大多数情况下，脉冲重复频率在10mhz和500mhz之间，尽管存在较低的重复频率版本，其中对于较高的脉冲能量，重复频率为几兆赫兹(可从例如lumentum(美国加利福尼亚州)、radiantis(西班牙)、coherent(美国加利福尼亚州)获得)。这种类型的激光器可以带有放大器系统，该放大器系统可以增加脉冲能量。
还有各种类型的超快光纤激光器，在大多数情况下，它们也是被动锁模的，通常提供的脉冲持续时间在50和500fs之间，重复频率在10和100mhz之间。这种激光器可以从例如nkt光电(丹麦；以前的fianium)、amplitude系统(法国)、laser-femto(美国加利福尼亚州)商购获得。这种激光器的脉冲能量也可以通过放大器来增加，通常以集成光纤放大器的形式。
一些锁模二极管激光器可以产生飞秒持续时间的脉冲。直接在激光器输出处，脉冲持续时间通常约为数百飞秒(例如，可以从coherent(美国加利福尼亚州)获得)。
在一些情况下，使用皮秒激光器。在前面的段落中已经讨论过的许多类型的激光器也可以适于产生皮秒范围持续时间的脉冲。最常见的光源是主动或被动锁模固态体激光器，例如被动锁模钕掺杂的yag、玻璃或钒酸盐激光器。同样，皮秒锁模激光器和激光二极管是可以商购获得的(例如nkt光电(丹麦)、ekspla(立陶宛))。
纳秒级脉冲持续时间激光器(增益切换和q切换)还可以在特定的设备设置(coherent(美国加利福尼亚州)、thorlabs(美国新泽西州))中找到实用性。
可替代地，可以使用外部调制的连续波激光器，以产生纳秒或更短的持续时间脉冲。
通常，本文讨论的激光系统中用于消融的激光束的斑点尺寸(即在采样位置处)为100μm以下，诸如50μm以下、25μm以下、20μm以下、15μm以下、或10μm以下，诸如约3μm以下、约2μm以下、约1μm以下、约500nm以下、约250nm以下。该距离称为斑点尺寸，对应于光束的最长内部尺寸，例如对于圆形光束，它是光束直径，对于方形光束，它是相对角之间对角线的长度，对于四边形，它是最长对角线的长度，等等。(如上所述，具有高斯分布的圆形光束的直径被定义为能量密度已降低至峰值能量密度的1/e2倍的点之间的距离)。作为高斯光束的替代，可以采用光束成形和光束掩模来提供期望的消融斑点。例如，在一些应用中，具有高顶能量分布的正方形消融斑点可能是有用的(即，与高斯能量分布相反，具有接近均匀的能量密度的光束)。这种布置减小了消融斑点尺寸对高斯能量分布的峰值处的能量密度与阈值能量密度之间的比率的依赖性。接近阈值能量密度的消融可提供更可靠的消融坑生成，并控制碎屑的产生。因此，激光系统可以包含布置在高斯光束中的光束掩模和/或光束成形部件，诸如衍射光学器件，以使光束重新整形并产生均匀或接近均匀能量密度的激光焦点，诸如能量密度在整个光束上变化小于±25％，诸如小于±20％、±15％、±10％或小于±5％。有时，激光束具有正方形的横截面形状。有时，光束具有高顶能量分布。
当用于分析生物样本时，为了分析单个细胞，所用激光束的斑点尺寸将取决于细胞的尺寸和间距。例如，当细胞彼此紧紧地堆积在一起时(诸如在组织切片中)，激光系统中的一个或多个激光源的斑点尺寸可以不大于这些细胞。这个尺寸将取决于样本中的特定细胞，但通常激光斑点的直径应小于4μm，例如约3μm以下、约2μm以下、约1μm以下、约500nm以下、约250nm以下、或介于300nm和1μm之间。为了以亚细胞分辨率分析给定的细胞，系统使用不大于这些细胞的激光斑点尺寸，更具体地说，使用可以消融具有亚细胞分辨率的材料的激光斑点尺寸。有时，可以使用大于细胞尺寸的斑点进行单细胞分析，例如，将细胞散布在载玻片上，并在细胞之间留出空间。在此，可以使用更大的斑点尺寸，并且可以实现单细胞表征，因为受关注细胞周围的附加消融区域不包含附加细胞。因此所使用的特定斑点尺寸可适当地取决于被分析细胞的尺寸来进行选择。在生物样本中，细胞很少都具有相同的尺寸，因此，如果需要进行亚细胞分辨率成像，则如果在整个消融过程中保持恒定的斑点尺寸，则消融斑点的尺寸应小于最小的细胞。使用激光束聚焦可以实现小斑点尺寸。1μm的激光斑点直径对应于1μm的激光焦点(即，光束焦点处的激光束直径)，但是由于目标上的能量空间分布(例如，高斯光束形状)以及总激光能量相对于消融阈值能量的变化，激光焦点的变化可以是+20％以上。用于聚焦激光束的合适物镜包括反射物镜，诸如schwarzschildcassegrain设计的物镜(反向cassegrain)。也可以使用折射物镜，也可以使用反射折射物镜的组合。单个非球面透镜也可以用于实现所需的聚焦。固体浸没透镜或衍射光学器件也可以用于聚焦激光束。可以单独使用或与上述物镜结合使用的另一种控制激光的斑点尺寸的方法是在聚焦之前使光束通过孔径。通过使光束穿过直径阵列中的不同直径的孔径，可以实现不同的光束直径。在一些情况下，例如当孔径是光圈孔径时，存在可变尺寸的单个孔径。有时，光圈孔径是虹膜孔径。斑点尺寸的变化也可以通过光学器件的抖动来实现。一个或多个透镜以及一个或多个孔径位于激光器与样本台之间。
为了完整起见，本领域已知的用于亚细胞分辨率的用于la的标准激光器是准分子激光器或复合受激态激光器。使用氟化氩激光器(λ＝193nm)可以获得合适的结果。这些激光器的脉冲持续时间为10-15ns，可以实现充分的消融。
总体而言，结合ms检测器的响应特性选择激光脉冲的频率和强度，以允许对单个激光消融羽状物进行不同的检测。结合使用小的激光斑点和冲洗时间短的样本室，现在可以实现快速、高分辨率的成像。
激光消融焦点
为了最大效率地使激光消融样本中材料，样本应相对于激光焦点位于适当的位置，例如在焦点处，因为焦点是激光束直径最小的位置并具有最集中的能量。这可以通过多种方式来实现。第一种方式是，样本可以在被引导到其上的激光的轴上移动(即，沿激光路径上下移动/朝向和远离激光源)移动到期望的点，在该点处光强度足以实现所需的消融。可替代地或附加地，透镜可用于移动激光的焦点，并因此具有例如通过缩小来消融样本位置处的材料的有效能力。一个或多个透镜位于激光和样本台之间。第三种方式是改变激光的位置，其可以单独使用或与前述两种方式中的一种或两种结合。
为了帮助系统的用户将样本放置在最合适的位置，以便从样本中消融材料，可以将相机导向保持样本的载物台(下面将详细讨论)。因此，本公开提供了一种激光消融采样系统，其包含对准样本台的相机。相机检测到的图像可以被聚焦到激光聚焦的同一点。这可以通过使用与激光消融和光学成像相同的物镜来实现。通过使两个焦点一致，用户可以确保在光学图像清晰聚焦时激光消融将最有效。可以通过使用压电活化剂，如physikinstrumente、cedrat-technologies、thorlabs和其他供应商所提供的，来实现载物台的精确移动以便聚焦样本。
在另一种操作模式中，激光消融通过样本载体被引导至样本。在这种情况下，应当选择样本支撑物，以使其对用来消融样本的激光辐射频率(至少部分)透明。在特定情况下，通过样本的消融可能具有优点，因为这种消融模式可以为从样本中消融掉的材料羽状物提供附加的动能，使消融后的材料进一步远离样本表面，从而促进了消融的材料从样本中运走的流动，以便在检测器中进行分析。同样，也可以通过穿过载体的激光辐射来介导基于解吸的方法来去除样本材料的块。提供给被解吸的材料块的附加动能可以帮助将块从样本载体中弹射出来，从而促进该块被夹带在流经样本室的载气中。
为了实现样本的3d成像，可以将样本或其限定区域消融到第一深度，该深度不能完全穿过样本。之后，可以将同一区域再次消融到第二深度，依此类推消融到第三、第四等深度。这样，可以建立样本的3d图像。在一些情况下，可能优选在继续于第二深度处消融之前将所有用于消融的区域消融至第一深度。可替代地，可以在进行到该区域中的下一个位置进行消融之前，在相同的点执行重复的消融以消融不同的深度。在这两种情况下，成像软件都可以将ms处得到的信号解卷积到样本的位置和深度。可以采用厚组织染色并将组织稳定在湿态，类似于共焦成像中使用的工作流程(clendenon等人，2011.microscmicroanal17:614-617)。
用于多种操作模式的激光系统光学器件
作为常规布置的问题，光学组件可以用于将可选地具有不同波长的激光辐射引导至不同的相对位置。还可布置光学组件，以将可选地具有不同波长的激光辐射从不同方向引导到样本上。例如，可以从上方将一个或多个波长引导到样本上，并且可以从下方(即，穿过承载样本的基板，诸如显微镜载玻片，也称为样本载体)引导一个或多个波长的激光辐射(可选地，不同的波长))。这使得同一设备可以采用多种操作模式。因此，激光系统可以包括光学组件的布置，被布置成将可选地具有不同波长的激光辐射从不同方向引导到样本上。因此，可以布置光学组件，使得该布置将激光辐射(可选地具有不同波长)从相反的方向引导到样本上。在本上下文中，“相反”方向不限于从上方和下方(其为180°相反)垂直被引导到样本上的激光辐射，而是包括以除了垂直于样本的角度之外的角度将激光辐射引导到样本上的布置。从不同方向引导到样本上的激光辐射不需要平行。有时，当样本在样本载体上时，反射器布置可以被布置成将第一波长的激光辐射直接引导到样本上，并且将第二波长的激光辐射通过样本载体引导到样本。
将激光辐射通过样本载体引导至样本可用于消融样本。然而，在一些系统中，将激光辐射引导通过载体可以用于“lifting”操作模式，如下面关于基于解吸的采样系统更详细地讨论的(尽管本领域技术人员将理解的，消融和lifting可以由相同的设备执行，因此本文所称的激光消融采样系统也可以用作基于解吸的采样系统)。用于将激光辐射从第一方向聚焦到样本上的透镜的na(数值孔径)可能不同于用于将激光辐射(可选地以不同波长)从第二方向聚焦到样本上的透镜的na(数值孔径)。提升操作(例如，其中激光辐射被引导通过样本载体)通常采用比进行消融时更大的直径的斑点尺寸。
激光消融采样系统的样本室
当样本进行激光消融时，将其放置在样本室中。样本室包含可保持样本的载物台(通常样本位于样本载体上)。当消融时，样本中的材料会形成羽状物，并且从气体入口到气体出口流经样本室的气流会带走雾化材料的羽状物，包括位于消融位置的所有标记原子。气体将材料带到电离系统，电离系统将材料电离，以实现检测器的检测。样本中的原子(包括标记原子)可以通过检测器进行区分，因此它们的检测揭示出羽状物中是否存在多个目标，因此可以确定样本上被消融的位点处存在哪些目标。因此，样本室起着双重作用，既容纳被分析的固体样本，还作为将雾化材料转移到电离和检测系统的起点。这意味着流经室的气流会影响材料的消融羽状物穿过系统时将如何扩散。消融羽状物如何扩散的度量是样本室的冲洗时间。该值是流经样本室的气体从样本室中将从样本消融的材料带走所需的时间的量度。
以这种方式从激光消融产生的信号的空间分辨率(即，当消融用于成像而不是专门用于清除时，如下所述)取决于以下因素：(i)激光的斑点尺寸，因为信号被积分在被消融的总面积上；以及产生羽状物的速度与样本相对于激光的移动之间的关系；以及(ii)相对于产生羽状物的速度而言能够分析羽状物的速度，以避免如上所述来自连续羽状物的信号的重叠。因此，如果需要对羽状物进行单独分析，则能够在最短的时间内分析羽状物可将羽状物重叠的可能性降到最低(因此又可以使羽状物更频繁地产生)。
因此，具有短冲洗时间(例如100ms以下)的样本室对于与本文公开的设备和方法一起使用是有利的。具有长冲洗时间的样本室将限制产生图像的速度，或导致源自连续样本点的信号之间重叠(例如kindness等人(2003；clinchem49:1916-23)，信号持续时间超过10秒)。因此，气溶胶冲洗时间是在不增加总扫描时间的情况下获得高分辨率的关键限制因素。冲洗时间≤100ms的样本室在本领域中是已知的。例如，gurevich和
为了完整起见，有时可能会比样本室的冲洗时间更频繁地产生样本中的羽状物，并且所产生的图像也会相应地出现拖尾现象(例如，如果认为进行特定分析不需要尽可能高的分辨率)。
样本室通常包含平移载物台，该平移载物台保持样本(和样本载体)并使样本相对于激光辐射束移动。当使用需要激光辐射通过样本载体导向样本的方向的操作模式时，例如如本文讨论的提升方法中一样，保持样本载体的载物台也应对所用的激光辐射透明。
因此，样本可以被定位在样本载体(例如玻璃载玻片)的当激光辐射被引导到样本上时面对激光辐射的一侧上，以使得消融羽状物在与激光辐射被引导到样本上的同一侧上被释放并被捕获。可替代地，样本可以被定位在当激光辐射被引导到样本上时与激光辐射相对的一侧上(即，激光辐射在到达样本之前穿过样本载体)，并且消融羽状物在与激光辐射相对的一侧上被释放并被捕获。
样本室的一个特点是广泛的移动范围，在样本室中样本的各个离散区域内的特定部分被消融，在该范围内，样本可以在x和y(即水平)轴上相对于激光(激光束沿z轴被引导到样本上)移动，x和y轴相互垂直。通过在样本室内移动台并将激光器的位置固定在设备的激光消融采样系统中，可以实现更加可靠和准确的相对位置。移动范围越大，离散的消融区域彼此之间的距离就越远。通过移动放置样本的载物台，使样本相对于激光移动。因此，样本台在样本室内在x和y轴上的移动范围为至少10mm，诸如在x和y轴上20mm、在x和y轴上30mm、在x和y轴上40mm、在x和y轴上50mm、诸如在x和y轴上75mm。有时，移动范围使得可以在室内分析标准25mm×75mm显微镜载玻片的整个表面。当然，除了能够实现大范围的移动之外，为了能够实现亚细胞消融，移动应该是精确的。因此，该载物台可以被配置为以小于10μm、诸如小于5μm、小于4μm、小于3μm、小于2μm、1μm、或小于1μm、小于500nm、小于200nm、小于100nm的增量在x和y轴上移动样本。例如，载物台可以被配置为以至少50nm的增量移动样本。精确的载物台移动可以以约1μm的增量进行，诸如1μm±0.1μm。可以使用可商购获得的显微镜载物台，例如可以从thorlabs、priorscientific和appliedscientificinstrumentation获得。可替代地，可以基于提供所需移动范围和合适的精密移动的定位器，诸如smaract的slc-24定位器，由组件构建电动载物台。样本台的移动速度也会影响分析速度。因此，样本台具有大于1mm/s的操作速度，诸如10mm/s、50mm/s或100mm/s。
自然地，当样本室中的样本台具有广泛的移动范围时，样本的尺寸必须适当调节以适应载物台的移动。因此，样本室的尺寸取决于所涉及样本的尺寸，而样本的尺寸又决定了可移动样本台的尺寸。样本室的示例性尺寸具有10×10cm、15×15cm或20×20cm的内部室。室的深度可以是3cm、4cm或5cm。技术人员将能够根据本文的教导来选择合适的尺寸。用于使用激光消融采样器分析生物样本的样本室的内部尺寸必须大于样本台的移动范围，例如至少5mm、诸如至少10mm。这是因为，如果室的壁太靠近载物台的边缘，则经过室的载气流会使消融的材料羽状物从样本中移出并进入电离系统，这会造成湍流。湍流扰动了消融的羽状物，因此，材料羽状物在被消融并被带走至设备的电离系统之后开始散布开，而不是作为消融的材料的紧密云团保留。消融材料的较宽峰对电离和检测系统产生的数据有负面影响，因为它会由于峰重叠而导致干扰，因此最终会导致空间分辨率差的数据，除非将消融速率减慢到不再具有实验意义这样的程度。
如上所述，样本室包含将材料带到电离系统的气体入口和气体出口。然而，如本领域技术人员所确定的那样，它可以包含用作入口或出口的其他端口，以引导气体在室中流动和/或向室提供气体混合物，以适合进行特定消融过程。
相机
除了识别用于激光消融的样本的最有效定位之外，还包括相机(例如图像传感器，诸如基于电荷耦合器件的图像传感器(ccd)相机、互补金属氧化物半导体(cmos)传感器或基于有源像素传感器的相机)或激光消融采样系统中的任何其他光检测装置，其可以进行各种进一步的分析和技术。ccd是一种用于检测光并将其转换为可用于产生图像的数字信息的装置。在ccd图像传感器中，有一系列检测光的电容器，每个电容器代表所确定图像上的一个像素。这些电容器可以将入射的光子转换为电荷。然后使用ccd读取这些电荷，并且可以将记录的电荷转换为图像。有源像素传感器(aps)是一种图像传感器，由包含像素传感器阵列的集成电路组成，每个像素均包括一个光电检测器和一个有源放大器，例如cmos传感器。
可以将相机结合到本文讨论的任何激光消融采样系统中。相机可用于扫描样本以识别受特定关注的细胞或受特定关注的区域(例如特定形态的细胞)、或对抗原、细胞内受体或结构特异的荧光探针。在某些实施例中，荧光探针是也包含可检测的金属标签的组织化学染色剂或抗体。一旦识别出此类细胞，就可以将激光脉冲引导到这些特定的细胞，以消融材料进行分析，例如以自动化方式(其中系统既可以识别也可以消融受关注特征/区域(诸如细胞))或半自动化过程(系统的用户(例如临床病理学家)识别受关注特征/区域，然后系统以自动方式消融)。这能够显著提高进行分析的速度，因为不需要消融整个样本来分析特定细胞，而是可以对受关注细胞进行特异性消融。在进行消融所花费的时间方面，特别是在解释来自消融的数据所花费的时间方面，在根据消融构造图像的方面，这使得在分析生物样本的方法方面产生了效率。根据数据构造图像是成像过程中比较耗时的部分之一，因此，通过将从样本的相关部分收集到的数据最小化，可以提高整体分析速度。
相机可以记录来自共焦显微镜的图像。共焦显微镜是光学显微镜的一种形式，具有许多优点，包括减少远离焦平面的背景信息(光)的干扰的能力。这可以通过消除散焦的光线或眩光来实现。共焦显微镜可用于评估样本的细胞形态、或细胞是离散细胞还是细胞团的一部分。通常，样本用荧光标记物进行特异性标记(诸如通过标记的抗体或通过标记的核酸)。这些荧光标记物可用于染色特定的细胞群(例如，表达某些基因和/或蛋白质)或细胞上的特定形态特征(诸如细胞核或线粒体)，并在用适当波长的光照射时，这些样本区域是可以明确识别的。因此，本文所述的一些系统可以包含用于激发标记中的荧光团的激光，该标记用于标记样本。可替代地，led光源可以用于激发荧光团。非共焦(例如，宽视野)荧光显微镜也可以用于识别生物样本的某些区域，但是具有比共焦显微镜更低的分辨率。
另一种可替代的成像技术是双光子激发显微镜(也称为非线性或多光子显微镜)。该技术通常采用近红外光来激发荧光团。每个激发事件吸收两个红外光子。ir可使组织中的散射最小化。此外，由于多光子吸收，强烈抑制了背景信号。最常用的荧光团的激发光谱在400-500nm范围内，而用于激发双光子荧光的激光则在近红外范围内。如果荧光团同时吸收两个红外光子，它将吸收足够的能量以激发到激发态。然后，荧光团将发射单个光子，该光子的波长取决于随后可以检测到的所用荧光团的类型。
当使用激光激发荧光显微镜的荧光团时，有时该激光与产生用于从生物样本消融材料的激光相同，但是所使用的功率不足以导致从样本消融材料。有时荧光团会被光的波长激发，然后激光用该光消融样本。在其他情况下，可以使用不同的波长，例如，除了用于消融样本的谐波之外，还可以通过产生激光的不同谐波来获得不同波长的光，或利用在上述谐波产生系统中产生的不同谐波。例如，如果使用nd:yag激光的四次和/或五次谐波，则可以将基波或二次至三次谐波用于荧光显微镜检查。
作为结合荧光和激光消融的示例技术，可以用缀合至荧光部分的抗体或核酸来标记生物样本中的细胞核。因此，通过激发荧光标记，然后使用相机观察并记录荧光的位置，可以将消融激光专门地引导到细胞核或不包括细胞核材料的区域。将样本分为细胞核和细胞质区域，将在细胞化学领域中找到特定的应用。通过使用图像传感器(诸如ccd检测器或有源像素传感器，例如cmos传感器)，通过使用控制模块(诸如计算机或编程芯片)，将荧光的位置与样本的x、y坐标相关联，然后将消融激光引导到该位置，可以使识别受关注特征/区域然后消融它们的过程全部自动化。作为此过程的一部分，由图像传感器拍摄的第一张图像可能具有低物镜放大倍率(低数值孔径)，从而可以对大面积的样本进行测量。此后，可以使用切换到具有更高放大倍率的物镜，以集中于受关注特定特征，该特征已通过更高放大倍率的光学成像被确定为发出荧光。然后被记录为发出荧光的这些特征可以用激光消融。首先使用较低数值孔径的透镜具有进一步的优点，即景深增加，因此意味着与从一开始就使用较高数值孔径的透镜进行筛查相比，可以更敏感地检测掩埋在样本中的特征。
在使用荧光成像的方法和系统中，从样本到相机的荧光的发射路径可以包括一个或多个透镜和/或一个或多个滤光器。通过包括适于使来自一个或多个荧光标记的选定光谱带宽通过的滤光器，该系统适于处理与来自荧光标记的发射相关的色差。色差是镜头无法将不同波长的光聚焦到同一焦点的结果。因此，通过包括滤光器，减少了光学系统中的背景，并且所得到的光学图像具有更高的分辨率。减少到达相机的不希望波长的发射光量的另一种方法是，通过使用一系列透镜来专门利用透镜的色差，这些透镜被设计用于透射和聚焦滤光器所透射的波长的光，类似于在wo2005/121864中描述的系统。
在光学技术和激光消融采样的这种耦合中，更高分辨率的光学图像是有利的，因为随后光学图像的精度确定了可以引导消融激光来消融样本的精度。
因此，在本文公开的一些实施例中，本发明的设备包含相机。该相机可在线使用以识别样本(例如，特定细胞)的特征/区域，然后该样本可以被消融(或通过lifting解吸——参见下文)，诸如通过在受关注特征/区域发射脉冲群以从受关注特征/区域消融或解吸样本材料块。在脉冲群被引导向样本的情况下，检测到的最终羽状物中的材料可以作为连续事件(来自每个单独消融的羽状物实际上形成单个羽状物，然后继续进行检测)。虽然可以一起分析由受关注特征/区域内的位置的聚集羽状物形成的样本材料的每个云，但是来自每个不同的受关注特征/区域的羽状物中的样本材料仍保持离散。也就是说，在消融受关注不同特征/区域之间留有足够的时间，以允许在开始消融第(n+1)个特征/区域之前允许来自第n个特征/区域的样本材料。
在结合荧光分析和激光消融采样的另一种操作模式下，取代将激光消融定位到那些位置之前分析整个载玻片上的荧光，而是可以将激光脉冲发射到样本上的一个斑点上(低能量以仅激发样本中的荧光部分而不是消融样本)，并且如果检测到预期波长的荧光发射，则可以通过在该斑点以全能量发射激光来消融该斑点处的样本，并且产生的羽状物由检测器进行如下所述的分析。这样做的优点是，可以保持光栅化的分析模式，但可以提高速度，因为可以对荧光进行脉冲和测试，并立即从荧光中获取结果(而不是分析和解释来自检测器的离子数据以确定该区域是否受关注所花费的时间)，再次仅使重要的位点成为分析目标。因此，将这种策略应用于对包含多个细胞的生物样本进行成像时，可以执行以下步骤：(i)用一个或多个不同的标记原子以及一个或多个荧光标记物标记样本中的多个不同目标分子，提供被标记的样本；(ii)用光照射样本的已知位置以激发一种或多种荧光标记；(iii)观察并记录该位置是否有荧光；(iv)如果有荧光，则引导激光消融该位置，以形成羽状物；(v)将羽状物进行电感耦合等离子体质谱法，以及(vi)对样本上一个或多个其他已知位置重复步骤(ii)-(v)，从而检测羽状物中的标记原子可构建已被消融区域的样本的图像。
在一些情况下，可以修改样本或样本载体，以便在特定位置包含光学可检测(例如，通过光学或荧光显微术)的部分。然后可以使用荧光位置将样本定位在设备中。此类标记物位置的使用很有用，例如，可以在视觉上“离线”检查样本——即在除本发明的设备以外的其他设备中进行检查。可以在被突出显示的受关注特征/区域的光学图像及样本被转移到根据本发明的设备中之前，由例如医师用与特定细胞相对应的受关注特征/区域对此类光学图像进行标记。在此，通过参考带注释的光学图像中的标记物位置，本发明的设备可以通过使用相机来识别相应的荧光位置，并相应地为激光脉冲的位置计算消融和/或解吸(lifting)计划。因此，在一些实施例中，本发明包含能够执行上述步骤的定向控制器模块。
在一些情况下，可以基于由本发明的设备的相机拍摄的样本的图像，使用本发明的设备来执行对受关注特征/区域的选择。
本文公开的方法还可以被提供为计算机程序产品，该计算机程序产品包括存储有指令的非暂时性机器可读介质，该指令可以用于对计算机(或其他电子设备)进行编程以执行本文所述的过程。机器可读介质可以包括但不限于硬盘驱动器、软盘、光盘、cd-rom、dvd-rom、rom、ram、eprom、eeprom、磁卡或光卡、固态存储设备、或适于存储电子指令的其他类型的介质/计算机可读介质。因此，本发明还提供了一种机器可读介质，该机器可读介质包含用于执行本文所公开的方法的指令。
光学显微镜
如上所述，自动聚焦传感器可以包括相机(例如，图像传感器)。该相机可以与设备的检查系统(例如，光学显微镜)共享，诸如用于识别激光消融的位置的相机。可替代地，光学显微镜可包括与自动聚焦传感器分离的相机(例如图像传感器)，诸如当自动聚焦传感器具有非相机传感器时。
本申请的光学显微镜可以包括共焦、荧光或明视野/宽视野显微镜。
在某些方面，激光消融采样系统的激光源的焦点可以与自动聚焦系统的自动聚焦组件和自动聚焦传感器共焦。例如，光学显微镜可以与采样系统和自动聚焦系统共焦。采样系统、自动聚焦系统和光学显微镜可以共享至少一些光学组件。
输送导管
输送导管(transferconduit)形成介于激光消融采样系统和电离系统之间的链路，并允许将由样本的激光消融产生的样本材料羽状物从激光消融采样系统传输到电离系统。可以例如通过钻穿合适的材料以形成用于羽状物通过的内腔(例如，具有圆形、矩形或其他横截面的内腔)，来形成输送导管的部分(或全部)。输送导管的内径有时在0.2mm至3mm范围内。有时，输送导管的内径可以沿其长度变化。例如，输送导管的一端可以是锥形的。输送导管的长度有时在1厘米至100厘米的范围内。有时长度不超过10厘米(例如1-10厘米)、不超过5厘米(例如1-5厘米)或不超过3厘米(例如0.1-3厘米)。有时，输送导管内腔沿从消融系统到电离系统的整个距离(或几乎整个距离)是笔直的。其他时候，输送导管内腔在整个距离上都不是笔直的，并改变方向。例如，输送导管可以逐渐旋转90度。这种配置允许通过激光消融采样系统中的样本消融产生的羽状物最初在垂直平面中移动，而输送导管入口处的轴将指向笔直向上，并在其接近电离系统时水平移动(例如，icp炬管通常被水平定向以利用对流冷却)。输送导管可以是笔直的，与进入或形成的羽状物通过的入口孔径的距离为至少0.1厘米、至少0.5厘米或至少1厘米。一般而言，通常，输送导管适于使将材料从激光消融采样系统输送到电离系统所花费的时间最小化。
输送导管入口，包括样本锥(samplecone)
输送导管包含激光消融采样系统中的入口(具体是在激光消融采样系统的样本室内；因此，它也代表了样本室的主要气体出口)。输送导管的入口接收在激光消融采样系统中从样本消融的样本材料，并将该样本材料输送到电离系统。在一些情况下，激光消融采样系统的入口是所有气体沿输送导管流向电离系统的来源。在一些情况下，从激光消融采样系统接收材料的激光消融采样系统入口是导管的壁中的孔径，第二“输送”气体从单独的输送流入口沿着该导管流动(例如，如wo2014146724和wo2014147260中所公开)。在这种情况下，输送气体形成很大比例，并且在许多情况下，大部分气体流向电离系统。激光消融采样系统的样本室包括气体入口。气体通过该入口流入室，通过输送导管的入口产生了从室流出的气体流。该气体流捕获了消融材料的羽状物，并将羽状物夹带到输送导管中(通常，输送导管的激光消融采样系统入口为锥形，在本文中称为样本锥)并从样本室流出，进入穿过室上方的导管。该导管还具有从单独的输送流入口流入其中的气体。包含输送流入口、激光消融采样系统入口并从输送导管开始的组件也可以称为流动池(如在wo2014146724和wo2014147260中)，该输送导管将被消融的样本材料带向电离系统。
输送流至少承担三个角色：它沿电离系统的方向冲洗进入输送导管的羽状物，并防止羽状物材料接触输送导管的侧壁；它在样本表面上方形成“保护区域”，并确保在受控环境下进行消融；并且它增加了输送导管中的流速。通常，捕获气体的粘度低于输送气体的粘度。这有助于将样本材料的羽状物限制在输送导管中心的捕获气体中，并使激光消融采样系统下游的样本材料的羽状物扩散最小化(因为在流的中心，输送速率更加稳定且接近平坦)。气体可以是例如但不限于氩气、氙气、氦气、氮气或这些气体的混合物。常见的输送气体是氩气。氩气特别适合在羽状物到达输送导管壁之前阻止羽状物扩散(并且在电离系统是基于氩气的icp的设备中，它还有助于提高仪器的灵敏度)。捕获气体优选是氦气。然而，捕获气体可以被例如氢气、氮气或水蒸气的其他气体替代或包含它们。在25℃下，氩气的粘度为22.6μpas，而氦气的粘度为19.8μpas。有时，捕获气体是氦气，而输送气体是氩气。
如wo2014169394中所述，样本锥的使用使目标与输送导管的激光消融采样系统入口之间的距离最小化。由于样本与捕获气体可以通过的锥点之间的距离减小，因此可以在减少湍流的情况下提升对样本材料的捕获，并减少消融后的样本材料的羽状物的扩散。因此，输送导管的入口是样本锥顶端的孔径。锥体伸入样本室中。
样本锥的可选修改是使其不对称。当锥对称时，恰在中心处来自各个方向的气流都将被抵消，因此沿着样本表面在样本锥的轴处的总气流为零。通过使锥不对称，沿样本表面会产生非零速度，这有助于从激光消融采样系统的样本室冲洗出羽状物材料。
在实践中，可以采用对样本锥的任何修改，该修改会沿样本表面在锥的轴处导致非零矢量气体流。例如，不对称的锥可包含凹口或一系列凹口，其适于沿样本表面在锥的轴处产生非零矢量气体流。非对称锥可包含在锥侧面中的孔口，该孔口适于沿样本表面在锥的轴处产生非零矢量气体流。该孔口将使锥周围的气体流失衡，从而再次在目标处沿样本表面在锥的轴处产生非零矢量气体流。锥的侧面可以包含一个以上的孔口，并且可以包含一个或多个凹口以及一个或多个孔口。凹口和/或孔口的边缘通常被平滑化、倒圆或倒角，以防止或最小化湍流。
取决于捕获和输送气体的选择及其流速，锥的不对称性的不同方向将适用于不同情况，并且在技术人员的能力范围内可以适当地识别出气体和流速对于每个方向的组合。
如本发明中所使用的，所有以上的适应可以存在于单个非对称样本锥中。例如，锥可以被非对称地截断并且由两个不同的椭圆形锥半部形成，锥可以被非对称地截断并且包含多个孔口中的一个等。
因此，样本锥适于捕获在激光消融采样系统中从样本消融的材料羽状物。在使用中，将样本锥可操作地定位在样本附近，例如，如上所述，通过在可移动样本载体托盘上操纵激光消融采样系统中的样本来进行操作。如上所述，被消融的样本材料的羽状物通过样本锥的窄端处的孔径进入输送导管。孔径的直径可以是：a)可调节的；b)尺寸被设计成能防止消融的羽状物进入输送导管时对其的扰动；和/或c)约等于消融羽状物的横截面直径。
锥形导管(taperedconduits)
在具有较小内径的管中，相同的气体流速以较高的速度移动。因此，通过使用具有较小内径的管，可以以给定的流速更快速地将气流中携带的消融样本材料的羽状物沿限定距离输送(例如，在输送导管中从激光消融采样系统到电离系统)。可以快速分析单个羽状物的关键因素之一是，在从通过消融产生羽状物的时间到在设备的质谱仪组件中检测到其组成离子的时间(检测器上的瞬态时间)期间，羽状物已扩散了多少。因此，通过使用窄的输送导管，消融和检测之间的时间减少了，从而意味着扩散减少了，因为扩散能够发生的时间更少了，最终结果是每个消融羽状物在检测器上的瞬态时间减少了。较短的瞬态时间意味着每单位时间可以产生和分析更多的羽状物，从而更高质量和/或更快速地产生图像。
锥体可以包含输送导管的内径沿着输送导管长度的所述部分逐渐变化(即，管的内径是通过该管截取的横截面，该横截面沿着从朝向入口(在激光消融采样系统端)到出口(在电离系统端)的部分的端部的部分减小)。通常，导管附近发生消融的区域具有相对较宽的内径。锥体之前导管的体积较大，有助于限制消融产生的材料。当消融的颗粒从消融斑点飞离时，它们以高速行进。气体中的摩擦力使这些颗粒变慢，但羽状物仍可在亚毫米范围内扩散到毫米级。与壁之间留有足够的距离，这有助于将羽状物控制在流中心附近。
因为宽的内径部分仅是短的(1-2mm的数量级)，所以如果羽状物在内径较窄的输送导管的较长部分中花费更多的时间，对总的瞬态时间没有明显的影响。因此，较大的内径部分用于捕获消融产物，较小的内径导管用于将这些颗粒快速输送至电离系统。
窄的内径部分的直径由对应于湍流开始的直径限制。可以计算出圆管和已知流的雷诺(reynolds)数。通常，雷诺数大于4000将指示湍流，因此应避免。大于2000的雷诺数将指示过渡流(介于非湍流和湍流之间)，因此也可能需要避免。对于给定质量的气体流，雷诺数与导管的直径成反比。输送导管的窄内径部分的内径通常窄于2mm，例如窄于1.5mm、窄于1.25mm、窄于1mm，但大于导管中每分钟4升氦气流具有大于4000的雷诺数时的直径。
输送导管的恒定直径部分和锥体之间的过渡中的粗糙或甚至有角的边缘可能会在气体流中导致湍流，通常可以避免。
牺牲流(sacrificialflow)
在较高流量下，导管中发生湍流的风险增加。特别是在输送导管具有小内径(例如1mm)的情况下。然而，如果使用轻气体(诸如氦气或氢气)代替传统上用作输送气体流的氩气，则可以在具有小内径的输送导管中实现高速输送(高达300m/s以上)。
高速输送带来了问题，因为这可能导致消融的样本材料的羽状物在没有发生可接受水平的电离的情况下通过电离系统。电离水平可能会下降，因为增加的冷气体流会降低炬管端部的等离子体温度。如果样本材料的羽状物没有被电离到合适的水平，则来自被消融的样本材料的信息将会丢失——因为其成分(包括任何标记原子/元素标签)无法被质谱仪检测到。例如，在icp电离系统中，样本在炬管端部可能很快通过等离子体，以致等离子体离子没有足够的时间作用于样本材料以使其电离。可以通过在输送导管的出口处引入流牺牲系统，来解决由窄内径的输送导管中的高流量、高速输送引起的这个问题。流牺牲系统适于接收来自输送导管的气体流，并且仅将该流的一部分(该流的中心部分包含任何消融的样本材料羽状物)向前传递到通向电离系统的进样器中。为了促进来自输送导管的气体在流牺牲系统中扩散，可以将输送导管出口扩口。
流牺牲系统的位置靠近电离系统，因此从流牺牲系统通向电离系统的管(例如进样器)的长度是短的(例如，～1cm；与输送导管的长度相比，输送导管的长度通常为数十厘米级，例如～50cm)。因此，由于整个输送系统的相对较慢的部分要短得多，因此从流牺牲系统通向电离系统的管内的较低气体速度不会显著影响总输送时间。
在大多数布置中，不希望或在某些情况下不可能显著增加从流牺牲系统传递到电离系统的管(例如进样器)的直径，以此作为降低在体积流率下气体速度的一种方法。例如，在电离系统为icp的情况下，来自流牺牲系统的导管在icp炬管的中心形成进样器。当使用更宽的内径进样器时，信号质量会降低，因为不能将消融的样本材料的羽状物如此精确地注入等离子体的中心(等离子体的中心是最热的，因此是电离效率最高的部分)。强烈优选内径为1mm或更窄的进样器(例如，内径为800μm以下、诸如600μm以下、500μm以下、或400μm以下)。其他电离技术依赖于要在三维空间中以相对小的体积进行电离的材料(因为只能在较小的体积中实现电离所需的能量密度)，因此具有较宽内径的导管意味着通过导管的大部分样本材料在能量密度足以使样本材料电离的区域之外。因此，从流牺牲系统到电离系统的窄直径的管也被用于具有非icp电离系统的设备中。如上所述，如果样本材料中的羽状物没有被电离到合适的水平，则来自被消融的样本材料的信息会丢失——因为成分(包括任何标记原子/元素标签)无法被质谱仪检测到。
泵送可用于帮助确保牺牲流与进入电离系统入口的流之间的期望分流比。因此，有时，流牺牲系统包含附接到牺牲流出口的泵。可以将受控节流器添加到泵中，以控制牺牲流。有时，流牺牲系统还包含适于控制节流器的质量流控制器。
在使用昂贵的气体的情况下，可以使用已知的气体净化方法对从牺牲流出口泵出的气体进行净化并循环回同一系统中。如上所述，氦气特别适合作为输送气体，但价格昂贵。因此，减少氦气在系统中的损失是有利的(即，当氦气进入电离系统并被电离时)。因此，有时将气体净化系统连接到流牺牲系统的牺牲流出口。
电离系统
为了产生元素离子，有必要使用一种硬电离技术，该技术能够蒸发、雾化和电离被雾化的样本。
电感耦合等离子体炬
本申请的设备可以进一步包括电感耦合等离子体(icp)炬，或者可以耦合至icp炬。例如，本申请的设备可以进一步包括icp质谱仪(icp-ms)。
通常，在将要分析的材料传递到质量检测器进行分析之前，使用电感耦合等离子体将材料电离。它是一种等离子源，其中能量由电磁感应产生的电流提供。电感耦合等离子体维持在由三个同心管组成的炬中，最里面的管被称为进样器。
提供维持等离子体的电磁能的感应线圈位于炬的输出端周围。交变电磁场每秒会反转极性数百万次。在两个最外面的同心管之间供应氩气。通过放电引入自由电子，然后在交变电磁场中加速，然后它们与氩原子碰撞并使它们电离。在稳态下，等离子体主要由氩原子组成，并带有一小部分的自由电子和氩离子。
icp可以保留在炬中，因为两个最外管之间的气流使等离子体远离炬的壁。在进样器(中心管)和中间管之间引入的第二氩气流使等离子体保持远离进样器。将第三气流引入到炬中心的进样器中。通过进样器将要分析的样本引入等离子体中。
icp可以包含内径小于2mm且大于250μm的进样器，用于将样本中的材料引入等离子体中。进样器的直径是指在接近等离子体的端部处的进样器的内径。远离等离子体延伸，进样器可以具有不同的直径，例如更宽的直径，其中直径的差异是通过直径的逐步增加或由于进样器沿其长度呈锥形而实现的。例如，进样器的内径可以在1.75mm和250μm之间，诸如直径在1.5mm和300μm之间、直径在1.25mm和300μm之间、直径在1mm和300μm之间、直径在900μm和300μm之间、直径在900μm和400μm之间，例如直径为850μm左右。内径小于2mm的进样器与直径较大的进样器相比，具有明显的优点。此特征的一个优点是，使用较窄的进样器可减少在将样本材料的羽状物引入等离子体时在质量检测器中检测到的信号的瞬变(样本材料的羽状物是特定及气态的材料云团，其已通过激光消融采样系统从样本中去除)。因此，减少了从将样本材料的羽状物被引入icp中进行电离直到在质量检测器中检测到最终离子的分析所花费的时间。分析样本材料的羽状物所花费的时间减少使得在任何给定时间段内都可以检测到更多的样本材料的羽状物。同样，具有较小内径的进样器可将样本材料更准确地引入到电感耦合等离子体的中心，在中心处发生更有效的电离(与直径更大的进样器相比，进样器可将样本材料更多地引入到等离子体的边缘，在该处电离效率不高)。
icp炬(agilent、varian、nuinstruments、spectro、leemanlabs、perkinelmer、thermofisher等)和进样器(例如，来自elementalscientific和meinhard)是可获得的。
其他电离技术
电子电离
电子电离涉及用电子束轰击气相样本。电子电离室包括电子源和电子陷阱。电子束的典型来源是铼或钨丝，通常以70电子伏特的能量工作。可从markesinternational获得用于电子电离的电子束源。电子束指向电子陷阱，并且平行于电子行进方向施加的磁场使电子以螺旋路径行进。气相样本被引导通过电子电离室，并与电子束相互作用形成离子。电子电离被认为是一种困难的电离方法，因为该过程通常会导致样本分子碎裂。可商购获得的电子电离系统的实例包括高级马库斯电子电离室(advancedmarkuselectronionisationchamber)。
基于激光消融的采样和电离系统的可选其他组件
离子偏转器
质谱仪在离子碰到检测器表面时会检测它们。离子与检测器的碰撞会导致电子从检测器表面释放出来。这些电子在通过检测器时会倍增(第一个释放的电子在检测器中敲除其他电子，然后这些电子撞击次级板，从而进一步增大电子数)。撞击检测器阳极的电子数量产生电流。可以通过改变施加到次级板上的电压来控制撞击阳极的电子数量。电流是一个模拟信号，该信号然后可以通过模数转换器将其转换为击中检测器的离子计数。当检测器在其线性范围内运行时，电流可以直接与离子数相关。一次可以检测到的离子数量有一个限制(可以表示为每秒可检测到的离子数量)。在此之上，离子撞击检测器释放的电子数量不再与离子数量相关。因此，这对检测器的定量能力设置了上限。
当离子撞击检测器时，其表面会被污染损坏。随着时间的流逝，这种不可逆的污染损害会导致当离子撞击检测器时，检测器表面释放的电子更少，最终结果是需要更换检测器。这被称为“检测器老化”，是ms中的一种众所周知的现象。
因此，可以通过避免将过量的离子引入ms中来延长检测器的寿命。如上所述，当撞击ms检测器的离子总数超过检测上限时，由于离子不再定量，因此信号不如离子数量低于上限时提供的信息多。因此，希望避免超过检测上限，因为这会导致检测器加速老化而不会产生有用的数据。
通过质谱分析大量离子涉及正常质谱中未发现的特定挑战。具体地，典型的ms技术涉及将低且恒定水平的材料引入检测器中，其不应接近检测上限或导致检测器的加速老化。另一方面，基于激光消融和解吸的技术可在ms的非常短的时间窗口内分析相对大量的材料：例如，从组织样本的细胞尺寸的贴片中提取的离子比通常在ms中分析的小包离子大得多。实际上，这是检测器的故意几乎过载，分析的是由于消融或提升引起的离子堆积。在两次分析事件之间，信号处于基线状态(信号接近零，因为没有故意将来自标记原子的离子从采样和电离系统进入ms；一些离子将不可避免地被检测到，因为ms不是完全真空)。
因此，在本文所述的设备中，存在加速检测器老化的风险，因为来自被大量可检测原子标记的电离样本材料包中的离子，可能会超过检测上限并损坏检测器而没有提供有用的数据。
为了解决这些问题，该设备可以包含位于采样和电离系统与检测器系统(质谱仪)之间的离子偏转器，该离子偏转器可操作以控制离子进入质谱仪。在一种布置中，当打开离子偏转器时，将从采样和电离系统接收的离子偏转(即，离子的路径已被更改，因此它们不会到达检测器)，但是当偏转器关闭时，离子将不会被偏转并到达检测器。离子偏转器的部署方式将取决于采样和电离系统以及设备的ms的布置。例如，如果离子进入ms的通道与离开采样和电离系统的离子路径不直接一致，则默认情况下将打开适当布置的离子偏转器，以引导来自采样和电离系统的离子进入ms。当检测到由被认为可能会使ms超载的电离样本材料包的电离引起的事件时(请参见下文)，离子偏转器被关闭，因此来自该事件的其余电离材料不会被偏转到ms中而是可以简单地撞击系统的内部表面，从而延长了ms检测器的使用寿命。在防止了来自破坏性事件的离子进入ms之后，离子偏转器返回到其原始状态，从而使来自随后被电离的样本材料包中的离子进入ms并被检测到。
可替代地，(在正常操作条件下)从采样和电离系统中出来的离子在进入ms之前方向不变的布置中，离子偏转器将关闭，而来自采样和电离系统的离子将穿过它以在ms中进行分析。为了防止在检测到检测器潜在过载时造成损坏，在这种配置下，将打开离子偏转器，然后转移离子，使离子不会进入检测器，以防止损坏检测器。
通过样本材料的电离(诸如由激光消融或解吸产生的材料羽状物)进入ms的离子不会同时全部进入ms，而是以具有遵循围绕最大频率的概率分布曲线的频率的峰的形式进入ms：从基线开始，起初少量离子进入ms并被检测到，然后离子的频率增加到最大，然后离子数量再次减少并下降到基线。可以识别出可能损坏检测器的事件，因为不是峰值处前沿的离子频率缓慢增加，而是击中检测器的离子数量迅速增加。
在分析电离的样本材料包中的离子期间，撞击tofms检测器(以下将讨论的一种特殊类型的检测器)的离子流不是连续的。tof包含脉冲器，该脉冲器以脉冲组的形式定期将离子释放到tofms的飞行室中。通过在已知的同时全部释放离子，可以确定飞行时间质谱。用于确定飞行时间质谱确定的离子脉冲释放之间的时间被称为tofms的提取或推送。推送的时间为微秒级。因此，来自采样和电离系统的一个或多个离子包的信号覆盖了许多推送。
因此，当一次推送中离子计数读数从基线跃升到很高的计数值时(即离子的第一部分来自特定的被电离的样本材料包)，则可以预测出样本材料包电离所产生的离子主体将更大，因此超过了检测上限。在这一点上，可以操作离子偏转器以确保将有害的大部分离子引导远离检测器(通过激活或去激活，取决于系统的布置，如上所讨论的)。
基于四极的合适的离子偏转器在本领域中是可获得的(例如，可以从colutronresearchcorporation和dreebitgmbh获得)。
b.基于解吸的采样和电离系统
基于解吸的分析仪通常包含三个组件。第一个是解吸系统，用于从样本中产生样本材料块以进行分析。在可以检测到解吸的样本材料块中的原子(包括以下讨论的任何可检测的标记原子)之前，必须将样本电离(并雾化)。因此，该设备包含第二组件，该第二组件是电离系统，该电离系统使原子电离以形成元素离子，从而能够基于质荷比通过ms检测器组件(第三组件)对其进行检测。基于解吸的采样系统和电离系统通过输送导管连接。在许多情况下，基于解吸的采样系统也是基于激光消融的采样系统。
解吸采样系统
在一些情况下，不是使用激光消融来产生样本材料的颗粒状和/或汽化羽状物，在没有实质改变样本并将其转化为样本小颗粒和/或汽化的情况下，从样本所位于的样本载体解吸大块体的样本材料(例如参见wo2016109825的图8和所附描述，其通过引用并入本文)。在本文中，术语“块(slug)”用于指代该解吸材料(本文讨论的样本材料包的一种特定形式)。块的尺寸可以为10nm至10μm、100nm至10μm，并且在某些情况下可以为1μm至100μm。该过程可以被称为样本弹射。通常，块代表单个细胞(在这种情况下，该过程可以被称为细胞弹射)。
从样本释放的样本材料块可以是一部分样本，该部分样本已在解吸步骤之前被切成单独的块用于解吸，可选地在将样本插入设备之前的过程中。在分析之前将样本分为离散的块，这称为结构化样本。因此，这些单个块中的每一个都代表样本的离散部分，该离散部分可以在设备中解吸、电离和分析。通过分析来自离散位点的块，可以以与通过上述激光消融采样系统消融的样本的每个位置相同的方式来构建图像，其中每个块代表图像的像素。
可以通过各种方法制备结构化样本。例如，可以使用包含被配置为切割生物样本的形态特征的样本载体。此处，将生物样本施加到载体的表面上，这将导致切割形态特征并对样本进行切片，进而使生物材料的部分被特征之间的多个离散位点保留，从而提供结构化生物样本。可替代地，样本载体可以不包含此类形态特征(实际上，平坦的表面，如显微镜载玻片，可选地如下所述进行功能化)，在这种情况下，可以将样本施加到样本载体上，并且可以对样本进行切片以限定可以被解吸用于电离和分析的样本块。如果样本是组织切片，则可以通过诸如刀片或印戳的机械工具来完成样本的切片。可替代地，可以在相同或单独的样本制备设置中通过激光消融去除待解吸的样本切片周围的材料。在某些技术中，可以通过采用聚焦电子或离子束的设置来去除材料。聚焦的电子束或离子束会导致分段切片之间的切口特别窄(可能在10nm级别)，从而导致像素大小为1μm级，在某些情况下为100nm。
可以从载体释放样本材料的块，并且样本材料的每个离散部分依次作为离散事件被引入检测器中进行分析(通过以下讨论的技术产生图像的像素)。与在常规质谱分析或质谱分析中随机引入生物样本相比，按顺序引入离散材料的益处包括更高的样本处理速率。这是因为该块优选作为单件物质从样本室输送到电离系统，因此无法像消融材料的羽状物一样在气体流(特别是其中存在湍流的气体流)中扩散。
用于采样的解吸
可以通过热能、机械能、动能以及前述任何一种的组合从样本中解吸样本材料。这种采样特别适用于分析生物样本。
在某些情况下，可以通过热机制从样本中释放样本材料。例如，样本载体的表面变得足够热以解吸样本材料块。可以用例如聚萘二甲酸乙二醇酯(pen)聚合物或pmma聚合物膜，涂覆样本载体以促进块解吸过程。热量可以由辐射源提供，诸如激光(例如上面讨论的激光消融采样系统的激光)。施加到表面的能量应该足以解吸生物材料，如果来自生物样本，则优选不改变样本材料。可以使用任何合适的辐射波长，辐射波长可以部分取决于样本载体的吸收特性。样本载体的表面或层可以涂覆有吸收剂或包括吸收剂，该吸收剂吸收激光辐射以转换成热。辐射可以被传递到载体的除了样本所位于的表面之外的表面，或可以诸如通过载体的厚度被传递到承载样本的表面。被加热的表面可以是样本载体的多层结构的表面层或可以是内部层。使用激光辐射能量的一个实例是一种被称为lifting(laserinducedforwardtransfer；参见例如doraiswamy等人，2006，appliedsurfacescience，52:4743-4474；fernández-pradas，2004，thinsolidfilms453-454:27–30；kyrkis等人，recentadvancesinlaserprocessingofmaterials，perriere等人编，2006，elsivier)的技术，其中样本载体可以包含解吸膜层。解吸膜可以吸收辐射以引起解吸膜和/或生物样本的释放(例如，在一些情况下，样本膜从样本载体与生物样本一起解吸，在其他情况下，膜保持附着到样本载体，生物样本从解吸膜解吸)。
加热解吸可以在纳秒、皮秒或飞秒的时间范围内进行，具体取决于用于解吸的激光。
样本可以通过可裂解的光反应性部分附接至样本载体。在用辐射(例如来自激光消融采样系统的激光系统中的激光)照射可裂解的光反应性部分后，该光反应性部分可以裂解以释放样本材料。样本载体可以包含(i)将样本偶联至样本载体的可裂解的光反应性部分，以及(ii)如上所述的解吸膜。在这种情况下，第一激光辐射脉冲可用于引起光反应性部分的裂解，第二激光辐射脉冲可用于靶向解吸膜，从而通过提升使样本与样本载体分离(或通过其他方式引入的热能脉冲可用于加热解吸膜，从而导致样本材料与样本载体分离)。第一脉冲和第二脉冲可以具有不同的波长。因此，在一些方法中(例如，包含消融和解吸两者)，样本与样本载体的分离可能涉及多个不同波长的激光脉冲。在一些情况下，可以通过相同的激光脉冲来完成光反应性部分的裂解和提升。
样本载体可以包括化学反应性物质的涂层或层，其赋予样本动能以从表面释放样本。例如，化学反应性物质可以释放气体，诸如，例如h2、co2、n2或氢氯氟烃。此类化合物的实例包括起泡剂和发泡剂，它们在加热时释放出气体。气体的产生可用于将动能传递给解吸的样本材料，从而可提高材料的重现性和释放方向。
样本载体可以包含光引发的化学反应物，其发生放热反应以产生热量以解吸样本材料。上面段落中讨论的载体涂层，或者实际上是该载体中的特定化学链接(被激光照射以从载体中释放样本材料块)是可以被激光辐射波长靶向的材料的实例。
通常，在进行消融时，消融的位置被解析为单独的、不重叠的斑点。然而，当使用解吸作为将样本材料引入设备的手段时，则可以使用重叠的斑点，例如以确保去除在特定位置将样本锚定到样本载体的所有解吸膜。本发明人已经发现，利用单个激光脉冲来解吸细胞，该激光脉冲具有足够大的斑点尺寸以从样本载体完全解吸细胞，这通常会导致材料块的破裂。一旦样本材料块分解成较小的部分，消融块中的材料的瞬态时间就会增加，这是因为随着从样本被解吸的室穿过输送导管、到达电离系统、然后到检测器上，材料不可避免地扩散开来。因此，如果样本是例如细胞涂片，则保持解吸的块的完整性使得能够以最快的速率分析消融的块，这意味着最快的细胞分析速率。单个细胞作为离散块而解吸，通常保持其完整性，直到电离，提供了机会以与cytof(fluidigm，美国加利福尼亚州)分析液体溶液中的细胞的速率相似的速率，分析载玻片中的单个细胞。然而，从载玻片上解吸单个细胞提供了附加的优点，即可以首先在视觉上分析细胞，因此意味着可以选择受关注细胞以及例如可以排除错误的细胞类型的细胞，从而提高分析效率。此外，这意味着可以选择要解吸的材料块，使得它们实际上是单个细胞。有时，在分析液体样本时，细胞会成簇地聚集在一起，成为更高多聚体的双联体、三联体，或偶然地，由于样本引入过程，可能会在同一事件中分析两个离散的细胞。因此，来自两个以上细胞的原子一起进入电离和检测系统，不仅导致结果不准确，而且由于ms检测器的过载而可能导致设备损坏。
通常，受关注的样本特征/区域并不代表很容易隔离解吸的离散位置上的离散实体，诸如孤细胞。相反，受关注细胞可能被其他不需要或不期望被分析的细胞或材料所包围。因此，尝试进行受关注特征/区域的解吸(例如，提升)可能会同时解吸受关注细胞和周围材料。来自被承载于除受关注特定特征/区域(例如细胞)之外的解吸材料块中的样本周围区域(例如来自已被标记的其他细胞)的原子，诸如元素标签中使用的标记原子(参见下文讨论)，可能因此会污染受关注位置的读数。
消融和解吸(诸如通过提升)技术可以组合在一个方法中。例如，为了在样本载体上的生物样本(例如组织切片样本或细胞悬液分散液)上进行受关注特征/区域(例如细胞)的精确解吸，可以使用激光消融来消融受关注细胞周围的区域，以清除其他材料。在通过消融清除周围区域之后，可以从样本载体解吸受关注特征/区域，然后进行电离，并按照标准质谱仪或质谱仪程序通过质谱仪进行分析。与以上讨论一致，可选地在已经使用消融来清除将被解吸的位置周围的区域之后，可以使用热、光解、化学或物理技术从受关注特征/区域解吸材料。通常，采用提升的方式将材料块与样本载体分离(例如，上面已经涂覆了解吸膜以辅助提升过程的样本载体，如上面关于离散的样本材料块的解吸所讨论的)。
因此，本发明提供了一种分析样本的方法，方法包含：
(i)执行本发明的方法以将样本放置在激光的焦点处用于激光消融；
(ii)使用被引导到样本台上的样本的激光辐射来解吸样本材料块；以及
(iii)电离样本材料块，并通过质谱法检测块中的原子。
样本可以在样本载体上，并且在一些情况下，激光辐射被引导通过样本载体以从样本载体解吸样本材料块。
在一些实施例中，该方法另外包含在步骤(i)之前对样本进行激光消融。有时，样本的消融会产生一个或多个样本材料羽状物，该羽状物会被单独电离，并通过质谱法检测羽状物中的原子。有时，该方法进一步包含在步骤(i)之前的附加步骤，该附加步骤用一个或多个不同的标记原子/元素标签标记样本中的多个不同目标分子，以提供标记的样本。在该方法的一些变体中，使用激光消融来消融受关注特征/区域周围的材料，以在将受关注特征/区域中的样本材料作为材料块从样本载体上解吸之前清除周围区域。
可以在执行激光消融和解吸(例如通过提升)之前通过另一种技术来识别受关注特征/区域。包括相机(诸如，基于电荷耦合器件的图像传感器(ccd)相机或cmos相机或基于有源像素传感器的相机)或前述部分中所述的任何其他光检测装置是启用这些技术的一种方式，用于在线和离线分析。相机可用于扫描样本以识别特别受关注细胞或特别受关注特征/区域(例如，特定形态的细胞)。一旦确定了此类位置，就可以在将激光脉冲引导到受关注特征/区域周围的区域之后提升位置，以便在提升位置(例如细胞)之前通过消融清除其他材料。该过程可以是自动化的(系统可以识别、消融和提升受关注特征/区域)或半自动化的过程(系统的用户，例如临床病理学家，可以识别受关注特征/区域，然后系统将以自动方式执行消融和提升)。这可以显著提高进行分析的速度，因为不需要消融整个样本来分析特定细胞，而是可以对受关注细胞进行特异性消融。
相机可以记录来自显微镜(例如共焦显微镜)的图像。可以通过光学显微镜进行识别，例如通过检查细胞形态或细胞尺寸，或关于该细胞是否为离散的单个细胞(与成簇的细胞的成员相反)。有时，可以对样本进行特殊标记，以识别受关注特征(例如细胞)。如上文关于消融视觉识别的受关注特征/区域的方法所讨论的，通常，荧光标记物被用于特异性地染色受关注细胞(诸如通过使用标记的抗体或标记的核酸)；为了简洁起见，在此不完整重复该部分，但是本领域的技术人员将立即理解，那些方法的特征可以应用于基于解吸的方法，并且这在本文档的技术教导之内。高分辨率光学图像在光学技术和提升的这种偶联中是有利的，因为光学图像的精度随后确定了消融激光源可以被引导以消融受关注细胞周围区域的精度，该区域随后可以被解吸。
本发明还提供了一种分析包含多个细胞的样本的方法，该方法包含以下步骤：
(i)用一个或多个不同的标记原子标记样本中的多个不同的目标分子，以提供标记的样本；
(ii)照射样本以识别一个或多个受关注特征；
(iii)记录样本上的一个或多个受关注特征的位置信息；
(iv)使用受关注特征的位置信息从受关注特征解吸样本材料块，包含在使用激光辐射将样本材料块从该位置解吸之前，首先进行激光消融以使用激光辐射去除受关注特征周围的样本材料，其中激光辐射被引导到样本上；
(v)将被解吸的样本材料块电离；以及
(vi)对电离的样本材料进行质谱分析，以检测样本材料中的标记原子，
其中使用本发明的自动聚焦方法将用于解吸样本材料块的激光辐射聚焦在样本上。
本发明还提供了上述方法的变体，例如，一种执行包含多个细胞的质量细胞计数的方法，该方法包含以下步骤：
(i)用一个或多个不同的标记原子以及一个或多个荧光标记物标记样本中的多个不同目标分子，以提供标记的样本；
(ii)用激光辐射照射样本以激发一种或多种荧光标记；
(iii)基于荧光图案记录样本的一个或多个位置的位置信息；
(iv)使用基于荧光图案的位置信息从受关注特征解吸样本材料块，包含使用激光辐射将样本材料块从该位置解吸之前，首先进行激光消融以使用激光辐射去除受关注特征周围的样本材料，其中激光辐射被引导到样本上；
(v)将被解吸的样本材料块电离；以及
(vi)对电离的样本材料进行质谱分析，以检测样本材料中的标记原子，
其中使用本文所述的自动聚焦方法将用于解吸样本材料块的激光辐射聚焦在样本上。
有时，没有记录用于清除待解吸位置(例如受关注细胞)周围区域的消融的数据。有时，根据周围区域的消融来记录数据。可以从周围区域获得的有用信息包括周围细胞和细胞间环境中存在哪些目标分子，诸如蛋白质和rna转录物。当对实体组织样本进行成像时，这可能会特别受关注，在这种情况下，直接的细胞与细胞之间的相互作用是常见的，周围细胞中表达的蛋白质等可能对受关注细胞的状态提供信息。
相机
在基于解吸的采样系统中使用的相机可以如以上所述用于基于激光消融的采样系统，并且对于基于激光消融的采样系统的相机的讨论应该在这里被阅读。
样本室
基于解吸的采样系统中使用的样本室可以如以上所述用于基于激光消融的采样系统。在对样本材料块进行采样的情况下，本领域技术人员将理解，可能需要增加气体流量以确保该材料块被夹带在气体流中并被携带到输送导管中以传输至电离系统。
输送导管
基于解吸的采样系统中使用的样本室可以如以上所述用于基于激光消融的采样系统。在对大样本材料块进行采样的情况下，本领域技术人员将意识到，导管内腔的直径将需要适当地设置尺寸以容纳任何块，而该块不接触内腔的侧面(因为任何接触可能导致块碎裂，并导致信号重叠——导致第n个解吸事件的块中的原子散布到第n+1个或后续块的检测窗口中)。
基于解吸的系统的电离系统
在许多情况下，上面讨论的提升技术涉及去除相对大的样本材料块(10nm至10μm、从100nm至10μm、在某些情况下从1μm至100μm)，这些样本材料尚未转换成颗粒状和气态材料。因此，需要一种能够汽化和雾化这种相对大量的材料的电离技术。
电感耦合等离子体炬
一种此类合适的电离系统是电感耦合等离子体，如以上在第57页开始的部分中已经关于基于激光消融的采样和电离系统所讨论的。
基于解吸的采样和电离系统的可选的其他组件
离子偏转器
在基于解吸的采样系统中使用的离子偏转器可以如以上所述用于基于激光消融的采样系统。考虑到基于解吸的采样有可能去除完整的大样本材料块，在这种用于保护检测器的系统中，离子偏转器尤其有用。
c.激光解吸/电离系统
在某些方面，采样系统可以是激光解吸系统。基于激光解吸/电离的分析仪通常包含两个组件。第一个是用于从样本产生离子以进行分析的系统。在这种设备中，这是通过将激光束引导到样本上以产生离子来实现的；在本文中，它被称为激光解吸离子产生系统。这些喷射的样本离子(包括如下所述的来自标记原子的任何可检测到的离子)可以由检测器系统(第二组件)例如质谱仪(检测器将在下面更详细地讨论)进行检测。这项技术称为激光解吸/电离质谱(ldi-ms)。ldi与下面更详细讨论的基于解吸的采样系统不同，因为在基于解吸的采样系统中，样本材料被解吸为带电荷的中性材料块，随后该材料块被电离以形成元素离子。相反，在此，由于激光照射样本而直接产生离子，因此不需要单独的电离系统。
激光解吸离子产生系统包含：激光器；样本室，用于容纳样本，来自激光的辐射被引导到该样本上；以及离子光学器件，可以吸收从样本产生的离子，并将离子引导至检测器进行分析。因此，本发明提供了一种用于分析样本的设备，该设备包含：a.用于容纳样本的样本室；b.激光，适于从样本解吸和电离材料，形成离子；c.离子光学器件，被布置为对由解吸电离形成的离子进行采样，并引导它们朝向检测器远离样本；以及d.检测器，接收来自所述离子光学器件的离子并分析所述离子。在一些实施例中，该设备包含激光，该激光适于解吸和电离来自样本的材料以形成元素离子，并且其中检测器从采样和电离系统接收元素离子并检测元素离子。在某些情况下，ldi是矩阵辅助的(即maldi)
在此过程中，一些分子达到了一定的能级，在该能级上它们从样本解吸并被电离。离子可能由于激光照射而直接作为初级离子出现，也可能作为次级离子出现，这些次级离子是由电荷中性物质与初级离子的碰撞(例如质子转移、阳离子化和电子捕获)形成的。在一些情况下，如下所述，在制备样本时通过添加到样本中的化合物(例如基质)来辅助电离。
激光器
各种不同的激光器可以用于ldi，包括以上关于激光消融采样系统的激光所讨论的商用激光器，这些激光器根据需要适于使离子解吸。因此，在一些实施例中，该设备包含激光器，该激光器适于从样本解吸和电离材料，形成元素离子，并且其中检测器从采样和电离系统接收元素离子，并且适于检测元素离子。有时，该设备包含激光器，该激光器适于从样本解吸和电离材料，从而形成分子离子，并且其中检测器从采样和电离系统接收分子离子，并且适于检测分子离子。在其他情况下，该设备包含激光器，该激光器适于从样本解吸和电离材料，从而形成元素离子和分子离子，并且其中检测器从采样和电离系统接收离子，并且适于检测元素离子和分子离子两者。
示例性激光器包括在193nm、213nm或266nm处发射的那些激光器(深紫外激光器，其可以导致离子从样本释放，而无需基质来促进电离，如在maldi中)。lepogam等人(2016)(scientificreports6，文章编号：37807)描述了在355nm处进行样本在激光辐照后表示地衣代谢物的离子的解吸。
如上所述的飞秒激光器在特定的ldi应用中也是有利的。
为了快速分析样本，需要高频率的消融，例如大于200hz(即每秒多于200个激光发射，每秒产生多于200个离子云)。通常，由激光系统产生的离子云的频率为至少400hz，诸如至少500hz、至少1khz、至少10khz、至少100khz或至少1mhz。例如，激光系统的消融频率在200hz-1mhz范围内、在500hz-100khz范围内、在1khz-10khz范围内。
如上面关于激光消融采样系统的解释，激光辐射可以经由各种光学组件被引导到样本，并聚焦到100μm以下的斑点尺寸(即，激光辐射撞击到样本上时的激光束尺寸)，诸如50μm以下、25μm以下、20μm以下、15μm以下、或10μm或1μm以下。当用于分析包括组织切片的生物样本时，为了分析单个细胞，所用激光束的斑点尺寸将取决于细胞的尺寸和间距。例如，如果要进行单细胞分析，则在细胞彼此紧紧堆积在一起的情况下(诸如在组织切片中)，激光斑点的斑点尺寸不大于这些细胞。该尺寸将取决于样本中的特定细胞，但通常用于ldi的激光斑点的直径应小于4μm，例如在0.1-4μm、0.25-3μm或0.4-2μm的范围内。为了以亚细胞分辨率分析细胞，ldi系统使用的激光斑点尺寸不大于这些细胞，更具体地说，是使用可以消融具有亚细胞分辨率的材料的激光束斑点尺寸。有时，可以使用尺寸大于细胞尺寸的斑点进行单细胞分析，例如将细胞散布在载玻片上，并在细胞之间留出空间。因此可适当地选择所使用的特定斑点尺寸，取决于被分析的细胞的尺寸。在生物样本中，细胞很少都具有相同的尺寸，因此，如果需要亚细胞分辨率成像，并且在整个离子产生过程中保持恒定的斑点尺寸，则激光斑点尺寸应小于最小的细胞。
样本室
ldi系统的样本室与上述基于激光消融和基于解吸的采样系统的样本室具有许多共同点。它包含用于支撑样本的载物台。该载物台可以是可在x-y或x-y-z轴上移动的平移载物台。样本室还将包含出口，通过激光辐射从样本去除的材料可以被引导通过该出口。出口连接到检测器，使得能够分析样本离子。
样本室可以处于大气压下。在大气压下的ldi(具体是maldi)是已知的。在此，辅助ldi产生的离子通过气体(例如氮气)的气动流从电离输送到高真空区域用于分析(例如ms检测器)(laiko等人,2000,anal.chem.,72:652–657)。
在一些情况下，样本室被保持在真空或部分真空下。因此，在一些情况下，样本室压力低于50000pa、低于10000pa、低于5000pa、低于1000pa、低于500pa、低于100pa、低于10pa、低于1pa、约0.1pa或小于0.1pa，诸如0.01pa以下。例如，部分真空压力可以为约200-700pa，并且真空压力为0.2pa以下。
如本领域技术人员将理解的，样本压力是否在(部分)真空下处于大气压的选择，取决于所执行的特定分析。例如，在大气压下，样本处理更容易，并且可以应用更软的电离。此外，可能需要气体分子的存在，以便能够发生碰撞冷却的现象，当标记物是大分子时，这可能是受关注的，不希望其断裂，例如包含标记原子或其组合的分子片段。
将样本室保持在真空状态可以防止ldi产生的样本离子与室内的其他粒子发生碰撞。在一些情况下，这可能是优选的，因为与室中的气体分子的碰撞可能会导致所产生的样本离子带走电荷。样本离子的电荷损失将导致设备无法检测到它们。
在一些实施例中，样本室包含一个或多个气体端口，气体端口被布置成使得在激光解吸/电离期间能够将一种或多种气体流输送到样本上的激光解吸/电离的位置，诸如其中一个或多个气体端口为喷嘴的形式。气体端口(例如喷嘴)可操作以在解吸和电离的时刻输送气体，为被解吸的离子提供碰撞冷却，但仅在该特定时间。在其余时间中，它们不会将气体引入室，从而减少了真空泵上的应变。
离子光学器件
样本离子束是通过位于样本附近的静电板从样本捕获的，在本领域中称为引出电极。引出电极从样本的局部去除通过激光消融解吸的样本离子。这通常是通过放置在也起作用的板上的样本和电极(样本电极)以及电压电位差大的引出电极来实现的。根据样本相对于引出电极的极性，带正电或负电的二次离子会被引出电极捕获。
在一些实施例中，在激光解吸/电离期间，跨电极的电荷是恒定的。有时，电荷在解吸/电离后发生变化，例如延迟提取，其中在由激光脉冲引起的解吸/电离后的短时间延迟之后施加加速电压。此技术可对离子能量散布产生飞行时间补偿，其中动能较大的离子比动能较低的离子以更快的速度从样本移向检测器。因此，这种速度差异会导致检测器的分辨率降低，因为并非所有离子都以相同的速度移动。因此，通过延迟在样本电极和引出电极之间施加电压，当施加加速电压时，动能较低的那些离子仍保持更靠近样本电极，因此与距目标电极更远的离子相比，它们以更大的电势开始加速。在适当的延迟时间下，较慢的离子将被充分加速，以捕获在离开脉冲加速系统一定距离后进行激光解吸/电离后具有较高动能的离子。然后，相同质荷比的离子将同时通过飞行管漂移到检测器。因此，在一些实施例中，样本电极和提取电极是可控制的，以在激光短路后的设定时间在电极上施加电荷，从而引起样本的解吸/电离。
然后，样本离子通过一个或多个其他静电透镜(在本领域中称为转移透镜)转移至检测器。转移透镜将样本离子束聚焦到检测器中。通常，在具有多个转移透镜的系统中，给定分析中仅使用一个转移透镜。每个透镜可以提供样本表面的不同放大率。通常，在电极和检测器之间存在其他离子操纵组件，例如一个或多个孔径、质量过滤器或一组偏转板。电极、转移透镜和任何其他组件共同构成离子光学器件。用于产生合适的离子光学布置的组件可以从商业供应商处获得，例如agilent、waters、bruker，并且可以由本领域技术人员适当地定位，以将离子递送到检测器，如下文所述。
除了下面讨论的检测器外，由于可以执行ldi从而导致软电离(例如，电离不会破坏所分析的分子中的键)，在一些情况下，检测器可以是串联ms，其中在将选定的离子分解成碎片并进行第二次m/z分离(碎片随之被检测)之前，先进行第一次m/z分离从样本选择离子。
采用ldi的方法
本发明还提供了使用ldi分析生物样本的方法。在此分析中，用标记物标记细胞，然后在样本进行ldi后产生的离子中检测到这些标记物。因此，本发明提供了一种用于对包含多个细胞的样本进行质量细胞计数的方法，方法包含：a.用一种或多种不同的标记物标记样本中的多个不同的目标分子，以提供标记的样本；b.进行样本的激光解吸/电离，其中在多个位置处进行激光解吸/电离以形成多个单独的离子云；以及c.对离子云分别进行质谱分析，从而检测羽状物中的标记物可以构建样本的图像，可选地，其中多个位置是多个已知位置。
在一些实施例中，一个或多个标记物包含标记原子。在这种情况下，标记的作用如下文所述，其中特异性结合对的成员(例如与蛋白抗原结合的抗体，或与样本中的rna结合的核酸)附接到包含一个或多个标记原子的元素标签(例如镧系元素和锕系元素)。元素标签可以仅包含单一类型的标记原子(例如，特定元素的单个同位素的一个或多个原子)，也可以包含不同的多种标记原子(例如，不同的元素/同位素)，从而使得作为特定组合元素/同位素产生的大量不同的标签用作标记物。在一些情况下，标记原子被检测为元素离子。在一些实施例中，标记原子在分子离子内从样本发射。因此，代替在质量通道中检测标记原子，将在分子离子的质量通道中检测样本中标记材料的存在(即，通过分子的质量减去标记原子，将简单地变换质量通道，相对于单独的标记原子)。然而，在一些实施例中，含有标记原子的分子可以在不同的标记原子之间变化。在那种情况下，含有分子残基和标记原子的离子将经受碎片化方法的处理，从而针对每种试剂产生更一致的质量峰，诸如通过串联ms的应用。对主要ldi成像质谱流式方案进行所有这些更改和修改的目的是，使可用质量通道的数量最大化，同时减少质量通道之间的重叠。
在一些实施例中，可以设计染色试剂以促进质量标签材料和含有单拷贝标记原子的单个元素离子或分子离子的释放和电离。染色试剂也可以被设计成促进质量标签材料和含有多个拷贝的标记原子(或其组合，如上所述)的单个元素离子或分子离子的释放和电离。作为另一替代方案，可以利用染色试剂本身的质量来创建用于质量细胞计数的检测通道。在这种情况下，在染色中将不使用稀土同位素，并且通过改变染色试剂的化学性质以产生许多质量通道来改变染色试剂的质量。这种变化可以用碳、氧、氮、硫、磷、氢和类似的同位素来完成，而无需稀土同位素。
在一些实施例中，还用激光辐射吸收剂组合物处理样本。该组合物起到增强样本在被照射时对激光的吸收的作用，并因此增加能量转移以激发标记原子(并因此促进含有标记原子的元素离子或分子离子或其组合的产生)。
与ldi有关的编号实施例
1.一种用于分析样本的设备，包含：a.用于容纳样本的样本室；b.激光，适于从样本解吸并电离材料，形成离子；c.离子光学器件，被布置为对由解吸电离形成的离子进行采样，并引导其朝向检测器远离样本；以及d.检测器，接收来自离子光学器件的离子并分析离子。
2.根据实施例1的设备，其中，该设备包含激光器，该激光器适于从样本解吸并电离材料，以形成元素离子，并且其中检测器接收来自采样和电离系统的元素离子并适于分析元素离子。
3.根据任一前述实施例的设备，其中该设备包含激光器，该激光器适于从样本解吸并电离材料，以形成分子离子，并且其中检测器接收来自采样和电离系统的分子离子并适于检测分子离子。
4.根据任一前述实施例的设备，其中，该设备包含激光器，该激光器适于从样本解吸并电离材料，以形成元素离子和分子离子，并且其中检测器接收来自采样和电离系统的离子并适于检测元素离子和分子离子两者。
5.根据任一前述实施例的设备，其中，激光器是深uv激光器，诸如发射193nm、213nm或266nm辐射的激光器。
6.根据任一前述实施例的设备，其中，激光器是飞秒激光器。
7.根据任一前述实施例的设备，其中，在真空、部分真空或大气压下，在样本室中发生解吸电离。
8.根据任一前述实施例的设备，其中，样本室包含一个或多个气体端口，该气体端口被布置为使得在激光解吸电离期间能够将一个或多个气体脉冲递送到样本上的激光解吸电离的位置，诸如其中一个或多个气体端口为喷嘴形式。
9.根据实施例8的设备，其中，布置一个或多个气体端口以使得一个或多个气体脉冲能够碰撞冷却通过来自激光器的激光辐射从样本产生的离子。
10.一种用于对包含多个细胞的样本进行质量细胞计数的方法，包含：a.用一个或多个质量标签标记样本中的一个或多个不同的目标分子，以提供标记的样本；b.对样本进行激光解吸电离，其中在多个已知位置进行激光解吸电离以形成多个离子云；以及c.对离子云进行质谱分析，从而从云中的一个或多个质量标签检测离子，允许构建样本的图像。
11.根据实施例10的方法，其中，多个离子云是多个单独的离子云，每个单独的离子云由在已知位置处的激光解吸电离形成，并且其中使离子云进行质谱分析包含使单个离子云进行质谱分析。
12.根据实施例10或11的方法，其中每个不同的目标被不同的特异性结合对成员(sbp)结合，并且每个不同的sbp被链接到质量标签，使得每个目标都被特异性质量标签标记。
13.根据实施例10至12中任一项的方法，还包含在步骤a之前、或在步骤a和b之间，用电离促进剂组合物处理样本。
14.根据实施例13的方法，其中电离促进剂组合物促进标记原子的电离和/或含有标记原子的分子离子的电离。
15.根据实施例10至14中任一项的方法，还包含在步骤a之、或在步骤a和b之间，用激光辐射吸收剂组合物处理样本。
2.质量检测器系统
质量检测器系统的示例性类型包括四极、飞行时间(tof)、扇形磁、高分辨率、基于单收集器或多收集器的质谱仪。
分析电离材料所花费的时间将取决于用于检测离子的质量分析仪的类型。例如，使用法拉第杯的仪器通常太慢，无法分析快速信号。总体而言，所需的成像速度、分辨率和多路复用程度将决定应使用的质量分析仪的类型(相反，质量分析仪的选择将决定可以实现的速度、分辨率和多路复用)。
一次仅以一种质荷比(m/q，在ms中通常称为m/z)检测离子的质谱仪(例如使用点离子检测器)在成像检测中将产生不良的结果。首先，在质荷比之间切换所花费的时间限制了可以确定多个信号的速度；其次，如果离子的丰度较低，则当仪器聚焦于其他质荷比时会丢失信号。因此，优选使用提供基本上同时检测具有不同m/q值的离子的技术。
检测器类型
四极检测器
四极质量分析仪包含四个平行杆，一端带有检测器。在一对杆和另一对杆之间施加交替的rf电位和固定的dc偏移电位，以使一对杆(每个杆彼此相对)具有与另一对杆相反的替代电位。电离的样本在平行于杆的方向上朝向检测器穿过杆的中间。所施加的电势会影响离子的轨迹，从而只有具有特定质荷比的离子才会具有稳定的轨迹，并因此到达检测器。其他质荷比的离子将与杆碰撞。
扇形磁检测器
在扇形磁质谱仪中，电离的样本通过弯曲的飞行管流向离子检测器。横跨飞行管的磁场使离子从其路径偏转。每个离子的偏转量基于每个离子的质荷比，因此只有一些离子会与检测器碰撞——其他离子将从检测器偏转。在多收集器扇区的现场仪器中，使用检测器阵列来检测不同质量的离子。在一些仪器中，诸如thermoscientificneptuneplus和nuplasmaii，扇形磁与静电扇区结合在一起，提供了一种双聚焦扇形磁仪器，该仪器除了质荷比外还可以通过动能分析离子。具体地，可以使用具有mattauch-herzog几何形状的那些多检测器(例如spectroms，它可以使用半导体直接电荷检测器在一次测量中同时记录从锂到铀的所有元素)。这些仪器可以基本同时测量多个m/q信号。通过在检测器中包含电子倍增器，可以提高其灵敏度。然而，阵列扇区仪器始终适用，因为尽管它们可用于检测不断增加的信号，但在信号水平降低时它们的用处不大，因此它们不太适用于特别是标签浓度高度可变的情况。
飞行时间(tof)检测器
飞行时间质谱仪包含样本入口、在其上施加有强电场的加速室、和离子检测器。电离的样本分子包通过样本入口引入并进入加速室。最初，每个电离的样本分子具有相同的动能，但是当电离的样本分子通过加速室加速时，它们通过各自的质量分开，较轻的电离样本分子比较重的离子行进得更快。然后，检测器会在所有离子到达时对其进行检测。每个粒子到达检测器所花费的时间取决于粒子的质荷比。
因此，tof检测器可以在单个样本中准同时记录多个质量。从理论上讲，tof技术由于其空间电荷特性而不适用于icp离子源，但是tof仪器实际上可以足够快速且灵敏地分析icp离子气雾，以实现可行的单细胞成像。尽管由于需要处理tof加速器和飞行管中的空间电荷的影响而导致折衷，tof质量分析仪通常在用于原子分析方面不受欢迎，但是根据本发明的组织成像可以通过仅检测标记原子而有效，因此可以去除其他原子(例如原子质量低于100的那些原子)。这导致密度较小的离子束，其聚集在(例如)100-250道尔顿区域的质量中，可以更有效地对其进行操纵和聚焦，从而有助于tof检测并利用tof的高光谱扫描速率。因此，可以通过将tof检测与选择样本中不常见的标记原子相结合来实现快速成像，理想情况下，其质量应高于未标记样本中可见的质量，例如，通过使用更高质量的过渡元素。因此，使用较窄的标签质量窗口意味着将tof检测用于有效的成像。
合适的tof仪器可从tofwerk、gbcscientificequipment(例如optimass9500icp-tofms)和fluidigmcanada(例如cytoftm和cytoftm2仪器)获得。这些cytoftm仪器比tofwerk和gbc仪器具有更高的灵敏度，并且由于可快速、灵敏地检测稀土金属质量范围内的离子(尤其是m/q范围为100-200的离子)，因此被广泛用于质量细胞术；参见bandura等人(2009；anal.chem.，81:6813–22)。因此，这些是与本公开一起使用的优选仪器，并且它们可以通过本领域已知的仪器设置用于成像，例如bendall等人(2011；science332，687–696)和bodenmiller等人(2012；nat.biotechnol.30:858–867)。他们的质量分析仪可以在高频激光消融或样本解吸的时间尺度上以高质谱采集频率准同时地检测大量标记物。它们可以测量标记原子的丰度，检测限为每个细胞约100个，从而可以灵敏地构建组织样本的图像。由于这些特征，质量细胞计数现在可以用来满足亚细胞分辨率下组织成像的灵敏度和多路复用需求。通过将质量细胞计数仪与高分辨率激光消融采样系统和高快速低色散样本室相结合，可以在实际的时间范围内以高度多路复用的方式构建组织样本的图像。
tof可以与质量分配校正器耦合。绝大多数电离事件会产生m+离子，其中单个电子已从原子中被剔除。由于tofms的操作模式，有时一个质量(m)的离子会渗入(或串扰)到相邻质量(m±1)的通道中，特别是在大量质量m的离子进入检测器的情况下(即，离子计数很高，但不能太高，如果设备要包含此类离子偏转器，则位于采样电离系统和ms之间的离子偏转器将阻止它们进入ms)。随着每个m+离子到达检测器的时间遵循均值的概率分布(每个m已知)，当质量为m+的离子数量很高时，则一些离子将到达通常与m-1+或m+1+离子相关联的时间。然而，由于每个离子在进入tofms时都具有已知的分布曲线，因此基于质量m通道中的峰值，可以确定质量m的离子到m±1通道中的重叠(与已知的峰值形状相比)。该计算特别适用于tofms，因为在tofms中检测到的离子峰是不对称的。因此，由此可以校正m-1、m和m+1通道的读数，以将所有检测到的离子适当地分配给m通道。由于通过采样和电离系统产生的大离子包的性质，诸如本文公开的那些涉及激光消融(或如下所述的解吸)作为从样本去除材料的技术，此类校正在校正成像数据中具有特殊的用途。在wo2011/098834、美国专利8723108和wo2014/091243中讨论了通过对来自tofms的数据进行去卷积来改善数据质量的程序和方法。
停滞时间校正器
如上所述，ms中的信号是根据离子与检测器之间的碰撞以及离子与从检测器表面释放的电子撞击而检测到的。当ms检测到离子的高计数导致大量电子释放时，ms的检测器可能会暂时疲劳，结果是从检测器输出的模拟信号对于一个或多个后续的离子包会暂时被压制。换言之，电离的样本材料包中离子的计数特别高，导致在从电离的样本材料包中检测离子的过程中，许多电子从检测器表面和次级倍增器中释放出来，这意味着当随后被电离的样本材料包中的离子撞击检测器时，可以释放更少的电子，直到补充检测器表面和次级倍增器中的电子。
基于检测器行为的表征，可以补偿这种停滞时间(deadtime)现象。第一步是分析模拟信号中的离子峰，该信号是由检测器对第n包电离样本材料的检测所导致的。峰的幅度可以由峰的高度、由峰的面积、或由峰的高度和峰的面积的组合来确定。
然后比较峰的幅度，看它是否超过预定阈值。如果幅度低于此阈值，则无需校正。如果幅度高于阈值，则将对来自至少一个后续电离样本材料包的数字信号进行校正(至少第(n+1)个电离样本材料包，但可能还会是其他的电离样本材料包，诸如第(n+2)个、(n+3)个、(n+4)个等)，以补偿由于第n个电离样本材料包引起的检测器疲劳而导致的这些电离样本材料包中模拟信号的暂时抑制。第n个电离样本材料包的峰的幅度越大，则需要对随后的电离样本材料包的峰进行更多的校正，并且校正的幅度将需要更大。stephan等人(1994；vac.sci.technol.12:405)、tyler和peterson(2013；surfinterfaceanal.45:475-478)、tyler(2014；surfinterfaceanal.46:581-590)、wo2006/090138和美国专利6229142中讨论了用于校正此类现象的方法，并且这些方法可以由停滞时间校正器应用于数据，如本文所述。
基于光发射光谱检测的分析仪设备
1.采样和电离系统
a.基于激光消融的采样和电离系统
上面关于基于质量的分析仪描述的激光消融采样系统可以用于基于oes检测器的系统。为了检测原子发射光谱，最优选地，使用icp使从样本去除的样本材料电离，但是可以使用任何能够产生元素离子的硬电离技术。
如本领域技术人员所理解的，关于避免基于质量的检测器的过载而描述的上述基于激光消融的采样和电离系统的某些可选的其他组件可能不适用于所有基于oes检测器的系统，如果不适合，则技术人员不会将其并入。
b.基于解吸的采样和电离系统
上面关于基于质量的分析仪所描述的基于解吸的采样系统可以在基于oes检测器的系统中使用。为了检测原子发射光谱，最优选地，使用icp使从样本去除的样本材料电离，但是可以使用任何能够产生元素离子的硬电离技术。
如本领域技术人员所理解的，关于避免基于质量的检测器的过载而描述的上述基于解吸的采样和电离系统的某些可选的其他组件，可能不适用于所有基于oes检测器的系统，并且如果不适合，则技术人员不会将其并入。
2.光电检测器
光电检测器的示例类型包括光电倍增管和电荷耦合器件(ccd)。在通过元素质谱仪成像之前，可以使用光电检测器对样本成像和/或识别受关注特征/区域。
光电倍增管包含真空室，该真空室包含一个光电阴极、几个倍增电极和一个阳极。由于光电效应，入射在光电阴极上的光子使光电阴极发射电子。由于二次发射的过程，电子被倍增电极倍增以产生倍增的电子电流，然后阳极检测到倍增的电子电流，从而提供了一种检测入射在光电阴极上的电磁辐射的措施。光电倍增管可以从例如thorlabs获得。
ccd包含含有光敏像素阵列的硅芯片。在曝光期间，每个像素都会产生与入射到像素上的光强度成比例的电荷。曝光后，控制电路将产生一系列电荷转移，以产生一系列电压。然后可以分析这些电压以产生图像。合适的ccd可从例如cellbiosciences获得。
构建图像
上面的设备可以为从样本中去除的电离样本材料包中的多个原子提供信号。对样本材料包中原子的检测揭示了它在消融位置处的存在，这是因为该原子天然存在于样本中，或是因为该原子已被标记试剂定位在该位置。通过从样本表面上已知的空间位置产生一系列电离的样本材料包，检测器信号可以揭示原子在样本上的位置，因此这些信号可用于构建样本图像。通过用可区分的标记物标记多个目标，可以将标记原子的位置与同源目标的位置关联起来，因此该方法可以构建复杂的图像，达到的多路复用水平远远超过使用传统技术(诸如荧光显微镜)可以达到的水平。
将信号组装成图像将使用计算机，并且可以使用已知技术和软件包来实现。例如，可以使用来自kylebanksoftware的graphis软件包，或者也可以使用诸如teraplot的其他软件包。使用来自诸如maldi-msi的技术的ms数据进行成像是本领域已知的，例如robichaud等人(2013；jamsocmassspectrom245：718-21)公开了“msireader”界面，用于在matlab平台上查看和分析ms成像文件，以及klinkert等人(2014；intjmassspectromhttp://dx.doi.org/10.1016/j.ijms.2013.12.012)公开了两种软件工具，用于在完整的空间和光谱分辨率内快速进行2d和3dmsi数据集的数据探索和可视化分辨率，例如“datacubeexplorer”程序。
使用本文公开的方法获得的图像可以被进一步分析，例如以与分析ihc结果相同的方式。例如，图像可以用于描绘样本中的细胞亚群，并且可以提供对临床诊断有用的信息。类似地，可以使用spade分析从本公开方法提供的高维细胞计数数据中提取细胞层次qiu等人(2011；nat.biotechnol.29:886-91)。
样本
本公开的某些方面提供了对生物样本进行成像的方法。此类样本可以包含多个细胞，可以对细胞进行成像质量细胞计数(imc)，以提供样本中这些细胞的图像。通常，本发明可用于分析现在通过免疫组织化学(ihc)技术研究的组织样本，但是使用适合于通过质谱(ms)或光发射光谱(oes)检测的标记原子。
任何合适的组织样本均可用于本文所述的方法。例如，组织可以包括来自上皮、肌肉、神经、皮肤、肠、胰腺、肾脏、脑、肝、血液(例如血液涂片)、骨髓、颊刷、宫颈刷中的一种或多种、或任何其他组织。生物样本可以是永生的细胞系或获自活体的原代细胞。为了诊断、预后或实验(例如药物开发)目的，组织可以来自肿瘤。在一些实施例中，样本可以来自已知组织，但是样本是否包含肿瘤细胞可能是未知的。成像可以揭示目标的存在，该目标指示肿瘤的存在，从而促进诊断。来自肿瘤的组织可以包含也由本方法表征的免疫细胞，并且可以提供对肿瘤生物学的了解。组织样本可以包含福尔马林固定的、石蜡包埋的(ffpe)组织。组织可获自任何活体的多细胞生物，诸如哺乳动物、动物研究模型(例如，特定疾病的模型，诸如具有人类肿瘤异种移植物的免疫缺陷啮齿动物)或人类患者。
组织样本可以是例如切片，其厚度在2-10μm的范围内，诸如介于4-6μm之间。制备此类切片的技术在ihc领域是众所周知的，例如使用切片机，包括脱水步骤、固定、包埋、透化、切片等。因此，可以将组织进行化学固定，然后可以在所需平面中制备切片。冷冻切片或激光捕获显微切割也可用于制备组织样本。样本可以被透化，例如以允许摄取用于标记细胞内目标的试剂(参见上文)。
尽管最大尺寸将由激光消融设备决定，特别是由可放入其样本室中的样本的尺寸决定，但要分析的组织样本的尺寸将与当前的ihc方法相似。典型的最大尺寸是5mm×5mm，但较小的样本(例如1mm×1mm)也是有用的(这些尺寸是指切片的大小，而不是其厚度)。
除了可用于对组织样本进行成像之外，本公开内容还可以用于对细胞样本进行成像，诸如单层贴壁细胞或固定在固体表面上的细胞(如常规免疫细胞化学中那样)。这些实施例对于分析对细胞悬浮质量细胞计数不易溶解的贴壁细胞特别有用。因此，本公开不仅可用于增强当前的免疫组织化学分析，而且可用于增强免疫细胞化学。
样本载体
在某些实施例中，可以将样本固定在固体支撑物(即样本载体)上，以将其定位以用于成像质谱。固体支撑物可以是光学透明的，例如由玻璃或塑料制成。在样本载体是光学透明的的情况下，其使得能够通过支撑物消融样本材料。有时，样本载体将包括用作与本文描述的设备和方法一起使用的参考点的特征，例如以允许计算要消融或解吸和分析的受关注特征/区域的相对位置。参考点可以是光学可分辨的，或者可以是通过质量分析可分辨的。
目标元素
在成像质谱法中，可能需要关注一种或多种目标元素(即元素或元素同位素)的分布。在某些方面，目标元素是如本文所述的标记原子。标记原子可以单独添加到样本中或共价结合到生物活性分子上或之内。在某些实施例中，标记原子(例如，金属标签)可以与特异性结合对(sbp)的成员缀合，诸如与dna或rna目标杂交的抗体(与其同源抗原结合)、适体或寡核苷酸，如下更详细地描述。标记原子可以通过本领域已知的任何方法连接至sbp。在某些方面，标记原子是金属元素，诸如镧系元素或过渡元素或另一种金属标签，如本文所述。金属元素的质量可以大于60amu、大于80amu、大于100amu或大于120amu。本文所述的质谱仪可消耗低于金属元素质量的元素离子，以使大量的较轻元素不会产生空间电荷效应和/或使质量检测器过载。
组织样本的标记
本公开产生已经用标记原子来标记的样本的图像，该标记原子例如是多个不同的标记原子，其中标记原子由能够对样本的特定的优选亚细胞的区域进行采样的设备来检测(因此，标记原子代表元素标签)。参考多个不同的原子是指使用一种以上的原子种类来标记样本。可以使用质量检测器来区分这些原子种类(例如，它们具有不同的m/q比)，以使羽状物内存在两个不同的标记原子会产生两个不同的ms信号。也可以使用光谱仪来区分原子种类(例如，不同的原子具有不同的发射光谱)，从而羽状物内两个不同的标记原子的存在会引起两个不同的发射光谱信号。
带质量标签的试剂
如本文所用，带质量标签的试剂包含许多组分。首先是sbp。第二个是质量标签。质量标签和sbp通过接头连接，至少部分由质量标签和sbp的缀合形成。sbp和质量标签之间的连接也可以包含间隔物。质量标签和sbp可以通过一系列反应化学物共轭在一起。示例性的共轭反应化学物包括巯基马来酰亚胺、nhs酯和胺，或点击化学反应物(优选无cu(i)化学物)，诸如应变炔和叠氮化物、应变炔和硝酮以及应变烯烃和四嗪。
质量标签
本发明中使用的质量标签可以采取多种形式。通常，标签包含至少一个标记原子。标记原子在下文讨论。
因此，质量标签可以以其最简单的形式包含金属螯合部分(metal-chelatingmoiety)，该金属螯合部分是金属螯合基团，其中金属标记原子在配体中配位。在一些情况下，每个质量标签仅检测单个金属原子就足够了。但是，在其他情况下，可能希望每个质量标签都含有一个以上的标记原子。如下所述，这可以通过多种方式来实现。
产生可包含一个以上标记原子的质量标签的第一种方法是使用包含与聚合物的一个以上亚基附接的金属螯合配体的聚合物。能够结合聚合物中的至少一个金属原子的金属螯合基团的数目可以在大约1至10000之间，诸如5-100、10-250、250-5000、500-2500或500-1000。至少一个金属原子可与至少一个金属螯合基团结合。聚合物的聚合度可以在约1至10000之间，诸如5-100、10-250、250-5000、500-2500或500-1000。因此，基于聚合物的质量标签可包含约1至10000、诸如5-100、10-250、250-5000、500-2500或500-1000个标记原子。
聚合物可以选自由线性聚合物、共聚物、支链聚合物、接枝共聚物、嵌段聚合物、星形聚合物和超支化聚合物组成的群组。聚合物的主链可以衍生自取代的聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯或聚甲基丙烯酰胺、并且可以是丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酸或甲基丙烯酸的均聚物或共聚物的取代衍生物。聚合物可以由可逆加成断裂聚合(raft)、原子转移自由基聚合(atrp)和阴离子聚合组成的群组而合成。提供聚合物的步骤可以包含由化合物合成聚合物，化合物选自以下项组成的群组：n-烷基丙烯酰胺、n,n-二烷基丙烯酰胺、n-芳基丙烯酰胺、n-烷基甲基丙烯酰胺、n,n-二烷基甲基丙烯酰胺、n芳基甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯及其功能等同物。
该聚合物可以是水溶性的。该部分不受化学含量的限制。但是，如果骨架具有相对可复制的大小(例如长度、标签原子数、可复制的树枝状聚合物特征等)，则可以简化分析。还考虑了对稳定性、溶解性和无毒的要求。因此，通过合成策略制备和表征功能性水溶性聚合物，该策略沿主链放置许多官能团以及不同的反应性基团(连接基团)，该反应性基团可用于通过连接物和任选的间隔物将聚合物连接到分子(例如sbp)上。聚合物的尺寸可通过控制聚合反应来控制。通常，将选择聚合物的尺寸，以使聚合物的回转辐射尽可能小，诸如在2至11纳米之间。igg抗体(一种示例性sbp)的长度为约10纳米，因此，相对于sbp尺寸而言，过大的聚合物标签可能会在空间上干扰sbp与其靶标的结合。
能够结合至少一个金属原子的金属螯合基团可以包含至少四个乙酸基团。例如，金属螯合基团可以是二亚乙基三胺五乙酸酯(dtpa)基团或1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(dota)基团。替代基团包括乙二胺四乙酸(edta)和乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-n,n,n',n'-四乙酸(egta)。
金属螯合基团可以通过酯或通过酰胺附接至聚合物。合适的金属螯合聚合物的实例包括可从fluidigmcanada公司获得的x8和dm3聚合物。
聚合物可以是水溶性的。由于它们的水解稳定性，可以使用n-烷基丙烯酰胺、n-烷基甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸酯或功能等同物。约1至1000(1至2000个主链原子)的聚合度(dp)涵盖了大多数受关注聚合物。较大的聚合物在本发明的范围内具有相同的功能性，并且是可行的，如本领域技术人员所理解的那样。通常，聚合度将在1和10000之间，诸如5-100、10-250、250-5000、500-2500或500-1000。聚合物可以通过导致相对窄的多分散性的途径进行合成。聚合物可以通过原子转移自由基聚合(atrp)或可逆加成断裂(raft)聚合而合成，其mw(重均分子量)/mn(数均分子量)的值应在1.1至1.2范围内。一种涉及阴离子聚合的替代策略，其中可获得mw/mn为约1.02至1.05的聚合物。两种方法都可以通过选择引发剂或终止剂来控制端基。这允许合成可以附接接头的聚合物。可以采用在重复单元中制备包含官能侧基的聚合物的策略，该配体的过渡金属单元(例如ln单元)可以在随后的步骤中连接到该重复单元上。该实施例具有多个优点。它避免了由于进行含配体的单体的聚合而可能引起的复杂性。
为了最大程度地减少侧基之间的电荷排斥，(m3+)的目标配体应在螯合物上赋予-1的净电荷。
用于本发明的聚合物包括：
-无规共聚物聚(dma-co-nas)：在relógio等人(2004)(polymer，45，8639-49)中报道了通过raft合成具有75/25摩尔比的n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(nas)与n,n-二甲基丙烯酰胺(dma)的无规共聚物，其具有高转化率、出色的摩尔质量控制(在5000至130,000的范围内)，并且mw/mn≈1.1。使活性nhs酯与带有反应性氨基的金属螯合基团反应，以产生通过raft聚合合成的金属螯合共聚物。
-聚(nmas)：可以通过atrp聚合nmas，获得平均摩尔质量为12至40kda且mw/mn为约1.1的聚合物(参见例如godwin等人，2001；angew.chem.int.ed，40:594-97)。
-聚(maa)：聚甲基丙烯酸(pmaa)可以通过其叔丁基或三甲基甲硅烷基(tms)酯的阴离子聚合来制备。
-聚(dmaema)：聚(甲基丙烯酸二甲基氨基乙基酯)(pdmaema)可以通过atrp制备(参见wang等人，2004，j.am.chem.soc，126，7784-85)。这是一种众所周知的聚合物，可以方便地制备，其平均mn值在2至35kda之间，mw/mn为约1.2。该聚合物还可以通过阴离子聚合法以较窄的粒度分布合成。
-聚丙烯酰胺或聚甲基丙烯酰胺。
可以通过本领域技术人员已知的方法将金属螯合基团附接至聚合物，例如，侧基可以通过酯或通过酰胺附接。例如，对于基于丙烯酸甲酯的聚合物，金属螯合基团可以首先通过使聚合物与乙二胺在甲醇中反应，然后在碱性条件下在碳酸盐缓冲液中使dtpa酸酐反应，而将金属螯合基团附接至聚合物主链。
第二种方法是产生可以用作质量标签的纳米颗粒。产生这种质量标签的第一条途径是使用已经被涂覆在聚合物中的金属的纳米级颗粒。在此，金属被聚合物隔离并与环境隔离，并且在例如通过结合到聚合物壳中的官能团可以使聚合物壳反应时，金属不发生反应。官能团可以与连接物组分(可选地包含间隔物)反应以附接点击化学试剂，因此允许这种类型的质量标签以简单、模块化的方式插入上文讨论的合成策略中。
接入法和接出法是在纳米粒子周围产生聚合物刷的两个主要机理。在接入法中，聚合物是单独合成的，因此合成不受需要保持纳米粒子胶体稳定的限制。可逆加成-断裂链转移(raft)合成由于单体种类繁多且易于官能化而非常出色。链转移剂(cta)可以容易地用作官能团本身，可以使用官能化的cta或可以对聚合物链进行后官能化。使用化学反应或物理吸附将聚合物附接到纳米颗粒上。接入法的一个缺点是通常较低的接枝密度，这是由于在附接至颗粒表面期间盘绕的聚合物链的空间排斥。所有的接入法都具有缺点，即必须进行严格的后处理才能从官能化的纳米复合材料颗粒中去除过量的游离配体。这通常通过选择性沉淀和离心来实现。在接出法中，分子(如用于原子转移自由基聚合(atrp)的引发剂或用于(raft)聚合的cta)固定在颗粒表面。该方法的缺点是开发了新的引发剂偶联反应。而且，与接入法相反，颗粒在聚合条件下必须是胶体稳定的。
产生质量标签的另一种方法是通过使用掺杂的珠。螯合的镧系元素(或其他金属)离子可用于细乳液聚合中，以产生具有嵌入聚合物中的螯合的镧系元素离子的聚合物颗粒。如本领域技术人员已知的，选择螯合基团，使得金属螯合物在水中的溶解度可忽略不计，而在用于细乳液聚合的单体中的溶解度则是合理的。如本领域技术人员已知的，可以使用的典型单体是苯乙烯、甲基苯乙烯、各种丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯。为了提高机械强度，带有金属标签的颗粒的玻璃化转变温度(tg)高于室温。在某些情况下，使用核-壳颗粒，其中通过细乳液聚合制备的含金属的颗粒用作种子乳液聚合的种子颗粒，以控制表面官能度的性质。通过为该第二阶段聚合选择合适的单体，可以引入表面官能度。另外，丙烯酸酯(和可能的甲基丙烯酸酯)聚合物优于聚苯乙烯颗粒，因为酯基团可以结合或稳定镧系元素配合物上不满意的配体位点。制备这种掺杂的珠的示例性方法是：(a)在含有至少一种有机单体(在一个实施例中为诸如苯乙烯和/或甲基丙烯酸甲酯)的溶剂混合物中，结合含有至少一种标记原子的配合物，其中该含有至少一种标记原子的配合物是可溶的，以及至少一种不同的溶剂，在该不同的溶剂中，有机单体和含有至少一种标记原子的配合物不易溶解，(b)将步骤(a)的混合物乳化足够的时间以提供均匀的乳液；(c)引发聚合反应并继续反应，直到大部分单体转化为聚合物为止；以及(d)将步骤(c)的产物温育足够的时间以获得聚合物颗粒的胶乳悬浮液，聚合物颗粒的胶乳悬浮液具有掺入颗粒中或之上的含有至少一种标记原子的配合物，其中选择含有至少一种标记原子的配合物，使得在检查聚合物质量标签时，从至少一种标记原子获得不同的质量信号。通过使用含有不同标记原子的两种以上配合物，可以制备包含两种以上不同标记原子的掺杂珠。此外，控制含有不同标记原子的配合物的比例，使得制备具有不同标记原子比例的掺杂珠。通过使用多种标记原子，并且以不同的比例，增加了可明显识别的质量标签的数量。在核-壳珠中，这可以通过将含有第一标记原子的配合物掺入核中以及将含有第二标记原子的配合物掺入壳中来实现。
还有一种方法是产生聚合物，该聚合物在聚合物的主链中包括标记原子，而不是作为配位的金属配体。例如，carerra和seferos(macromolecules2015，48，297-308)公开了将碲纳入聚合物主链的方法。掺入原子的其他聚合物可用作标记原子的锡、锑和铋掺入的聚合物。在priegert等人，2016(chem.soc.rev.)，45，922-953中特别讨论了此类分子。
因此，质量标签可以包含至少两个组分：标记原子，以及螯合、含有或掺有标记原子的聚合物。此外，质量标签还包含一个连接基团(未与sbp结合时)，该连接基团在两个组分发生化学反应后，在点击化学反应中形成了质量标签与sbp之间化学键的一部分，如上面所讨论的。
聚多巴胺涂层可以用作将sbp附接到掺杂的珠或纳米颗粒的另一种方式。给定聚多巴胺中的功能范围，sbp可以缀合至质量标签，该质量标签通过例如sbp(诸如抗体)上的氨基或巯基的反应由pda涂覆的珠或颗粒形成。可替代地，可以使pda上的官能团与诸如双功能接头的试剂反应，该试剂依次引入进一步的官能团以与sbp反应。在一些情况下，接头可含有间隔物，如下所述。这些间隔物增加了质量标签与sbp之间的距离，从而使sbp的空间位阻最小。因此，本发明包含带质量标签的sbp、包含sbp以及含聚多巴胺的质量标签，其中聚多巴胺包含sbp和质量标签之间的连接的至少一部分。纳米颗粒和珠(具体是聚多巴胺涂覆的纳米颗粒和珠)可用于信号增强以检测低丰度靶标，因为它们可以具有数千个金属原子并且可以具有相同亲和试剂的多个复制。亲和试剂可以是第二抗体，其可以进一步增强信号。
标记原子
可以与本公开一起使用的标记原子包括可由ms或oes检测到并且在未标记的组织样本中基本上不存在的任何物质。因此，例如，12c原子由于天然丰富，因此不适合用作标记原子，而理论上11c可以用于ms，因为它是非天然存在的人工同位素。通常，标记原子是金属。然而，在优选的实施例中，标记原子是过渡金属，诸如稀土金属(15种镧系元素，加上钪和钇)。这17种元素(可以由oes和ms区分)提供了许多(通过ms)易于区分的同位素。以富集同位素的形式可获得各种这些元素，例如钐具有6种稳定同位素、钕具有7种稳定同位素，所有这些都可以富集形式获得。15种镧系元素可提供至少37种具有非冗余独特质量的同位素。适合用作标记原子的元素的实例包括镧(la)、铈(ce)、镨(pr)、钕(nd)、钷(pm)、钐(sm)、铕(eu)、钆gd)、铽(tb)、镝(dy)、钬(ho)、铒(er)、铥(tm)、镱(yb)、镥(lu)、钪(sc)和钇(y)。除稀土金属外，其他金属原子也适用于检测，例如金(au)、铂(pt)、铱(ir)、铑(rh)、铋(bi)等。不优选使用放射性同位素，因为它们操作起来较不方便并且不稳定，例如：在镧系元素中，pm不是优选的标记原子。
为了促进飞行时间(tof)分析(如本文所讨论的)，使用原子质量在80-250范围内的标记原子是有帮助的，例如在80-210范围内或100-200范围内。此范围包括所有镧系元素，但不包括sc和y。100-200的范围允许通过使用不同的标记原子，在理论上进行101丛分析，同时利用tofms的高光谱扫描速率。如上所述，通过选择质量位于未标记样本中可见质量之上的窗口中的标记原子(例如，在100-200范围内)，tof检测可用于提供生物学上显著水平的快速成像。
取决于所使用的质量标签(以及每个质量标签的标签原子数)以及每个sbp所附接的质量标签数，可以将各种数量的标记原子连接到单个sbp成员上。当更多的标记原子附接到任何sbp成员时，可以实现更高的灵敏度。例如，可以将大于10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个标记原子附接到sbp成员，诸如至多10000个，例如5-100、10-250、250-5000、500-2500或500-1000个标记原子。如上所述，可以使用含有多个单体单元的单分散聚合物，每个含有螯合剂，诸如二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)或dota。例如，dtpa以约10-6m的解离常数结合3+镧系元素离子。这些聚合物可以终止于巯基，巯基可通过与马来酰亚胺反应而附接到sbp上以附接点击化学反应性，如以上所讨论的。其他官能团也可以用于这些聚合物的缀合，例如胺反应性基团，诸如n-羟基琥珀酰亚胺酯，或对羧基或对抗体的糖基化有反应性的基团。任何数量的聚合物均可与每个sbp结合。可以使用的聚合物的具体实例包括直链(“x8”)聚合物或第三代树状(“dn3”)聚合物，均可以作为maxpartm试剂使用。如上所述，还可以使用金属纳米颗粒来增加标记中的原子数。
在一些实施例中，质量标签中的所有标记原子均具有相同的原子质量。可替代地，质量标签可以包含不同原子质量的标记原子。因此，在一些情况下，标记的样本可以用一系列带质量标签的sbp进行标记，每个sbp仅包含一种类型的标记原子(其中每个sbp结合其同源靶标，因此每种质量标签位于样本上针对特异性的例如抗原)。可替代地，在一些情况下，可以用一系列带质量标签的sbp来标记样本，每个sbp均包含标记原子的混合物。在一些情况下，用于标记样本的带质量标签的sbp可以包含那些具有单个标记原子质量标签的sbp以及它们质量标签中标记原子的混合。
间隔物
如上所述，在一些情况下，sbp通过包含间隔物的接头与质量标签缀合。在sbp与点击化学试剂之间可能存在间隔物(例如，在sbp与应变环炔烃(或叠氮化物)、应变环烯烃(或四嗪)等之间)。在质量标签和点击化学试剂之间(例如在质量标签和叠氮化物(或应变环炔烃)；四嗪(或应变的环烯烃)等之间)可能存在间隔物。在一些情况下，snp和点击化学试剂之间以及点击化学试剂和质量标签之间可能都存在间隔物。
间隔物可以是聚乙二醇(peg)间隔物、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)(pvp)间隔物、聚甘油(pg)间隔物、聚(n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)间隔物或聚恶唑啉(poz，诸如聚甲基恶唑啉、聚乙基恶唑啉或聚丙基恶唑啉)或c5-c20非环状烷基间隔物。例如，间隔物可以是具有3个以上、4个以上、5个以上、6个以上、7个以上、8个以上、9个以上、10个以上、11个以上、12个以上、15个以上、20个以上eg(乙二醇)单元的peg间隔物。peg接头可具有3至12个eg单元，从4至10个，或可具有4、5、6、7、8、9或10个eg单元。接头可以包括胱胺或其衍生物，可以包括一个或多个二硫基，或可以是本领域技术人员已知的任何其他合适的接头。
间隔物可能有利于使质量标签在与之结合的sbp上的空间效应最小化。亲水性间隔物，例如基于peg的间隔物，也可以起到改善带质量标签的sbp的溶解度并防止聚集的作用。
sbp(特定结合对成员)
质量细胞计数，包括成像质量细胞计数，是基于特异性结合对成员之间特异性结合的原理。质量标签连接到特异性结合对成员，这将质量标签定位到靶标/分析物，该靶标/分析物是该对的另一个成员。然而，特异性结合不需要仅结合一种分子以排除其他分子。相反，它限定了结合不是非特定的，即不是随机交互。因此，与多个靶标结合的sbp的一个实例是识别许多不同蛋白质之间共有的表位的抗体。在此，结合将是特异性的，并由抗体的cdr介导，但是抗体会检测到多种不同的蛋白质。共同的表位可以是天然存在的，或者共同的表位可以是人工标签，诸如flag标签。类似地，如本领域的技术人员将理解的，对于核酸，限定序列的核酸可以不排他地与完全互补的序列结合，但是可以在使用不同严格性的杂交条件下引入不同的错配耐受性。尽管如此，这种杂交并非是非特异性的，因为它是由sbp核酸与靶标分析物之间的同源性介导的。类似地，配体可以特异性结合多种受体，一个简单的实例是既可以与tnfr1又可以与tnfr2结合的tnfα。
sbp可以包含以下任意一种：核酸双链体；抗体/抗原配合物；受体/配体对；或适配体/靶标对。因此，可以将标记原子附接至核酸探针，然后将核算探针与组织样本接触，以使探针可以与其中的互补核酸杂交，例如以形成dna/dna双链体、dna/rna双链体或rna/rna双链体。类似地，可以将标记原子附接至抗体，然后将抗体与组织样本接触，使其可以结合其抗原。标记原子可以与配体附接，然后配体与组织样本接触，使其可以结合其受体。可以将标记原子附接至适配体，然后将适配体与组织样本接触，使其可以结合其靶标。因此，标记的sbp成员可用于检测样本中的各种靶标，包括dna序列、rna序列、蛋白质、糖、脂质或代谢产物。
因此，带质量标签的sbp可以是蛋白质或肽，也可以是多核苷酸或寡核苷酸。
蛋白质sbp的实例包括抗体或其抗原结合片段、单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体融合蛋白、scfv、抗体模拟物、亲和素、链霉亲和素、中性亲和素、生物素或其组合，其中抗体模拟物任选地包含纳米抗体、亲和体(affibody)、亲和素、affimer、affitin、α体(alphabody)、anticalin、avimer、darpin、fynomer、kunitz结构域肽、单株(monobody)或其任意组合、受体(诸如受体-fc融合物)、配体(诸如配体-fc融合物)、凝集素(lectin)(例如凝集素(agglutinin)，诸如小麦胚芽凝集素)。
该肽可以是线性肽或环状肽，诸如双环肽。可以使用的肽的一个实例是鬼笔环肽。
多核苷酸或寡核苷酸通常是指含有通过3'-5'磷酸二酯键连接的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的核苷酸的单链或双链聚合物，以及多核苷酸类似物。核酸分子包括但不限于dna、rna和cdna。多核苷酸类似物可以具有除天然多核苷酸中发现的标准磷酸二酯键以外的主链，以及可选地具有除核糖或脱氧核糖以外的修饰的糖部分或多个部分。多核苷酸类似物含有能够通过watson-crick碱基配对与标准多核苷酸碱基氢键合的碱基，其中类似物主链以允许寡核苷酸类似物分子与标准多核苷酸中的碱基之间以序列特异性方式进行此类氢键合的方式，来提供碱基多核苷酸。多核苷酸类似物的实例包括但不限于异种核酸(xna)、桥连核酸(bna)、二醇核酸(gna)、肽核酸(pna)、ypna、吗啉代多核苷酸、锁核酸(lna)、苏糖核酸(tna)、2'-0-甲基多核苷酸、2'-0-烷基核糖基取代的多核苷酸、硫代磷酸酯多核苷酸和硼酸磷酸多核苷酸。多核苷酸类似物可以具有嘌呤或嘧啶类似物，包括例如7-脱氮嘌呤类似物、8-卤代嘌呤类似物、5-卤代嘧啶类似物或可与任何碱基配对的通用碱基类似物，包括次黄嘌呤、硝基唑、异卡比丁酮类似物、唑羧酰胺和芳香族三唑类似物、或具有其他功能的碱基类似物，诸如用于亲和结合的生物素部分。
抗体sbp成员
在典型的实施例中，标记的sbp成员是抗体。可以通过将一个或多个标记原子结合分子与抗体缀合来实现抗体的标记，通过使用例如nhs-胺化学物、巯基-马来酰亚胺化学物或点击化学物(诸如应变炔和叠氮化物、应变炔和硝酮、应变烯烃和四嗪等)附接质量标签。识别可用于成像的细胞蛋白质的抗体已广泛用于ihc，并且通过使用标记原子代替当前的标记技术(例如荧光)，这些已知抗体可以轻松地用于本文公开的方法中，但具有提高多路复用能力的益处。抗体可以识别细胞表面上的靶标或细胞内的靶标。抗体可以识别多种靶标，例如它们可以特异性识别单个蛋白质，或可以识别具有共同表位的多个相关蛋白质，或可以识别蛋白质上的特定翻译后修饰(例如，区分受关注蛋白质上的酪氨酸和磷酸酪氨酸，以区分赖氨酸和乙酰基-赖氨酸、检测泛素化等)。在与靶标结合后，可以检测与抗体偶联的标记原子，从而揭示该靶标在样本中的位置。
标记的sbp成员通常会直接与样本中的目标sbp成员相互作用。然而，在一些实施例中，标记的sbp成员可能与目标sbp成员间接地相互作用，例如，一抗可以与目标sbp成员结合，然后标记的二抗可以以夹心测定的方式与一抗结合。然而，通常该方法依赖于直接相互作用，因为这可以更容易地实现并且允许更高的多路复用。然而，在这两种情况下，样本都与可以结合到样本中目标sbp成员的sbp成员接触，并在以后的阶段检测到附接至目标sbp成员上的标记。
核酸sbp和标记方法修改
rna是另一种生物分子，本文公开的方法和设备能够以特异性、灵敏的和如果需要的定量方式进行检测。以与上述用于蛋白质分析的相同方式，可以通过使用标记有与rna特异性结合的元素标签的sbp成员来检测rna(例如，如上所述的互补序列的多核苷酸或寡核苷酸，包括互补序列的锁核酸(lna)分子、互补序列的肽核酸(pna)分子、互补序列的质粒dna、互补序列的扩增dna、互补序列的rna片段和互补序列的基因组dna片段)。rna不仅包括成熟的mrna，还包括rna加工中间体和新生的前体-mrna(pre-mrna)转录物。
在某些实施例中，使用要求保护的发明的方法检测rna和蛋白质。
为了检测rna，可以使用本文所述的方法和设备制备本文所述的生物学样本中的细胞以分析rna和蛋白质含量。在某些方面，在杂交步骤之前，将细胞固定并透化。可以以固定和/或透化的方式提供细胞。细胞可以通过交联固定剂诸如甲醛、戊二醛而固定。可替代地或另外地，可以使用沉淀的固定剂诸如乙醇、甲醇或丙酮来固定细胞。可以用去污剂透化细胞，诸如聚乙二醇(例如tritonx-100)、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(吐温-20)、皂苷(一组两亲性糖苷)或诸如甲醇或丙酮的化学物质。在某些情况下，可以使用相同的试剂或一组试剂进行固定和透化。jamur等人在“permeabilizationofcellmembranes”(methodsmol.biol.，2010)中讨论了固定和透化技术。
先前已经使用荧光团标记的寡核苷酸探针进行了细胞中靶核酸的检测或“原位杂交(ish)”。如本文所讨论的，与电离和质谱联用的具有质量标签的寡核苷酸，可用于检测细胞中的靶核酸。原位杂交的方法在本领域中是已知的(参见zenobi等人，“single-cellmetabolomics:analyticalandbiologicalperspectives”，science第342卷，第6163号，2013)。美国专利号5,225,326和美国公开号2010/0092972和2013/0164750中也描述了杂交方案，其通过引用并入本文。
在杂交之前，可以如前所述将悬浮或固定在固体支撑物上的细胞固定并透化。透化可以允许细胞保留靶核酸，同时允许靶杂交核苷酸、扩增寡核苷酸和/或带质量标签的寡核苷酸进入细胞。可以在任何杂交步骤之后，例如在靶杂交寡核苷酸与核酸靶标杂交之后、在扩增寡核苷酸杂交之后和/或带质量标签的寡核苷酸杂交之后，洗涤细胞。
对于该方法的所有或大多数步骤，可以将细胞悬浮，以便于处理。然而，该方法也适用于固体组织样本(例如组织切片)中的细胞和/或固定在固体支撑物(例如载玻片或其他表面)上的细胞。因此，有时，细胞可以在样本中以及在杂交步骤中处于悬浮状态。其他时候，细胞在杂交过程中被固定在固体支撑物上。
靶核酸包括任何受关注核酸，并在细胞中具有足够的丰度，可通过本发明的方法进行检测。靶核酸可以是rna，其在细胞内存在多个复制。例如，细胞中可以存在靶rna的10个以上、20个以上、50个以上、100个以上、200个以上、500个以上、或1000个以上复制。靶rna可以是信使na(mrna)、核糖体rna(rrna)、转移rna(trna)、小核rna(snrna)、小干扰rna(sirna)、长非编码rna(incrna)或本领域已知的任何其他类型的rna。靶rna可以是20个核苷酸以上、30个核苷酸以上、40个核苷酸以上、50个核苷酸以上、100个核苷酸以上、200个核苷酸以上、500个核苷酸以上、1000个核苷酸以上、在20和1000个核苷酸之间、长度在20和500个核苷酸之间、长度在40和200个核苷酸之间，依此类推。
在某些实施例中，可以将带质量标签的寡核苷酸直接与靶核酸序列杂交。然而，其他寡核苷酸的杂交可以允许改善的特异性和/或信号放大。
在某些实施例中，可以将两个以上靶杂交寡核苷酸与靶核酸上的近端区域杂交，并且可以一起提供用于在杂交方案中与其他寡核苷酸杂交的位点。
在某些实施例中，可以将带质量标签的寡核苷酸直接与两个以上靶杂交寡核苷酸杂交。在其他实施例中，可以同时或相继添加一个或多个扩增寡核苷酸，以使两个以上靶杂交寡核苷酸杂交并提供可以与带质量标签的寡核苷酸结合的多个杂交位点。一种或多种扩增寡核苷酸(具有或不具有带质量标签的寡核苷酸)可以作为能够与两种以上靶杂交寡核苷酸杂交的多聚体而提供。
虽然使用两个以上靶杂交寡核苷酸改善了特异性，但是使用扩增寡核苷酸增加了信号。两个靶杂交寡核苷酸与细胞中的靶rna杂交。两个靶杂交寡核苷酸一起提供了扩增寡核苷酸可以结合的杂交位点。扩增寡核苷酸的杂交和/或随后的洗涤，可以在允许与两个近端靶杂交寡核苷酸杂交但高于扩增寡核苷酸与仅一个靶杂交寡核苷酸的杂交的解链温度的温度下进行。第一扩增寡核苷酸提供了多个杂交位点，第二扩增寡核苷酸可结合至该杂交位点，从而形成分支模式。带质量标签的寡核苷酸可以结合至第二个扩增核苷酸提供的多个杂交位点。一起，这些扩增寡核苷酸(带或不带质量标签的寡核苷酸)在本文中被称为“多聚体(multimer)”。因此，术语“扩增寡核苷酸”包括提供相同结合位点的多个复制的寡核苷酸，其他寡核苷酸可以与之退火。通过增加其他寡核苷酸的结合位点数目，可以发现被靶标的最终标记数目增加。因此，多个标记的寡核苷酸间接地与单个靶rna杂交。通过增加每个rna使用的元素的可检测原子数，这可以检测低复制数的rna。
进行该扩增的一种特定方法包含使用来自先进细胞诊断(advancedcelldiagnostics)的
rna信号的另一种扩增手段依赖于滚环扩增手段(rca)。可以将该扩增系统引入扩增过程的方法有很多种。在第一种情况中，第一核酸被用作杂交核酸，其中第一核酸是环状的。第一核酸可以是单链的或可以是双链的。它包含与靶rna互补的序列。在第一核酸与靶rna杂交后，将与第一核酸互补的引物与第一核酸杂交，并使用通常外源添加到样本中的聚合酶和核酸用于引物延伸。然而，在一些情况下，当将第一核酸添加到样本中时，它可能已经具有用于延伸的引物与之杂交。由于第一核酸是环状的，一旦引物延伸完成了完整的一轮复制，聚合酶就可以取代引物并继续延伸(即，没有5'→3'核酸外切酶活性)，从而产生越来越多第一核酸的互补的链状复制，从而扩增该核酸序列。因此可以将包含元素标签的寡核苷酸(如上文所讨论的rna或dna、或lna或pna等)与第一核酸的补体的链状复制杂交。因此，可以通过分配给环状核酸的扩增步骤的时间长度来控制rna信号的扩增程度。
在rca的另一种应用中，不是环状的与靶rna杂交的例如第一寡核苷酸，而是它可以是线性的，并且包含具有与其靶标互补的序列的第一部分和用户选择的第二部分。然后可以将具有与第二部分同源的序列的环状rca模板与此第一寡核苷酸杂交，并如上所述进行rca扩增。具有靶标特异性部分和用户选择的部分的例如第一寡核苷酸的使用，是可以被选择的用户选择部分，以便在各种不同的探针之间是共同的。这是试剂有效的，因为可以在检测不同目标的一系列反应中使用相同的后续扩增试剂。然而，如本领域技术人员所理解的，当采用这种策略时，为了在多重反应中单独检测特定的rna，与靶rna杂交的每个第一核酸将需要具有独特的第二序列，并且随后每个环状核酸应含有可以被标记的寡核苷酸杂交的独特序列。以这种方式，可以特异性地扩增和检测来自每个靶rna的信号。
引起rca分析的其他配置对于本领域技术人员将是已知的。在一些情况下，为了防止在随后的扩增和杂交步骤中例如第一寡核苷酸从靶上解离，可以在杂交后(诸如通过甲醛)固定例如第一寡核苷酸。
此外，杂交链式反应(hcr)可用于扩增rna信号(参见，例如choi等人，2010，nat.biotech，28:1208-1210)。choi解释说，一个hcr扩增器由两种核酸发夹物质组成，它们在没有引发剂的情况下不会聚合。每个hcr发夹均由带有裸露单链立足点(toehold)的输入域和隐藏在折叠发夹中的单链立足点的输出域。引发剂与两个发夹之一的输入域的杂交打开了发夹以暴露其输出域。将此(先前隐藏的)输出域与第二个发夹的输入域进行杂交，将打开该发夹，以将序列相同的输出域暴露至引发剂。引发剂序列的再生为交替进行的第一和第二发夹聚合步骤的链式反应奠定了基础，导致形成带切口的双链“聚合物”。在本文公开的方法和设备的应用中，第一发夹和第二发夹中的一个或两个可以用元素标签标记。由于扩增过程依赖于特定序列的输出域，因此可以在同一过程中独立进行使用不同发夹组的各种离散扩增反应。因此，这种扩增还允许在多种rna种类的多重分析中进行扩增。正如choi指出的那样，hcr是等温触发的自组装过程。因此，发夹应在进行触发的原位自组装之前先渗透样本，这表明深层样本渗透和高信噪比的潜力。
杂交可以包括使细胞与一种或多种寡核苷酸(诸如靶杂交寡核苷酸、扩增寡核苷酸和/或带质量标签的寡核苷酸)接触，并提供可发生杂交的条件。杂交可以在缓冲溶液中进行，诸如柠檬酸钠(scc)缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(pbs)、盐水-磷酸钠-edta(sspe)缓冲液、tnt缓冲液(具有tris-hcl、氯化钠和吐温20)或任何其他合适的缓冲液。杂交可以在一种或多种寡核苷酸的杂交的解链温度附近或以下的温度进行。
通过杂交后进行一次或多次洗涤可以改善特异性，以去除未结合的寡核苷酸。洗涤的严格性提高可能会改善特异性，但会降低总体信号。可以通过增加或减少洗涤缓冲液的浓度、增加温度和/或增加洗涤时间来增加洗涤的严格性。rna酶抑制剂可用于任何或所有杂交培养和随后的洗涤中。
包括一个或多个靶杂交寡核苷酸、扩增寡核苷酸和/或质量标记的寡核苷酸的第一组杂交探针可用于标记第一靶核酸。可以使用另外的杂交探针组来标记另外的靶核酸。每组杂交探针可以对不同的靶核酸具有特异性。可以设计、杂交和洗涤另外的杂交探针组，以减少或防止不同组的寡核苷酸之间的杂交。另外，每组的带质量标签的寡核苷酸可以提供独特的信号。这样，可以使用多组寡核苷酸来检测2、3、5、10、15、20或更多个不同的核酸靶标。
有时，检测到的不同核酸是单个基因的剪接变体。带质量标签的寡核苷酸可以设计为在外显子序列内杂交(直接或间接通过其他寡核苷酸，如下所述)，以检测含有该外显子的所有转录物，或者可以设计为桥接剪接点以检测特定变体(例如，如果一个基因具有三个外显子和两个剪接变体——外显子1-2-3和外显子1-3——则可以区分两者：可以通过与外显子2杂交特异性检测出变体1-2-3，并且通过跨外显子1-3连接进行杂交可以特异性检测变体1-3。
组织化学染色剂
具有一个或多个固有金属原子的组织化学染色剂可以与本文所述的其他试剂和使用方法结合。例如，组织化学染色剂可以与含金属的药物、金属标记的抗体和/或积累的重金属共定位(例如，以细胞或亚细胞分辨率)。在某些方面，一种或多种组织化学染色剂可以以比其他成像方法(例如荧光显微镜、光学显微镜或电子显微镜)更低的浓度(例如，少于一半、四分之一、十分之一等)使用。
为了可视化和识别结构，可以使用多种组织学染色剂和指示剂并对其进行充分表征。含金属的染色剂可能会影响病理学家对成像质量细胞计数仪的接受程度。众所周知，某些含金属的染色剂可揭示细胞成分，并且适用于本发明。此外，可以在数字图像分析中使用定义明确的染色剂，从而为特征识别算法提供对比度。这些特征对于成像质量细胞计数仪的发展具有战略意义。
通常，可以使用诸如抗体的亲和产物来对比组织切片的形态结构。与使用组织化学染色剂相比，它们很昂贵，并且需要使用含金属的标签进行附加的标记程序。这种方法被用于成像质量细胞计数仪的开创性工作中，使用标记有可用镧系元素同位素的抗体，从而耗尽了功能性抗体的质量(例如金属)标签来回答生物学问题。
本发明扩展了包括诸如ag、au、ru、w、mo、hf、zr等元素的可用同位素的目录(包括诸如用于识别粘液基质的钌红、用于识别胶原纤维的三色染色剂、作为细胞复染的四氧化锇的化合物)。银染用于核型分析。硝酸银对核仁组织区域(nor)相关蛋白进行染色，产生深色区域，其中沉积了银，并指示nor中rrna基因的活性。适用于imc可能需要修改方案(例如，用高锰酸钾氧化、在过程中用1％的银浓度)以使用较低浓度的银溶液，例如小于0.5％、0.01％或0.05％的银溶液。
自金相扩增技术已发展成为组织化学中的重要工具。许多内源性和有毒的重金属形成硫化物或硒化物纳米晶体，可以通过与ag离子反应自动催化放大。然后，imc可以很容易地看到较大的ag纳米簇。目前，已经建立了用于zn-s/se纳米晶体的银放大检测以及通过形成银-硒纳米晶体检测硒的鲁棒方案。此外，市售的量子点(检测cd)也具有自催化活性，可用作组织化学标记。
本发明的方面可以包括组织化学染色剂及其在通过元素质谱法成像中的用途。通过元素质谱法可分辨的任何组织化学染色剂均可用于本发明。在某些方面，组织化学染色剂包括一个或多个质量原子，其大于用于对样本成像的元素质谱仪的截止值，诸如大于60amu、80amu、100amu或120amu。例如，组织化学染色剂可以包括本文所述的金属标签(例如，金属原子)。金属原子可以被螯合到组织化学染色剂上，或者被共价结合在组织化学染色剂的化学结构内。在某些方面，组织化学染色剂可以是有机分子。组织化学染色剂可以是极性的、疏水的(例如亲脂的)、离子的或可以包含具有不同性质的基团。在某些方面，组织化学染色剂可以包含多于一种化学剂。
组织化学染色包括小于2000、1500、1000、800、600、400或200amu的小分子。组织化学染色剂可以通过共价或非共价(例如离子或疏水)相互作用与样本结合。组织化学染色剂可以提供对比度，以解决生物样本的形态问题，例如，帮助识别单个细胞、细胞内结构和/或细胞外结构。可以通过组织化学染色剂分辨的细胞内结构包括细胞膜、细胞质、细胞核、高尔基体、内质网、线粒体和其他细胞器。组织化学染色剂可能对某种生物分子具有亲和力，诸如核酸、蛋白质、脂质、磷脂或碳水化合物。在某些方面，组织化学染色剂可以结合dna以外的分子。合适的组织化学染色剂还包括结合细胞外结构(例如，细胞外基质的结构)的染色剂，包括基质(例如粘膜基质)、基底膜、间质基质、蛋白质(例如胶原蛋白或弹性蛋白)、蛋白聚糖、非蛋白聚糖多糖、细胞外囊泡、纤连蛋白、层粘连蛋白等。
在某些方面，组织化学染色剂和/或代谢探针可以指示细胞或组织的状态。例如，组织化学染色剂可包括活体染色剂，诸如顺铂、曙红和碘化丙锭。其他组织化学染色剂可能会染色用于缺氧，例如可能仅在缺氧条件下结合或沉积。诸如碘脱氧尿苷(idu)或其衍生物的探针可能会染色用于细胞增殖。在某些方面，组织化学染色剂可能不指示细胞或组织的状态。检测细胞状态(例如生存力、低氧和/或细胞增殖)但在体内(例如对活体动物或细胞培养物)施用的探针可用于任何本方法中，但不适合作为组织化学染色剂。
组织化学染色剂可能对一种类型的生物分子具有亲和力，诸如核酸(例如dna和/或rna)、蛋白质、脂质、磷脂、碳水化合物(例如糖，诸如单糖或二糖或多元醇；寡糖；和/或多糖(诸如淀粉或糖原)、糖蛋白和/或糖脂。在某些方面，组织化学染色剂可以是复染色。
以下是特定组织化学染色剂及其在本方法中的用途的实例：
钌红染色剂可作为粘液基质检测中的一种含金属的染色剂，其可如下使用：免疫染色的组织(例如，脱石蜡的ffpe或冷冻切片)可以用0.0001-0.5％、0.001-0.05％、少于0.1％、少于0.05％或约0.0025％的钌红处理(例如，在4-42℃或室温下至少5分钟、至少10分钟、至少30分钟或约30分钟)。可以例如用水或缓冲溶液冲洗生物样本。然后可以在通过元素质谱仪成像之前将组织干燥。
磷钨酸(例如，作为三色染色剂)可以用作胶原纤维的含金属的染色剂。载玻片上的组织切片(脱石蜡的ffpe或冷冻切片)可以固定在布安氏(bouin's)液中(例如，在4-42℃或约室温下至少5分钟、至少10分钟、至少30分钟或约30分钟)。然后可将切片用0.0001％-0.01％、0.0005％-0.005％或约0.001％的磷酸肌酸处理(例如，在4-42℃或约室温下至少5分钟、至少10分钟、至少30分钟或约15分钟)。然后，在通过元素质谱仪成像之前，可以用水和/或缓冲溶液冲洗样本，并可选地干燥。与通过光学(例如荧光)显微镜成像所使用的浓度相比，可以以稀释度(例如5倍、10倍、20倍、50倍或更大的稀释度)使用三色染色剂。
在一些实施例中，组织化学染色剂是有机分子。在一些实施例中，第二金属是共价键合的。在一些实施例中，第二金属被螯合。在一些实施例中，组织化学染色剂特异性结合细胞膜。在一些实施例中，组织化学染色剂是四氧化锇。在一些实施例中，组织化学染色剂是亲脂的。在一些实施例中，组织化学染色剂特异性结合细胞外结构。在一些实施例中，组织化学染色剂特异性结合细胞外胶原蛋白。在一些实施例中，组织化学染色剂是包含磷钨/磷钼酸的三色染色剂。在一些实施例中，在样本与抗体接触后使用三色染色剂，诸如以比用于光学成像的浓度更低的浓度，例如其中浓度是三色染色剂的50倍稀释以上。
含金属药物
医学中的金属是药理学中一个令人兴奋的新领域。对于在金属离子掺入金属蛋白、核酸金属配合物或含金属的药物或蛋白质之前暂时存储金属离子所涉及的细胞结构或者药物降解后金属离子的命运，了解较少。揭示痕量金属的运输、储存和分配所涉及的调控机制的重要第一步是对金属进行识别和定量，理想情况下是根据其在组织、细胞甚至单个细胞器和亚细胞区室中的天然生理环境。组织学研究通常在组织的薄切片或培养的细胞上进行。
许多含金属的药物被用于治疗各种疾病，但是对于它们的作用或生物分布机理还了解较少：顺铂、咪唑钌、带mo的基于金属茂的抗癌药、带w的钨茂化合物(tungstenocene)、带hf或zr的b-二酮配合物、带au的金诺芬、聚氧钼酸盐药物。许多金属配合物用作mri造影剂(gd(iii)螯合物)。金属基抗癌药物的摄取和生物分布特征对于理解和最小化潜在毒性至关重要。
药物中存在的某些金属的原子质量属于质量细胞计数仪的范围。具体而言，顺铂和其他具有pt配合物的化合物(异丙酚、洛铂)被广泛用作治疗广泛癌症的化学治疗药物。铂基抗癌药的肾毒性和骨髓毒性是众所周知的。利用本文所述的方法和试剂，现在可以检查它们在组织切片内的亚细胞定位，以及与带质量(例如金属)标签的抗体和/或组织化学染色剂的共定位。化学治疗药物可能通过直接dna损伤、dna损伤修复途径抑制、放射性等对某些细胞(例如增殖细胞)有毒。在某些方面，化学治疗药物可以通过抗体中间体靶向肿瘤。
在某些方面，含金属的药物是化学治疗药物。本方法可以包括在获得生物学样本之前，将含金属的药物施用于活体动物，诸如动物研究模型或人类患者，如前所述。生物学样本可以是例如癌组织或原代细胞的活检。可替代地，可以将含金属的药物直接添加到生物样本中，该生物样本可以是永生细胞系或原代细胞。当动物是人类患者时，本方法可包括基于检测含金属药物的分布来调节包括含金属药物的治疗方案。
检测含金属药物的方法步骤可以包括通过元素质谱对含金属药物进行亚细胞成像，并且可以包括检测含金属药物在细胞内结构(诸如细胞膜、细胞质、细胞核、高尔基体、内质网、线粒体和其他细胞器)和/或细胞外结构(诸如包括基质、粘膜基质、基底膜、间质基质、诸如胶原蛋白或弹性蛋白的蛋白质、蛋白聚糖、非蛋白聚糖多糖、细胞外囊泡、纤连蛋白、层粘连蛋白等)。
解析(例如结合)上述结构中的一个或多个的组织化学染色剂和/或质量(例如金属)标记的sbp可以与含金属的药物共定位，以检测到药物保留在特定的细胞内或细胞外结构。例如，化学治疗药物诸如顺铂可以与结构诸如胶原蛋白共定位。可替代地或另外地，药物的定位可以与细胞生存力、细胞增殖、缺氧、dna损伤反应或免疫反应的标志物的存在有关。
在一些实施例中，含金属的药物包含非内源性金属，诸如其中非内源性金属是铂、钯、铈、镉、银或金。在某些方面，含金属的药物是顺铂、咪唑钌、带mo的基于金属茂的抗癌药、带w的钨茂化合物(tungstenocene)、带hf或zr的b-二酮配合物、带au的金诺芬、聚氧钼酸盐药物、带pd的n-肉豆蔻酰基转移酶-1抑制剂(三(二亚苄基丙酮)二铝)或其衍生物。例如，药物可以包含pt，并且可以是例如顺铂、卡铂、奥沙利铂、异丙基铂、洛巴铂或其衍生物。含金属的药物可以包括非内源性金属，诸如铂(pt)、钌(ru)、钼(mo)、钨(w)、铪(hf)、锆(zr)、金(au)、钆(gd)、钯(pd)或其同位素。可以在组织切片中识别出用于光热疗法治疗癌症的金化合物(例如金诺芬)和金纳米颗粒生物缀合物。
多元分析
本公开的一个特征是其能够检测样本中的多个(例如10个以上、甚至多达100个以上)不同的目标sbp成员，例如检测多种不同的蛋白质和/或多种不同的核酸序列。为了允许差异检测这些目标sbp成员，它们各自的sbp成员应带有不同的标记原子，以便可以区分其信号。例如，在检测到十种不同的蛋白质的情况下，可以使用十种不同的抗体(每种抗体对不同的靶蛋白质具有特异性)，每个抗体带有唯一的标记，从而可以区分来自不同抗体的信号。在一些实施例中，期望使用针对单个靶标的多种不同抗体，例如识别相同蛋白质上的不同表位。因此，由于这种类型的冗余，一种方法可以使用比靶标更多的抗体。然而，通常，本公开将使用多个不同的标记原子来检测多个不同的靶标。
如果本公开使用了不止一种标记的抗体，则优选的是，抗体应对其各自的抗原具有相似的亲和力，因为这有助于确保检测到的标记原子的数量与靶抗原的丰度之间的关系。组织样本在不同的sbp之间(尤其是在高扫描频率下)将更加一致。类似地，优选的是，各种抗体的标记具有相同的效率，从而使每个抗体携带相当量的标记原子。
在一些情况下，sbp可能带有荧光标记以及元素标签。然后可以使用样本的荧光来确定样本的区域，例如组织切片，其包含受关注材料，然后可以对其进行采样以检测标记原子。例如，可以将荧光标记物与抗体缀合，该抗体与癌细胞上丰富的抗原结合，然后可以将任何荧光细胞作为靶标，以确定与标记原子缀合的sbp所引起的其他细胞蛋白的表达。
如果目标sbp成员位于细胞内，则通常需要在样本与标记物接触之前或过程中透化细胞膜。例如，当靶标是dna序列但标记的sbp成员不能穿透活细胞的膜时，组织样本的细胞可以被固定和透化。然后，标记的sbp成员可以进入细胞并与目标sbp成员形成sbp。在这方面，可以利用与ihc和fish一起使用的已知方案。
可以使用一种方法来检测至少一个细胞内靶标和至少一个细胞表面靶标。然而，在一些实施例中，本发明可用于检测多个细胞表面靶标，而忽略细胞内靶标。总体而言，靶标的选择将由该方法所需的信息来确定，因为本公开将提供样本中所选靶标的位置的图像。
如本文进一步所述，包含标记原子的特异性结合对象(即，亲和试剂)可用于染色(接触)生物样本。合适的特异性结合对象包括抗体(包括抗体片段)。标记原子可以通过质谱区分(即，可以具有不同的质量)。当标记原子包括一个或多个金属原子时，本文可将其称为金属标签。金属标签可以包括具有碳主链和各自结合金属原子的多个侧基的聚合物。可替代地或另外地，金属标签可以包括金属纳米颗粒。可以通过共价或非共价相互作用用金属标签来标记抗体。
抗体染色剂可用于以细胞或亚细胞分辨率对蛋白质成像。本发明的方面包括使样本与一种或多种特异性结合由生物样本的细胞表达的蛋白质的抗体接触，其中该抗体被第一金属标签标记。例如，可以使样本与5种以上、10种以上、15种以上、20种以上、30种以上、40种以上、50种以上抗体接触，每种抗体均具有可区分的金属标签。样本可以在用抗体染色样本之前、期间(例如，为了简化工作流程)或之后(例如，避免改变抗体的抗原靶标)进一步与一种或多种组织化学染色剂接触。样本可以进一步包含本文所述的一种或多种含金属的药物和/或累积的重金属。
用于本发明的金属标记的抗体可以特异性结合不包含金属的代谢探针(例如，ef5)。其他金属标记的抗体可以特异性结合荧光和光学显微镜中使用的传统染色剂的靶标(例如，上皮组织、基质组织、细胞核等)。此类抗体包括抗钙粘着蛋白、抗胶原蛋白、抗角蛋白、抗efs、抗组蛋白h3抗体、以及本领域已知的许多其他抗体。
组织化学染色剂
具有一个或多个固有金属原子的组织化学染色剂可以与本文所述的其他试剂和使用方法结合。例如，组织化学染色剂可以与含金属的药物、金属标记的抗体和/或积累的重金属共定位(例如，以细胞或亚细胞分辨率)。在某些方面，一种或多种组织化学染色剂可以以比其他成像方法(例如荧光显微镜、光学显微镜或电子显微镜)更低的浓度(例如，少于一半、四分之一、十分之一等)使用。
为了可视化和识别结构，可以使用多种组织学染色剂和指示剂并对其进行充分表征。含金属的染色剂可能会影响病理学家对成像质量细胞计数仪的接受程度。众所周知，某些含金属的染色剂可揭示细胞成分，并且适用于本发明。此外，可以在数字图像分析中使用定义明确的染色剂，从而为特征识别算法提供对比度。这些功能对于成像质量细胞计数仪的发展具有战略意义。
通常，可以使用诸如抗体的亲和产物来对比组织切片的形态结构。与使用组织化学染色剂相比，它们很昂贵，并且需要使用含金属的标签进行附加的标记程序。这种方法被用于成像质量细胞计数仪的开创性工作中，使用标记有可用镧系元素同位素的抗体，从而耗尽了功能性抗体的质量(例如金属)标签来回答生物学问题。
本发明扩展了包括诸如ag、au、ru、w、mo、hf、zr等元素的可用同位素的目录(包括诸如用于识别粘液基质的钌红、用于识别胶原纤维的三色染色剂、作为细胞复染的四氧化锇的化合物)。银染用于核型分析。硝酸银对核仁组织区域(nor)相关蛋白进行染色，产生深色区域，其中沉积了银，并指示nor中rrna基因的活性。适用于imc可能需要修改方案(例如，用高锰酸钾氧化、在过程中用1％的银浓度)以使用较低浓度的银溶液，例如小于0.5％、0.01％或0.05％的银溶液。
自金相扩增技术已发展成为组织化学中的重要工具。许多内源性和有毒的重金属形成硫化物或硒化物纳米晶体，可以通过与ag离子反应自动催化放大。然后，imc可以很容易地看到较大的ag纳米簇。目前，已经建立了用于zn-s/se纳米晶体的银放大检测以及通过形成银-硒纳米晶体检测硒的鲁棒方案。此外，市售的量子点(检测cd)也具有自催化活性，可用作组织化学标记。
本发明的方面可以包括组织化学染色剂及其在通过元素质谱法成像中的用途。通过元素质谱法可分辨的任何组织化学染色剂均可用于本发明。在某些方面，组织化学染色剂包括一个或多个质量原子，其大于用于对样本成像的元素质谱仪的截止值，诸如大于60amu、80amu、100amu或120amu。例如，组织化学染色剂可以包括本文所述的金属标签(例如，金属原子)。金属原子可以被螯合到组织化学染色剂上，或者被共价结合在组织化学染色剂的化学结构内。在某些方面，组织化学染色剂可以是有机分子。组织化学染色剂可以是极性的、疏水的(例如亲脂的)、离子的或可以包含具有不同性质的基团。在某些方面，组织化学染色剂可以包含多于一种化学剂。
组织化学染色剂包括小于2000、1500、1000、800、600、400或200amu的小分子。组织化学染色剂可以通过共价或非共价(例如离子或疏水)相互作用与样本结合。组织化学染色剂可以提供对比度，以解决生物样本的形态问题，例如，帮助识别单个细胞、细胞内结构和/或细胞外结构。可以通过组织化学染色剂分辨的细胞内结构包括细胞膜、细胞质、细胞核、高尔基体、内质网、线粒体和其他细胞器。组织化学染色剂可能对某种生物分子具有亲和力，诸如核酸、蛋白质、脂质、磷脂或碳水化合物。在某些方面，组织化学染色剂可以结合dna以外的分子。合适的组织化学染色剂还包括结合细胞外结构(例如，细胞外基质的结构)的染色剂，包括基质(例如粘膜基质)、基底膜、间质基质、蛋白质(例如胶原蛋白或弹性蛋白)、蛋白聚糖、非蛋白聚糖多糖、细胞外囊泡、纤连蛋白、层粘连蛋白等。
组织化学染色剂和/或代谢探针可以指示细胞或组织的状态。例如，组织化学染色剂可包括活体染色剂，诸如顺铂、曙红和碘化丙锭。其他组织化学染色剂可能会染色用于缺氧，例如可能仅在缺氧条件下结合或沉积。诸如碘脱氧尿苷(idu)或其衍生物的探针可能会染色用于细胞增殖。在某些方面，组织化学染色剂可能不指示细胞或组织的状态。检测细胞状态(例如生存力、低氧和/或细胞增殖)但在体内(例如对活体动物或细胞培养物)施用的探针可用于任何本方法中，但不适合作为组织化学染色剂。
组织化学染色剂可能对一种类型的生物分子具有亲和力，诸如核酸(例如dna和/或rna)、蛋白质、脂质、磷脂、碳水化合物(例如糖，诸如单糖或二糖或多元醇；寡糖；和/或多糖(诸如淀粉或糖原)、糖蛋白和/或糖脂。在某些方面，组织化学染色剂可以是复染色。
可用于本文的常见组织化学染色剂包括钌红和磷钨酸(例如，三色染色剂)。
除了对样本进行特殊染色外，有时，由于向组织或生物体中施以含金属的药物，或由于环境中积累的金属，样本可能含有金属原子。有时，可以在基于脉冲追赶实验策略使用此技术的方法中对组织或动物进行测试，以观察含金属材料的保留和清除情况。
例如，医学中的金属是药理学中一个令人兴奋的新领域。对于在金属离子掺入金属蛋白、核酸金属配合物或含金属的药物或蛋白质之前暂时存储金属离子所涉及的细胞结构，或者药物降解后金属离子的命运，了解较少。揭示痕量金属的运输、储存和分配所涉及的调控机制的重要第一步是对金属进行识别和定量，理想情况下是根据其在组织、细胞甚至单个细胞器和亚细胞区室中的天然生理环境。组织学研究通常在组织的薄切片或培养的细胞上进行。
许多含金属的药物被用于治疗各种疾病，但是对于它们的作用或生物分布机理还了解较少：顺铂、咪唑钌、带mo的基于金属茂的抗癌药、带w的钨茂化合物(tungstenocene)、带hf或zr的b-二酮配合物、带au的金诺芬、聚氧钼酸盐药物。许多金属配合物用作mri造影剂(gd(iii)螯合物)。金属基抗癌药物的摄取和生物分布特征对于理解和最小化潜在毒性至关重要。
药物中存在的某些金属的原子质量属于质量细胞计数仪的范围。具体而言，顺铂和其他具有pt配合物的化合物(异丙酚、洛铂)被广泛用作治疗广泛癌症的化学治疗药物。铂基抗癌药的肾毒性和骨髓毒性是众所周知的。利用本文所述的方法和试剂，现在可以检查它们在组织切片内的亚细胞定位，以及与带质量(例如金属)标签的抗体和/或组织化学染色剂的共定位。化学治疗药物可能通过直接dna损伤、dna损伤修复途径抑制、放射性等对某些细胞(例如增殖细胞)有毒。在某些方面，化学治疗药物可以通过抗体中间体靶向肿瘤。
在某些方面，含金属的药物是化学治疗药物。本方法可以包括在获得生物学样本之前，将含金属的药物施用于活体动物，诸如动物研究模型或人类患者，如前所述。生物学样本可以是例如癌组织或原代细胞的活检。可替代地，可以将含金属的药物直接添加到生物样本中，该生物样本可以是永生细胞系或原代细胞。当动物是人类患者时，本方法可包括基于检测含金属药物的分布来调节包括含金属药物的治疗方案。
检测含金属药物的方法步骤可以包括通过元素质谱对含金属药物进行亚细胞成像，并且可以包括检测含金属药物在细胞内结构(诸如细胞膜、细胞质、细胞核、高尔基体、内质网、线粒体和其他细胞器)和/或细胞外结构(诸如包括基质、粘膜基质、基底膜、间质基质、诸如胶原蛋白或弹性蛋白的蛋白质、蛋白聚糖、非蛋白聚糖多糖、细胞外囊泡、纤连蛋白、层粘连蛋白等)。
解析(例如结合)上述结构中的一个或多个的组织化学染色剂和/或金属标记的sbp可以与含金属的药物共定位，以检测到药物保留在特定的细胞内或细胞外结构。例如，化学治疗药物诸如顺铂可以与结构诸如胶原蛋白共定位。可替代地或另外地，药物的定位可以与细胞生存力、细胞增殖、缺氧、dna损伤反应或免疫反应的标志物的存在有关。
在某些方面，含金属的药物是顺铂、咪唑钌、带mo的基于金属茂的抗癌药、带w的钨茂化合物(tungstenocene)、带hf或zr的b-二酮配合物、带au的金诺芬、聚氧钼酸盐药物、带pd的n-肉豆蔻酰基转移酶-1抑制剂(三(二亚苄基丙酮)二铝)或其衍生物。例如，药物可以包含pt，并且可以是例如顺铂、卡铂、奥沙利铂、异丙基铂、洛巴铂或其衍生物。含金属的药物可以包括非内源性金属，诸如铂(pt)、钌(ru)、钼(mo)、钨(w)、铪(hf)、锆(zr)、金(au)、钆(gd)、钯(pd)或其同位素。可以在组织切片中识别出用于光热疗法治疗癌症的金化合物(例如金诺芬)和金纳米颗粒生物缀合物。
摄入食物或水、通过皮肤接触或吸入气溶胶，可能会导致暴露于重金属。重金属可能会积聚在人体的软组织中，因此长时间暴露会对健康产生严重影响。在某些方面，通过在动物研究模型中的受控暴露或通过在人类患者中的环境暴露，可以在体内积累重金属。重金属可以是有毒的重金属，诸如砷(as)、铅(pb)、锑(sb)、铋(bi)、镉(cd)、锇(os)、铊(tl)或汞(hg)。
单细胞分析
本公开的方法包括激光消融样本中的多个细胞，因此分析来自多个细胞的羽状物，并将其内容映射到样本中的特定位置以提供图像。在大多数情况下，使用该方法的用户将需要将信号定位到样本中的特定细胞，而不是整个样本中。为此，可以标定样本中细胞的边界(例如质膜或某些情况下的细胞壁)。
可以通过多种方式来标定细胞边界。例如，可以使用可标定细胞边界的常规技术来研究样本，例如如上所述的显微镜检查。因此，当执行这些方法时，包含如上所述的相机的分析系统特别有用。然后可以使用本公开的方法制备该样本的图像，并且可以将该图像叠加在较早的结果上，从而允许将检测到的信号定位在特定细胞上。实际上，如上所述，在一些情况下，激光消融可以仅针对样本中的细胞子集，通过基于显微镜的技术，该细胞子集被确定为受关注的
然而，为了避免使用多种技术的需要，标定细胞边界可以作为本公开的成像方法的一部分。此类边界标定策略是ihc和免疫细胞化学所熟悉的，并且可以通过使用可检测到的标记来适用这些方法。例如，该方法可以包括标记已知位于细胞边界的目标分子，然后可以将来自这些标记的信号用于边界标定。合适的目标分子包括细胞边界的丰富或通用标志物，诸如粘附配合物的成员(例如β-连环蛋白或e-钙粘蛋白)。一些实施例可以标记一种以上的膜蛋白以增强标定。
除了通过包括合适的标记来标定细胞边界外，还可以以此方式标定特定的细胞器。例如，诸如组蛋白(例如h3)的抗原可以用于识别细胞核，并且还可以标记线粒体特异性抗原、细胞骨架特异性抗原、高尔基体特异性抗原、核糖体特异性抗原等，从而允许通过本公开的方法分析细胞超微结构。
标定细胞(或细胞器)边界的信号可以用肉眼评估，也可以通过计算机使用图像处理进行分析。此类技术在本领域中对于其他成像技术是已知的，例如arce等人(2013；scientificreports3，article2266)描述了一种分割方案，该方案使用空间滤波由荧光图像确定细胞边界，ali等人(2011；machvisappl23:607-21)公开了一种根据明场显微镜图像确定边界的算法，pound等人(2012；plantcell24:1353-61)公开了cellset方法以从共焦显微镜图像提取细胞几何形状，以及hodneland等人(2013；sourcecodeforbiologyandmedicine8:16)公开了用于荧光显微镜图像的cellsegmmatlab工具箱。对于本公开有用的方法使用分水岭变换和高斯模糊。这些图像处理技术可以单独使用，也可以先使用这些技术然后再用肉眼检查。
一旦标定了细胞边界，就可以将信号从特定的目标分子分配给单个细胞。也可以量化单个细胞中目标分析物的量，例如通过根据定量标准对方法进行校准。
参考粒子
如本文所述，可以将已知元素或同位素组成的参考粒子添加到样本(或样本载体)中，以在检测样本中的目标元素离子期间用作参考。在某些实施例中，参考粒子包含金属元素或同位素，诸如过渡金属或镧系元素。例如，参考粒子可以包含质量大于60amu、大于80amu、大于100amu或大于120amu的元素或同位素。
目标元素(诸如标记原子)可以在样本运行中基于从各个参考粒子中检测到的元素离子进行归一化。例如，本方法可以包括在从单个参考粒子检测元素离子与仅检测目标元素离子之间切换。
使用水凝胶进行分析前样本扩展
常规的光学显微术被限制在照明光源波长的一半左右，最小可行分辨率为约200nm。扩展显微术是一种样本制备方法(特别是对于生物样本)，该方法使用聚合物网络物理地扩展样本，从而将样本的光学可视化分辨率提高至20nm左右(wo2015127183)。扩展过程可用于制备用于成像质谱和成像细胞计数仪的样本。通过此过程，在未扩展的样本上，直径为1μm的消融斑点将提供1μm的分辨率，但是在扩展后，1μm的消融斑点可表示～100nm的分辨率。
生物样本的扩展显微术通常包含以下步骤：固定、锚定准备、胶凝、机械均质化和扩展。
在固定阶段，将样本化学固定并清洗。但是，特定的信号传导功能或酶促功能(诸如蛋白质-蛋白质相互作用)作为生理状态的函数，可以使用扩展显微术检查而无需固定步骤进行检查。
接下来，制备样本，使得它们可以附接(“锚定”)到在随后的凝胶化步骤中形成的水凝胶。在此，将本文中其他地方讨论的sbp(例如可以特异性结合样本中受关注目标分子的抗体、纳米抗体、非抗体蛋白、肽、核酸和/或小分子)与样本一起温育，从而与样本中存在的目标sbp结合。可选地，可以用可用于成像的可检测化合物标记(有时称为“锚定”)样本。对于光学显微术，可检测的化合物可以包含例如由荧光标记的抗体、纳米抗体、非抗体蛋白质、肽、核酸和/或可以特异性结合样本中受关注目标分子的小分子而提供的化合物(us2017276578)。对于质量细胞计数，包括成像质量细胞计数，可检测标记可以由例如被元素标签标记的抗体、纳米抗体、非抗体蛋白质、肽、核酸和/或可以特异性结合样本中受关注目标分子的小分子提供。在一些情况下，与靶标结合的sbp不含有标记，而是含有可以与第二sbp结合的特征(例如，与靶标结合的一抗以及与一抗结合的二抗，如在免疫组织化学技术中很常见)。如果仅使用第一sbp，则其本身可以连接至将样本附着或交联到随后的凝胶化步骤中形成的水凝胶的部分上，从而可以将样本束缚到水凝胶上。可替代地，如果使用第二sbp，则该第二sbp可能包含将样本附着或交联到水凝胶的部分。在一些情况下，使用第三sbp，则该第三sbp结合到第二sbp。chen等人，2015(science347:543-548)中提出了一种示例性实验方案，其使用一抗结合至靶标，二抗结合至一抗，其中二抗附接至寡核苷酸序列，然后是与附接至第二抗体的序列互补的寡核苷酸作为第三sbp，其中第三sbp包含可以掺入丙烯酰胺水凝胶的甲基丙烯酰基。在一些情况下，包含掺入水凝胶中的部分的sbp也包括标记。这些标记可以是荧光标记或元素标记，因此可用于随后的分析，例如通过流式细胞术、光学扫描和荧光法(us2017253918)、或质量细胞计数或成像质量细胞计数。
通过将包含紧密交联的、带高电荷的单体的水凝胶注入样本中，胶凝阶段在样本中产生基质。例如，丙烯酸钠与共聚单体丙烯酰胺和交联剂n-n’亚甲基双丙烯酰胺已被引入到固定的和可渗透的脑组织中(参见chen等人，2015)。当聚合物形成时，它结合了在锚固步骤中与靶标连接的部分，从而使样本中的靶标连接到凝胶基质上。
然后用均质剂处理样本以使样本的机械特性均质化，使得样本不抵抗扩展(wo2015127183)。例如，可以通过用酶(诸如蛋白酶)降解、通过化学蛋白水解(例如通过溴化氰)、通过将样本加热到70-95摄氏度或通过物理破坏(诸如超声处理)来使样本均质化(us2017276578)。
然后，通过在低盐缓冲液或水中渗析配合物，使样本/水凝胶配合物扩展，以使样本在3维方向上扩展至其原始大小的4倍或5倍。随着水凝胶的扩展，样本以及特别连接到靶标的标记物和水凝胶也扩展，同时保持标记物的原始三维布置。由于样本扩展是在低盐溶液或水中扩展的，因此扩展后的样本是透明的，允许深入样本进行光学成像，并且在进行质量细胞计数(例如通过使用蒸馏水或通过其他工艺纯化，包括电容性去离子、反渗透、碳过滤、微滤、超滤、紫外线氧化或电去离子)时，无需显著引入污染元素即可进行成像。
然后可以通过成像技术分析扩展后的样本，从而提供伪改进的分辨率。例如，荧光显微术可以与荧光标记一起使用，并且成像质量细胞计数可以与元素标记一起使用、任选地组合使用。由于水凝胶的溶胀和扩展样本中的标记之间的距离相对于天然样本的增加，以前无法单独分辨的标记(由于光学显微镜中可见光的衍射极限或imc中的斑点直径而导致)。
存在扩展显微术(exm)的变体，其也可以使用本文公开的设备和方法来应用。这些变体包括：蛋白质保留exm(proexm)、扩展荧光原位杂交(exfish)、迭代exm(iexm)。迭代扩展显微术涉及在已经使用上述技术进行了初步扩展的样本中形成第二种可扩展聚合物凝胶。溶解第一扩展凝胶，然后扩展第二可扩展的聚合物凝胶以使总扩展达到约20倍。例如，chang等人，2017(natmethods14:593-599)将该技术基于以上讨论的chen等人(2015)的方法，替代的是用可裂解的交联剂(例如，可在高ph下裂解其二醇键的市售交联剂n,n'-(1,2-二羟基乙烯)双丙烯酰胺(dheba)制作第一凝胶。在第一凝胶的锚定和扩展之后，将标记的寡核苷酸(包含用于掺入第二凝胶的部分)和与掺入到第一凝胶中的寡核苷酸互补的寡核苷酸被添加到扩展样本中。形成了第二凝胶，其掺入了标记的寡核苷酸的部分，并且第一凝胶通过可裂解的接头的裂解而分解。然后以与第一凝胶相同的方式使第二凝胶扩展，从而使标记物进一步在空间上分离，但相对于原始样本中靶标的排列，仍保持其空间布置。在一些情况下，在第一凝胶扩展之后，使用中间的“重新包埋凝胶”以将扩展的第一凝胶保持在适当的位置，同时进行实验步骤，例如使标记的sbp与第一凝胶基质杂交。在第一水凝胶和再包埋凝胶被分解以允许第二水凝胶扩展之前，形成未扩展的第二水凝胶。如前所述，所使用的标记可以是荧光或元素标签，并且因此在随后的分析中适当地通过例如流式细胞术、光学扫描和荧光术、或质量细胞计数或成像质量细胞计数使用。
定义
术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，例如，“包含”x的组合物可能仅由x组成，也可能包括另外的其他内容，例如x+y。
与数值x有关的术语“约”是可选的，并且是指例如x+10％。
词语“基本上”不排除“完全”，例如，“基本上不含”y的组合物可以完全不含y。在必要时，本公开的定义可以省略词语“基本上”。
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