复杂基质中分析物的定量质谱分析中基质效应校正的方法

本发明涉及分析化学和定量质谱(ms)领域，以及更具体地，涉及校正用于由样品基质引起的电离效率的变化的测量数据的方法，以便获得有关样品中化合物的相对量或绝对量的信息，其与样品基质无关。

背景技术：

液相色谱-质谱(lc-ms)是目前用于分析不同领域的有机化合物，诸如环境分析、食品分析、生物分析或代谢组学的最广泛的分析技术。由于其高选择性、高灵敏度和高通量，此技术也被越来越多地用于临床实验室。质谱检测器提供的高选择性允许具有最少样品处理和高通量分析的分析方法的发展，因为经常不需要完全的lc分离作为唯一的鉴别因子。

然而，已经发现即使没有被识别为影响方法选择性的干扰物，共洗脱化合物可影响分析物的电离，以及因此改变或抑制其定量。电离中的效应(其可以是正的，即离子增强，或者是负的，即离子抑制)称为基质效应，目前是lc-ms中的主要问题中的一个，尤其从定量的角度看。尽管已经提出了许多理论来解释基质效应，但是确切的机制仍无法解释并且复杂。然而，对于电喷雾电离，已知的是，分析物的电离效率是高度依赖于其物理化学性质的，如以下所指出：annesleytm，ionsuppressioninmassspectrometry.clinchem.2003；47(7)：1041-4，以及kingr，bonfiglior，fernandez-metzlerc，miller-steinc，olaht.mechanisticinvestigationofionizationsuppressioninelectrosprayionization.jamsocmassspectrom.2000；11(11)：942-50。

一方面，具有高电离势的分子是更容易被电离的，以及另一方面，具有高表面亲和力的分子更容易接触液滴的表面中的多余电荷。

同样地，共洗脱化合物要么在液相中，通过影响液滴形成，阻碍溶剂去溶剂化或竞争多余电荷，要么在气相中经由质子交换，对电离过程产生不同程度的影响。在任何情况下，离子抑制或增强过程都在电离源中进行，以及因此所用电离源的类型及其设计都会影响基质效应。

因此，通过共洗脱物质的存在，基质效应改变电离效率。lc-ms中基质效应的一个问题是：它本身在色谱图中是看不见的，但对分析方法的准确性和灵敏性有有害的影响。当比较不同样品源中分析物之间的定量结果时，基质效应经常变得尤其地有问题。不同源中的化合物种类和定量的高变化性经常伴随着高的相对基质效应，一般导致不可靠的结果。

基质效应的另一问题是：它以非线性的方式依赖于分析物浓度和基质，导致系统误差(偏差)以不可控制的、不可预测的以及非线性的方式向下传播，使得算法不可能去报告有意义的统计，以作为数据处理质量和可靠性的衡量。换句话说，峰处理的结果不是鲁棒的，并且就定量结果(其取决于特定的实验或样品组成)而言可能是不可靠的。

当使用相同仪器时这个问题会出现，但仪器-到-仪器的变化也出现问题，尤其对于生物标记的发现和分析，其中，从一组不同的样本中将大量分析物的质谱数据彼此定量比较，以用于差异分析。

目前用于校正由共洗脱化合物引起的离子抑制引起的响应差异的金标准是使用稳定同位素类似物作为内部标准。这种稳定同位素标记的内部标准物(这里称为stil-is)显示出与未标记的类似物相同的理化性质，以及可以在分析前加标到样品中。然后通过确定目标分析物及其stil-is的响应比来进行定量。

然而，在无目标的lc-ms分析中，stil-is的使用是不可能，这是因为目标分析物经常是未知的。即使在有目标的lc-ms分析中，对每个目标分析物使用stil-is经常是不可能、不实际或太贵的。

此外，如果使用一个stil-is对几个相关化合物进行分析(像经常做的那样)，则内部标准校正将仅在基质效应随着色谱运行是恒定的情况下才有效。然而，这不是经常的情况，以及因此，由于基质效应的高保留时间依赖性，对于stil-is和其他目标分析物，基质效应可能是极其不同的。在某些情况下，这种保留时间依赖性甚至使stil-is无法校正分析物的基质效应，例如，有时在基于氘的stil-is情况下，由于氘同位素效应引起的保留时间中的轻微变化。

相应地，获得用于校正定量lc-ms分析中的复杂样品的基质效应的方法以克服现有技术的上述缺陷和缺点将是期望的并且高度有利的。这将是尤其有用的：能够定量地比较基质之间化合物的浓度，而不用获得对于每个化合物的参考标准或稳定标记的同位素或类似内部标准物，这是因为这些不是经常可获得的。甚至更有用的是：这些浓度可以转变成绝对浓度，使仪器和数据库之间的浓度数据比较成为可能。这样做对于代谢物将是更有帮助的，所述代谢物在测量时未被识别，但后来被识别，以及然后在识别(在测量的样品中识别，所述测量是在识别所述代谢物前进行的)后去定量它们。

提高定量的方法涉及标准注入柱后的添加，用于对基质效应校正。柱后添加的标准或改性剂的使用前已经描述了被用于多个应用，例如使化合物衍生化，引导片段化，或增强电离。wo2016071695公开了动态的柱后添加，其中，将分离后的试剂添加到洗脱液，这会以时间序列的方式影响例如目标分析物的电离效率/稳定性/加合物形成。

先前的方法已经使用了标准的柱后添加来校正已知化合物的基质效应。例如，在wo-a-2010149595中，已知浓度的、已知目标化合物的连续柱后注入与注入的样品一起被应用，用于允许补偿或校正测量的输出。stahnke等，analchem，2009，81，2185-2192通过使用1pci-is在具有lc-ms/ms的多残留分析中监测物质的柱后注入，对基质效应进行补偿，以校正一完整组的已知的以及可获得的分析物。

基质效应已经通过其他方式校正，诸如由kruve等，analyticachemicaacta651(2009)75-80所描述的，其公开了一种在lc/esi/ms中对抗基质效应的方法：外推稀释法，无需使用柱后添加。

尽管本文上面公开的方法在提高定量方面取得了一些进展，但是没有解决无目标的分析带来的问题，以及如果在注入的样品中没有离子抑制(但可能在另外样品中有)，这些方法中没有一个具有有效的方式来选择合适的pc-is。

为了存储与合适的校正有关的分析特性，有必要建立正在研究的特征库。经常创建关于分析物的信息库和集合以提高数据质量。us-a-20160203963公开了一种用于质量校正的方法：建立具有通过色谱运行洗脱的基质组分的一个(或多个)理化特性的库。然后，通过色谱时间，样品中基质组分的测量误差被用于校正在已知基质化合物之间洗脱的目标分析物的相同的理化特性的误差。已经建立了这个库和其他库来收集分析物的化学性质，但到目前为止，它们无法为影响定量的、由基质组分引起的未知分析物的相互作用提供解决方案。

本发明的目的是提供一种用于校正分析技术中的样品基质效应的替代方法以及根据所述方法操作的系统。

技术实现要素：

根据本发明的第一方面，公开了用于通过分析系统定量样品中的一个或多个分析物的方法，所述分析系统包括分离单元、添加柱后溶液的装置、以及检测单元，所述检测单元包括耦合通过电离源的质谱仪。所述方法包括：

i.通过以下一个或多个步骤，对样品中的分析物和柱后注入的内部标准(pci-is)诱导基质效应：

ii.在分离后以及在引入到质谱仪的电离源前(本文称为柱后)，将一个或多个测试基质(基质b)添加到洗脱液；

ii.通过将样品基质与其他测试基质(基质c)混合，改变样品基质(基质a)的组成；

iii.改变样品基质(基质a)的浓度；

以及

ii.将最匹配分析物对基质效应的响应的一个或多个柱后注入的内部标准(pci-is)与每个分析物匹配，以及

iii.将分析物匹配的pci-is标识以及可选地相关联的响应数据存储在库中；以及

iv.将分析物匹配的pci-is应用到其他样品中的分析物，以校正在电离期间分析物对基质效应的峰响应，以及可选地使用响应数据获得分析物的(绝对)定量。

根据本发明的第二方面，可以将与分析物匹配的pci-is应用到其他样品中的分析物，以校正电离期间分析物对基质效应的峰响应，导致更准确、以及随着时间的推移的、更精确的定量。因此，在第二方面，本发明涉及用于确定样品中的一个或多个分析物的结构和/或定量的系统，所述系统包括：

v.分析系统，其包括样品分离单元、用于添加溶液柱后的装置、以及检测单元，所述检测单元包括耦合通过电离源的质谱仪；

vi.被可选地使用地，用于对样品中的分析物诱导基质效应的单元；

vii.将最匹配分析物对基质效应的响应的一个或多个柱后注入的内部标准(pci-is)与每个分析物匹配的单元，以及

viii.库单元，其将分析物匹配的pci-is标识以及可选地相关联的响应数据存储在库中，以及

ix.处理单元，其用于将分析物匹配的pci-is应用到另外样品中的分析物，以校正电离期间分析物对基质效应的峰响应，以及可选地获得分析物的浓度数据。

在第三方面，本发明涉及用于确定样品中一个或多个分析物的结构和/或定量的测试基质组成，其中，所述组成包括：能够形成加合物的一种或多种盐和/或离子化合物，具有表面活性的化合物和/或具有高质子亲和力的化合物，和/或生物学来源的基质、其一部分，或预期对样品中的分析物诱导基质效应的其他化合物，其以预定的浓度，以及合适的溶剂或洗脱液。

在第四方面，本发明涉及用于在系统中使用的试剂盒(kit)，其用于确定和校正在样品中的分析物的检测上的样品基质效应，所述试剂盒包括一个或多个基质组成，所述一个或多个基质组成包括能够形成加合物的一种或多种盐和/或离子化合物，具有表面活性的化合物和/或具有高质子亲和力的化合物，和/或生物学来源的基质、其一部分，或预期对样品中的分析物诱导基质效应的其他化合物，其以预定的浓度，以及合适的溶剂或洗脱液。

在本发明的第五方面，公开了用于通过分析系统定量样品中的一个或多个分析物的方法，其中，所述一个或多个分析物能够是尚未指定结构的特征，或者是具有已知的结构、没有参考材料可获取的化合物，或者是由于成本或不稳定性而参考材料的使用不实际的化合物，所述分析系统包括分离单元、添加柱后溶液的装置以及检测单元，所述检测单元包括耦合通过电离源的质谱仪，所述方法包括：

x.对样品中的分析物和柱后注入的内部标准(pci-is)诱导基质效应；以及

xi.将最匹配分析物对基质效应的响应的一个或多个柱后注入的内部标准(pci-is)与每个分析物匹配，以及

xii.将分析物匹配的pci-is标识以及可选地相关联的响应数据存储在库中；以及

xiii.将分析物匹配的pci-is应用到其他样品中的分析物，以校正在电离期间分析物对基质效应的峰响应，以及可选地使用响应数据获得分析物的(绝对)定量。

从以下优选的实施方式的详细描述以及结合附图去阅读的独立权利要求和从属权利要求，本发明的这些方面和其他方面、特征和优点将变得明显。

附图说明

在下文中，参考附图，进一步描述本发明的实施方式，其中，同类字母和数字指的是同类部分，以及其中，本节中的图示出了优选的仪器设置、根据本发明的pci-is的选择、用于校正分析物的响应和实际校正程序。

图1：所描述基质效应校正方法的可能的仪器设置的示意整体图，所述方法用于复杂基质中化合物的定量目标质谱分析和无目标的质谱分析。

图2示意性地表示了以下情况时的lc-ms结果：样品中的分析物经受诱导的基质效应，以及找到最匹配分析物对基质效应的响应的pci-is，以选择其用于其他样品中分析物的pci-is校正。

图3是通过pci-is信号对分析物信号的逐扫描校正的示意图。

图3示意性地表示了通过pci-is信号对分析物信号的重建。将分析物的信号(实线，图3a)逐扫描除以pci-is的信号(图3a中的断线)，以获得重建的分析物信号(图3b)。在此图中，pci-is2指的是被选择最匹配图2中分析物对诱导的基质效应的响应的pci-is，因此，y轴被限定为校正强度。

图4：使用柱后注入内部标准校正基质效应的原理。样品中油酸-dl7的提取的离子色谱图，其中，通过改变样品基质(血浆)浓度(a)来诱导基质效应。pci-issfa(16：0)-d31(b)和lpc(19：0)(c)的提取的离子色谱图。油酸-dl7的重建的离子色谱图，通过逐扫描将油酸-dl7强度除以pci-isfa(16：0)-d31(d)和lpc(19：0)(e)的强度获得。

图5公开了通过以下方式对样品中分析物的基质效应的诱导：添加柱后基质(基质b)，即样品和五个pci-is在常规分析运行和具有诱导基质效应(由于基质的柱后添加)的运行中的提取的离子色谱图。

图6显示了每一批中特征786的平均峰面积，没有任何校正(图6a)，仅具有内部标准校正(图6b)，和具有pci-is亮氨酸-脑啡肽和内部标准校正(图6c)。

图7显示了将选择的pci-is通过不同批和样品基质应用到研究样品中测得的分析物。相对于学术溶液中相同浓度的双氯芬酸的平均峰响应，每一个研究样品中双氯芬酸的峰响应的箱线图。具有相同颜色的箱线图具有相同的总体样品基质。图7a)显示了没有任何校正，图7b)显示了仅具有内部标准校正，图7c)显示了具有pci-is和内部标准校正。灰色阴影是优选值100％的15％以内的面积。

具体实施方式

除非另有说明，本文使用的所有技术以及科学术语具有与在本发明所属领域的普通技术人员所经常理解的相同含义。本文在本发明的描述中使用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式的目的，而不是为了对本发明的限制。

将关于特定的实施方式以及参考某些附图来描述本发明，但本发明不限于此，而是仅由权利要求限制。权利要求中的任何参考符号不应被解释为限制范围。所描述的附图仅是示意性的并且是非限制性的。在附图中，出于说明性目的，一些元件的大小可能被夸张并且未按比例绘制。在本说明书和权利要求中使用术语“包括”不排除其他元件或步骤。当使用不定冠词或定冠词提及单数名词时，例如“一”或“一种”、“所述”包括那个名词的复数，除非其他特别说明。

此外，说明书和权利要求中的术语“第一”、“第二”、“第三”等术语是用于区分相似的元件，而不一定是用于描述连续的或按时间先后的顺序。应当理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，以及本文描述的本发明的实施方式能够以不同于本文描述或示出的其他顺序操作。

提供以下术语或定义仅为了帮助理解本发明。这些定义不应被解释为具有小于本领域中普通技术的人员所理解的范围。

如在此所用的术语“分析物”指的是在本发明的方法中要被检测和/或被定量的物质。

如在此所用的如此术语“样品”涉及包括基质(即样品基质)的组成，其中有目标分析物。

如在此所用的术语“样品基质效应”指的是样品基质对样品中的分析物的电离的效应。

术语“样品基质”理解为是指样品中存在的不是分析物的化合物。

术语“基质”理解为是指包括一种或多种化合物、但本质上不含目标分析物的组成。这些成分可包括内源性成分，诸如磷脂、碳水化合物和内源性代谢物；来自腹膜内、静脉内或口服给药实验的残留制剂成分；例如聚乙二醇，聚山梨酯；共洗脱药物代谢物；使用的伴随药物和/或流动相添加剂或溶剂，其可与目标分析物显示出相互作用；或来自样品操作或处理的污染物。

术语“测试基质”指的是除样本基质以外的基质。

在用于本发明的基质中，可有利地选择成分成使得它们是已知的、并处于确定的浓度。根据本发明的合适的基质包括本质上不对分析物诱导基质效应的溶剂或溶剂的组合，和/或能够形成加合物的一种或多种盐和/或离子化合物，和/或具有表面活性的一种或多种化合物，和/或具有高质子亲和力的一种或多种化合物，和/或一种或多种生物学来源的基质或其部分，和/或预期对样品中的分析物诱导基质效应的其他化合物。

在本说明书的上下文中，当在分离后以及在引入到质谱仪的电离源前被添加到洗脱液，即用于作为柱后基质添加时，测试基质在本文中被称为基质b。其中，样品基质(也称为基质a)被替代为或被添加到一个或多个其他基质，其中，分析物、它们的稳定同位素和/或其他非内源类似物被加标到此基质中，这些被称为测试基质c或基质c。

术语“校正样品基质效应”理解为调节样品中的分析物的响应以补偿电离期间的样品基质效应。

术语“柱后注入的内部标准(pci-is)”理解为在分离后以及引入到质谱仪的电离源前添加到洗脱液的内部标准；其中，合适的添加单元被称为标准或测试基质的“柱后添加装置”。

本发明提供了用于根据本发明的方法校正样品基质效应的方法、工具和系统。本发明是基于以下观察：样品基质的成分可影响分析物的检测以及尤其分析物的定量。分析物可能是已知的，或未知的，或已知的但没有可用的合适的标准以用于使用校准实验来确定浓度。

样品基质的这种影响可通过以下方式确定：比较不同测试基质的效果，以及通过在相同条件下将它们关联，以及最后通过使用最可能适用的校正值来校正测量值，由此确保样品中的分析物的、更准确和更可靠的检测和/或定量。

通过本发明的方法确定的样品基质效应的来源是可变的，并且将取决于样品的性质。

根据本发明设想其中检测分析物的样品包括来自生物材料的样品以及衍生自或提取自此生物材料的组成。样品可以是包括要检测的分析物的任何制剂。样品可包括例如身体组织或流体的全部或几种成分，所述流体诸如但不限于血液，包括血浆和血小板部分、脊髓液、粘液、痰、唾液、精液、粪便或尿液或其任何部分。

示例性样品可包括源自于以下的材料：全血、红细胞、白细胞、发、指甲和表皮材料、拭子、包括但不限于口腔拭子、咽喉拭子、阴道拭子、尿道拭子、宫颈拭子、咽喉拭子、直肠拭子、病变拭子、脓肿拭子、鼻咽拭子等、淋巴液、羊水、脑脊液、腹腔积液、胸腔积液、囊肿液、滑液、玻璃体液、房水、滑囊液、洗眼液、眼睛抽吸物、血浆、血清、肺灌洗液、肺抽吸物、体内任何组织的活检材料、以及从上述示例性生物样品中的任一个获得的裂解物、提取物或材料。

组织培养细胞，包括外植材料、原代细胞、继代细胞系等，以及从任何细胞、组织或器官获得的裂解物、提取物、上清液或材料，也在本文所用的术语生物样品的含义内。在使用本发明的方法进行分析物检测的背景下，也设想了包括微生物和病毒的样品。从法医环境获得的材料也在术语“样品”的预期含义内。

样品也可包括食品和饮料，化妆品，环境样品，诸如水、土壤、沙子、空气样品等，其中，应注意的是，以上列表中的任一个都不是为了详尽的。

本发明的方法是涉及分析物的检测的方法。要检测的分析物的性质对于本发明不是关键的，以及可以是用于检测的任何目标分子或分子的聚集体。分析物的非详尽列表包括蛋白质、多肽、肽、氨基酸，核酸、寡核苷酸、核苷酸、核苷、碳水化合物、多糖、脂多糖、糖蛋白、脂蛋白、核蛋白、脂质、激素、类固醇、生长因子、细胞因子、神经递质、受体、酶、抗原、过敏原、抗体、代谢物、辅因子、营养素、毒素、毒药、药物、生物战剂、生物危害剂、传染剂、朊病毒、维生素、免疫球蛋白、白蛋白、血红蛋白、凝血因子、白细胞介素、干扰素、细胞因子、包括肿瘤特异性表位的肽和对上述任何物质的抗体。分析物可包括一个或多个复杂的聚集体，诸如但不限于病毒、细菌、微生物，诸如沙门氏菌、链球菌、军团菌、大肠杆菌、贾第鞭毛虫、隐孢子虫、立克次体、孢子、霉菌、酵母、藻类、变形虫、甲藻、单细胞生物、病原体或细胞，以及细胞表面分子、片段、部分、成分、产物、有机小分子、核酸和寡核苷酸、微生物的代谢物。

经常存在于样品或样品的半纯化部分中的典型化合物和条件可引起样品基质效应。然而，对本发明而言，识别样品基质效应的诱发性因子不是关键的。

本发明的过程可有利地以几个不同的方式执行以诱导样品中分析物的基质效应。这里主要区分三个方法，所述三个方法可单独使用，或以组合的形式使用：

a.在分离后以及在引入到质谱仪的电离源前(本文称为柱后)，将一个或多个测试基质(基质b)添加到洗脱液；

b.通过将样品基质与其他测试基质(基质c)混合，改变样品基质(基质a)的组成；

c.改变样品基质(基质a)的浓度

在任一情况下，即无论是在有或没有诱导基质效应的情况下执行分析的情况下，一个或多个pci-is被注入。而且，除了使用一个或多个pci-is之外，在样品准备期间也向样品添加一个或多个内部标准可以是有利的。优选地，这些可用于校正样品准备和/或样品注射量的变化性。优选地，这些也应该通过pci-is校正。

图1示意性地示出了在复杂基质中的分析物的定量质谱分析中，用于基质效应校正的方法的优选的仪器设置。优选地，存在分离单元，所述分离单元包括例如液相色谱单元。优选地，电离源是电喷雾电离源。

根据本发明的优选的方法包括一种方法，其中，在权利要求1的步骤(a)中的基质效应的诱导包括以下步骤中的一个或多个：

d.在分离后以及在引入到质谱仪的电离源前(本文称为柱后)，将一个或多个测试基质(基质b)添加到洗脱液；

e.通过将样品基质与其他测试基质(基质c)混合，改变样品基质(基质a)的组成；

f.改变样品基质(基质a)的浓度

优选地，在步骤(d)中，所述一个或多个基质包括至少一个化合物，或多个化合物，以预期对样品中的分析物诱导基质效应。有利地，测试基质从以下选择：能够形成加合物的一种或多种盐和/或离子化合物，和/或具有表面活性的化合物，和/或具有高质子亲和力的化合物，和/或生物学来源的基质、其一部分，和/或预期对样品中的分析物诱导基质效应的一种或多种其他化合物。

优选地，在(e)中，测试基质(基质c)包括本质上不对分析物诱导基质效应的溶剂或溶剂的组合，或生物学来源的基质、其一部分和/或预期对样品中的分析物诱导基质效应的一种或多种化合物。

更优选地，本发明还涉及用于为每个分析物确定最匹配分析物对基质效应的响应的pci-is的方法，包括：

g.为样品中的每个分析物确定信号，所述信号例如峰面积，其由以下重建：每个pci-is，以及优选在样品准备前或期间添加的内部标准，可选地，在有或没有诱导基质效应的情况下，如上文所述；以及

h.基于(g)，评估哪个pci-is最匹配分析物对诱导的基质效应的响应。

有利地，在有和没有诱导基质效应的情况下，对每个分析物确定每个pci-is和内部标准重建信号的方法包括以下一个或多个步骤：

i.可选地，在分析前，向样品添加一个或多个内部标准；

j.样品的分析物经受于分析系统，同时向洗脱液添加一个或多个柱后pci-is(溶液)；

k.通过应用本文上述指定的程序中的一个或多个，重复样品的分析物经受于分析系统，同时诱导基质效应；

l.在相同的分析运行中，将在每个样品中逐扫描分析物的信号(或强度)除以pci-is信号(或强度)，得出pci-is重建的分析物信号(或峰响应)；

m.可选地，在相同的测量运行中，将逐扫描的内部标准(其在分析前添加到样品中)的信号(或强度)除以其匹配的pci-is的信号(或强度)，得出pci-is校正的内部标准信号(或峰响应)；

n.可选地，在相同的测量运行中，将pci-is重建的分析物信号(或峰响应)除以适用的pci-is校正的内部标准信号(或峰响应)，得出pci-is和内部标准重建的峰响应。

优选地，在样品准备过程中添加到样品中的内部标准包括pci-is的结构类似物和/或pci-is的稳定同位素标记版本。

优选地，在步骤(l)和/或(m)和/或(n)中，对信号应用平滑算法或平均算法。

优选地，对于每个分析物评估哪个pci-is最匹配分析物对诱导的基质效应的响应包括：基于用于的准确度值，选择pci-is，优选地，通过比较具有基质b或基质c的样品中的分析物响应与没有基质b或基质c时获得的测量值。

优选地，对于每个分析物评估哪个pci-is最匹配分析物对诱导的基质效应的响应包括：基于pci-is(和可选地内部标准)重建的、跨基质和/或样品的、分析物的峰响应的精确度的值，选择pci-is。

有利地，pci-is的选择是基于其增加分析物的线性动态范围的能力和/或基于准确度的值和/或基于精确度的值。

优选地，将最匹配分析物对诱导的基质效应的响应的pci-is存储在库单元中，以备后用。

优选地，将库中分析物匹配的pci-is应用到其他样品中的分析物，包括步骤：

o.在分析前，向样品可选地不添加、添加一个或多个内部标准；

p.样品的分析物经受于分析系统；

q.向洗脱液添加一个或多个柱后pci-is(溶液)；

r.将样品中发现的分析物信号与存储在库单元中的分析物匹配；

s.如上文在步骤l至n中详述的，使用库单元中匹配的pci-is和可选的内部标准，重建样品中的每个分析物对基质效应的质谱响应，以获得(最终的)pci-is和内部标准校正的峰响应。

优选地，使用在后来的实验中被发现适合于校正此分析物的pci-is，回溯性数据处理被应用，以校正分析物的基质效应。

优选地，使用基于被发现适合于校正基质效应的pci-is和已经利用pci-is至少测量过一次的分析物的校准系列的pci-is校正，应用前瞻性或回溯性数据处理来绝对定量测量的分析物。

本过程优选地包括选择最匹配分析物对基质效应的响应的pci-is。为了选择最匹配分析物对基质效应的响应的pci-is，通过改变样品中的基质或添加柱后基质(基质b)来诱导基质效应。

优选地，使用多种测试基质对样品中的分析物诱导基质效应，其中，使用单独的测试基质对分析物的诱导效应，用于(a)分析物的至少部分结构识别分类或另一种部分识别；和/或(b)优化pci-is或pci-is的组合的选择，其最匹配分析物对诱导的基质效应的响应。

优选地使用lc方法通过lc柱，分离包含分析物的样品，然后将流连接到包含具有或没有基质b的pci-is溶液的流。可通过任何合适的方式提供pci-is溶液流，诸如比如lc泵或注射泵。然后将组合的流指引向质谱仪的电离源(图1)。在用于确定样品中的一个或多个分析物的结构和/或定量的优选的测试基质组成中，所述组成包括能够形成加合物的一种或多种盐和/或离子化合物，具有表面活性的化合物，和/或具有高质子亲和力的化合物，和/或生物来源的基质、其一部分，或预期对样品中的分析物诱导基质效应的其他化合物，其以预定的浓度，以及合适的溶剂或洗脱液。

本发明还涉及一种方法，其中，pci-is信号或分析物与pci-is之间的信号比被用于质量控制目的。

本发明涉及用于在系统中使用的试剂盒，其用于确定和校正在样品中的分析物的检测上的样品基质效应，所述试剂盒包括一个或多个基质组成，其包括能够形成加合物的一种或多种盐和/或离子化合物，具有表面活性的化合物，和/或具有高质子亲和力的化合物，和/或生物学来源的基质、其一部分，或预期对样品中的分析物诱导基质效应的其他化合物，其以预定的浓度，以及合适的溶剂或洗脱液。

此外，本方法可用于将基质效应诱导入未知样品中，其包含尚未识别的分析物，或其结构是已知的、但尚未利用pci-is建立校准模型的分析物，其一旦利用pc-is测量了校准模型，以后使用测量的数据以定量绝对量。可通过使用具有相似结构(其用于预期或预测其电离效率是相似的)的分析物的校准模型来估计已识别的化合物的浓度。实际上，对于这种估计，分析物的确切结构不一定是已知的，但化合物一定要充分表征以估计响应因子。

现在将利用以下实施例描述本发明可在其中使用的典型系统，说明本发明在有目标的分析和无目标的分析中的价值。

实施例1：在实际情况下选择最匹配的pci-is

背景：在脂肪酸的lc-ms分析中，经常将一个内部标准加标到样品中，以及用于校正多种脂肪酸，如果基质效应随保留时间不同，则可导致不精确的结果。在此，我们研究了使用pci-is校正示例性脂肪酸(油酸-dl7)的基质效应的可能性。此实施例集中于从两个测试的pci-is中选择最匹配的pci-is。

方法和结果：将在ipa中的油酸-dl7的溶液添加到多种体积(10、20、30、40和50ul)的血浆的蛋白质沉淀的干燥上清液中。窗格a显示了油酸-dl7的提取的离子色谱图(eic)。它显示了增加血浆(基质a)的浓度对油酸-dl7的响应有抑制效应。两个pci-is：fa(16：0)-d31(具有窗格b中eic)和lpc(19：0)(具有窗格c中eic)被注入。窗格d显示油酸-dl7的pci-isfa(16：0)-d31重建的峰响应，以及窗格e显示油酸-dl7的lpc(19：0)重建的峰响应。

图4显示了使用柱后注入内部标准进行基质效应校正的原理。

图4显示了通过改变注射溶液(权利要求2d)(窗格a、窗格b和窗格c)中的样品基质的浓度，对样品中的分析物诱导基质效应的原理，以及两个柱后注入内部标准(窗格d和窗格e)的校正效应的原理。

在此，显示了样品中油酸-dl7的提取的离子色谱图，其中，通过改变样品基质(血浆)浓度(a)，基质效应被诱导。pci-isfa(16：0)-d31(b)和lpc(19：0)(c)的提取的离子色谱图。通过逐扫描将油酸-dl7强度除以pci-isfa(16：0)-d31(d)和lpc(19：0)(e)的强度，获得油酸-dl7的重建离子色谱图。

当窗格a中未校正的峰面积的变异系数(cv)为21％，窗格d和窗格e中的未校正峰面积的变异系数分别是4.6％和9.9％。视觉评估也显示，利用fa(16：0)-d31对油酸-dl7的信号的校正与不校正或利用lpc(19：0)的校正相比是更适当的。

这个实施例显示，利用fa(16：0)-d31作为pci-is，可容易地校正油酸-dl7测量，导致与不校正或利用lpc(19：0)作为pci-is校正相比更精确的结果。

实施例2：显示了本发明对有目标的分析和无目标的分析的应用，使用液相色谱耦合质谱(lc-ms)对样品中的分析物定量。

背景：对(微)生物样品执行无目标的分析，所述(微)生物样品可分为具有不同生物学来源的四组，因此具有四个不同的样品基质。目的是检测和定量特征，以及能够比较所有批和所有基质及其之间的定量结果。

方法：为了检测特征以及确定最匹配分析物对基质效应的响应的pci-is，创建反映完整的样品组的样品池。对此，单独的样品被准备、干燥、在含有内部标准(0.25μg/ml的大豆苷元-d6)的溶液中重建以及汇集(pooled)。它们通过以下方法被分心：使用lc-ms方法，在lc分离后、电离之前，将pci-is溶液(包含63.5ng/ml的大豆苷元、141.5ng/ml的氢化可的松、240.5ng/ml的亮氨酸-脑啡肽、38.2ng/ml的西咪替丁和1428.5ng/ml的缓激肽，在乙腈/水中，50/50，v/v)以20μl/min的流速被注入。在添加相同的pci-is溶液的同时，重复样品分析，但包括基质b(100μm的乙酸钾，1μm十二烷基三甲基铵和30μm的l-高精氨酸)以诱导基质效应。

将最好地校正对分析物诱导的基质效应的pci-is与所述分析物配对并存储在库中。

随后将库应用于46-66研究样品的14批的分析中，涵盖了4种不同的生物基质。此外，在每批中一式三份地分析质量控制样品(代表所有研究样品的汇集样品，包括所有基质)。

方法包括本文下面描述的三种成分，以及用此来诱导基质效应。它显示了使用柱后注入内部标准(pci-iss)以校正基质效应，以及校正长期一般仪器响应的价值，这是通过减少批之间分析结果的变化获得的。

结果：无目标的分析

执行峰检测和匹配，首先在有和没有基质b的相同样品之间对每个样品进行分析，然后在不同样品之间。由于这个实施例是为了解释本发明的原理，焦点将放在样本中的一个中检测到的一个(代表性的)特征上。这个特征编号为786。图5a显示了它和五个pci-is的提取的离子色谱图，其在常规分析运行中和具有诱导的基质效应(由于基质的柱后添加)的运行中。图5b显示了由每个pci-is(逐扫描相除)重建的特征786峰。图5c在左窗格中显示了内部标准(大豆苷元-d6)及其未标记的同位素pci-is大豆苷元的eic，以及在右窗格中显示了在常规分析运行中和在具有诱导的基质效应的分析运行中pci-大豆苷元校正的内部标准峰。用pci-is对内部标准校正的好处是清晰明显的。在分析前添加到样品中的内部标准大豆苷元-d6被用于校正在注射量或样品准备期间可能的变化。为了为特征786选择优选的pci-is，首先，在有和没有诱导的基质效应的情况下(表1中列出)，确定pci-is校正的内部标准大豆苷元-d6的峰面积(图5c，右窗格)。然后，图5b中计算了特征786的每个pci-is重建的峰面积(表1中列出)，没有对内部标准进行任何校正。在这一点上，pci-is氢化可的松似乎最好地校正pci-is，在有和没有诱导的基质效应的样品之间有-4.7％的差异。然而，为了补偿注射量的变化，特征786的pci-is重建的峰面积被内部标准的pci-is校正(意味着被其除以)的峰面积校正，得出pci-is和内部标准校正的峰面积。然后再次，将有诱导的基质效应的运行中校正的峰面积与在常规分析运行中的峰面积进行比较。现在，亮氨酸-脑啡肽(pci-is得出了最小的差异(-1.9％))是在对诱导的基质效应校正中五个pci-is中最好的，以及因此存储在库中，以在未来的样品分析中对特征786校正。

应用于研究的这些后续样本分析时，pci-is的价值开始变得清晰，其中，实际的样品被进行测量。在质量控制(qc)样品中检测特征786，其在14批中的每一个中一式三份地被测量。图6显示了每批中以下情况特征786的平均峰面积：没有任何校正(图6a)，仅通过内部标准校正(图6b)，以及通过pci-is亮氨酸-脑啡肽和内部标准校正(图6c)。它显示了pci-is和内部标准校正方法如何能够将各批之间的变化(％cv)从16％降低到8％，以及在此之上，它如何对未校正峰中观察到的趋势校正，其得出在批1-7中相对小的面积，而在批8-14中较大的面积。另一方面，图3b中的曲线显示，当仅使用内部标准时，可获得相似的结果，各批之间的％cv也为8％。这提出了问题：仅使用内部标准是否是不足够的。在这样的情况下，这可能确实是足够的，其中，一个qc样品在多批测量，其中样品的基质是相同的，因为它是相同的样品。使用pci-is校正的真正价值是其校正基质效应的能力，这仅在比较不同的样品时才可以说明，如在下面部分中描述的有目标的分析实施例中。图5显示了通过添加柱后基质(基质b)，对样品中的分析物诱导的基质效应。

图5a)显示了样品中特征786和5个pci-is标准的提取的离子色谱图，样品在没有诱导的基质效应(连续线)的情况下和有诱导的基质效应(断线)情况下，其通过柱后注入的基质b对样品进行分析。b)样品中通过pci-is中的每一个校正之后重建的特征786的峰，样品在没有诱导的基质效应(连续线)的情况下和有诱导的基质效应(断线)情况下，其通过柱后注入的基质b对样品进行分析。c)在左窗格中，加标的内部标准(大豆苷元-d6)和非同位素标记的pci-is大豆苷元的提取的离子色谱图，以及在右窗格中，样品中校正的峰，在没有诱导的基质效应(连续线)的情况下和有诱导的基质效应情况下，其通过柱后注入的基质b对样品进行分析。

表1显示了最匹配分析物对诱导的基质效应的响应的pci-is的选择。通过以下方式计算峰响应：将峰的最高校正信号的10％之间的校正强度求和，以及减去这些强度的第一强度和最后强度之间的差，以减去(潜在的)基线。

表1：最匹配分析物对诱导的基质效应的响应的pci-is的选择。

图6显示了将选择的pci-is应用到不同批的qc样品中测量的分析物。每个qc样品中特征786的峰响应相对于14批中所有qc样品的平均峰响应，由此，图6a)显示了没有任何校正的响应，以及图6b)显示了仅有内部标准校正的响应，以及6c)有pci-is和内部标准校正。阴影面积指示在100％优选值的15％以内的面积。

实施例3：有目标的分析

作为质量控制措施的一部分，在分析前，将已知分析物双氯芬酸以相同浓度添加到所有研究样品中。本实施例中通过如之前所描述的相同的程序选择对双氯芬酸优选的pci-is，以用于无目标的分析，并且发现是亮氨酸-脑啡肽。将每个研究样品(每批46-66研究样品)中双氯芬酸的峰面积除以与样品(在每个研究批之前和之后重复地测量)相同浓度的学术溶液的双氯芬酸的总平均峰面积，以获得相对峰面积。这在以下情况下完成：没有任何校正(图7a)，仅有is校正(图7b)以及pci-is和is校正都有(图7c)。

在14批上计算，平均相对峰响应±标准偏差是112％±15(没有任何校正)、110％±7.3％(仅is校正)以及106％±3.0％(pci-is和is校正都有)。图7中的曲线图确实显示：有pci-is和内部标准的校正使具有相似和/或不同样品基质的样品在各批之间的变化最小化，以及使峰响应更接近学术样品中的峰响应。研究样品和学术样品中pci-is和is校正的峰响应之间的6％的差异可解释为双氯芬酸可吸附到例如样品准备期间的小瓶到样品基质存在时可能被占用的部位。尽管使用pci-is和is校正降低各批之间的变化，但由于引入了附加的误差源，增加了批内的变化。预期这可通过以下进一步优化：例如降低pci-is信号中、与非基质效应有关的变化(例如，通过稳定pci-is流，优化与洗脱液的混合和/或对信号应用平滑或平均算法)。另外，可使用多于一个的内部标准。在此实施例中，添加额外的内部标准可能已经减少批6中的变化性，其主要是由与基质效应无关的内部标准响应中的变化性引起的。

此实施例说明：根据本发明的pci-is校正使得定量和比较来自不同分析批中不同基质的样品中的分析物成为可能，无需对每个分析物的稳定的同位素标记的内部标准。再进一步，用pci-is和内部标准的校正允许使用单个校准曲线使对多种基质中的分析物的绝对定量成为可能，这仅在一个基质中准备的，甚至可能是学术性的，前提是与电离无关的样品基质效应(例如分析物在基质中的溶解度或对准备瓶壁的吸附)是不重要的或没有被考虑的。这将大大节省分析时间和成本，因为它会使每批中运行的校准线变得多余。

图7显示了将选择的pci-is应用于不同批和样品基质的研究样品中测量的分析物。每个研究样品中双氯芬酸的峰响应相对于学术溶液中相同浓度的双氯芬酸的平均峰响应的箱线图。具有相同颜色的箱线图具有相同的总体样本基质。图7a)显示了没有任何校正，图7b)显示了仅有内部标准校正，以及图7c)显示了具有pci-is和内部标准校正。灰色阴影面积表示优选值100％的15％以内的面积。图7中的⁺符号指示高于160％的异常值。在图a的批9中：163％；在图b的批1和批5中：分别为196％和667％(这些是由内部标准d峰面积的错误的确定引起的)；在图c的批1和批5中：分别为187％和727％(这是由内部标准峰面积的错误的确定引起的)。*符号指示超出1.5x四分位数间距，但小于160％的异常值。

以上实验显示了本方法允许校正基质效应的有效性。