本发明涉及制备、识别和选择生物结合分子的领域，尤其如选择性地结合到体细胞超突变的b细胞受体或b细胞受体复合物上的抗体或其片段。
背景技术：
在生化中，如果蛋白质或蛋白质复合物上结合有能够通过细胞内部中的结合事件来触发信号过程的信号分子，则该蛋白质或蛋白质复合物被称为受体(拉丁语为recipere，意为“接纳”或“接收”)。受体可以从外部接收信号，并且位于生物膜的表面处，或者可以在细胞溶质中检测到受体。受体具有用于其生理激动剂或拮抗剂(结合配对物、配体)的特异结合位点。
膜受体位于生物膜的表面处，并且由常常被改性(例如碳水化合物链)的蛋白质组成。它们具有用于小分子(所谓的配体)或者用于较大分子的结合到受体结构的部分的特定通过形状，其方式为这些小分子或部分作为互补结构来补充受体结构(简称为“锁-钥匙原理”)。
受体由此可以用于接纳和传导信号(信号传导)或者在功能上参与将细胞固定在一起(细胞粘附)或将物质传输到细胞中(膜传输)。另外，受体可以为病毒粒子提供贴靠在配合的宿主细胞处并感染宿主细胞的可能性。
对于细胞接触而言重要的膜受体不仅包括介导细胞-细胞接触的细胞粘附分子，如钙粘附蛋白、选择素(selectine)和免疫球蛋白，而且还包括参与形成细胞-基质接触和将细胞锚固在细胞外基质上的那些细胞粘附分子，如整合素(integrine)。
膜受体不仅出现在细胞质膜上，而且还出现在细胞内部中的细胞器的生物膜上。虽然位于外部的细胞膜受体将细胞与作为细胞环境的外部空间相关联，但是在细胞内部中单独的细胞器经由受体与细胞质、细胞骨架相关联或者彼此相关联。
在细胞膜内的受体根据其作用方式被细分成离子型和代谢型受体。
离子型受体形成离子通道，这些离子通道在结合适合的配体时以较高几率打开并且由此改变膜的传导性。
相反，代谢型受体不形成通道或孔，而是在结合其配体时将下游的“第二信使”(例如g蛋白或蛋白激酶)活化并且由此通过第二信使物质的浓度变化来调制细胞内的信号级联，这虽然是间接的但是也可以导致膜透过性的变化。
对于许多受体而言，存在天然的配体，这些配体导致这些受体的活化并且触发“第二信使”级联。除了天然的配体之外，还存在结合到受体上并且使其活化(激动剂)或失活(拮抗剂)的物质。受体激动剂的例子例如为抗原，包括过敏原、阿片类药物、尼古丁、沙丁胺醇、毒蕈碱、细胞因子和神经递质。
在此方面特殊的受体为b细胞受体或b细胞受体复合物(bcr)。这种bcr被b细胞表达并且几乎形成了与膜绑定的抗体。在成熟的b细胞中形成有各种各样的bcr。这种bcr一般为igd型或igm型。
在人类中以及还有在若干其他哺乳动物中，b细胞的发育在骨髓中或在胎儿肝脏中进行。正在发育的淋巴细胞从所谓的基质细胞获得发育程序所需的信号。在b细胞发育时，形成起作用的b细胞受体(“抗体”的与膜绑定的形式)具有决定性意义。只有利用这种抗原受体，成熟的b细胞稍后才能识别陌生的抗原并且通过形成对应的抗体来结合到敌对结构上。受体的抗原特异性通过连接特定的基因片段来确定。这些段称为v片段、d片段和j片段，因此该过程被称为v(d)j重组。在此，构成b细胞受体的结合抗原的部分的这些片段被重排。整个受体由两个相同的轻蛋白链和两个相同的重蛋白链组成，其中重链与轻链分别经由二硫桥键彼此连接。在vdj重组时，首先将b细胞受体的重链的v片段、d片段和j片段连接，然后将轻受体链的v片段和j片段连接。只有在基因被成功重排时(被称为有效基因重排)时，细胞才可以转到相应的下一个发育步骤中。
在其在骨髓中的成熟过程期间对身体自身的抗原做出反应的b细胞在大多数情况下由于细胞凋亡而死亡。在健康人的血液中可以检测到少量的自身反应性细胞，尤其针对甲状腺球蛋白或胶原蛋白(abulk.abbas:diseasesofimmunityinvinaykumar,abulk.abbas,nelsonfausto:robbinsandcotran-pathologicbasisofdisease.第7版.philadelphia2005,第224页起)。
将突变引入到成熟的b细胞的抗体基因中被称为体细胞超突变。这个事件在卵泡b细胞中发生。体细胞超突变是b细胞要到达亲和力成熟状态所经历的过程。它是适应性免疫系统的一个重要步骤。借助于酶“活化诱导的胞苷脱氨酶”(aid或也称aicda)产生了对dna的随机改变。aid将胞嘧啶在单链dna中脱氨成尿苷。酶ung去除尿嘧啶并且创造脱碱基位点。在那里由ape1产生单链断裂。结果以此方式激活了细胞内部的修复机制，然后通过该修复机制在修复时随机加入序列变化。然后这可能在氨基酸层面上导致结构变化且由此有条件地导致b细胞受体(bcr)的亲和性变化。当通过目前为止尚不清楚的机制使对抗原的亲和性达到特定强度时，这个过程结束。
通过选择，选出了最佳地结合抗原并且由此可以最有效地对抗抗原的那些细胞。其余的细胞则消亡。在次级淋巴器官(脾脏、淋巴结)的生发中心中进行的这个过程允许生物体产生大量不同的抗体，并且由此匹配于在免疫逃避过程中变化的病原体并且提高抗体对抗原的亲和性。这个步骤导致产生单一类型的b细胞群落，这些群落一般为单克隆或寡克隆的。如果此类群落参与了在自身免疫或恶性背景下的发病(无论是肈因性的还是辅助性的)，则可以通过从体内去除这些细胞来正面影响发病，其方式为使致病症状减少或完全消失。为了从体内选择性地去除这些b细胞，需要极具特异性的抗体。然后这些抗体例如可以作为基于膜的受体、作为嵌合受体的一部分(例如借助于car-t细胞)或者作为治疗用抗体以可溶形式使用。另一种应用形式是预治疗用的血浆净化法，其中与基质绑定的抗体被用于将恶性细胞从血液中分离。患者的肿瘤负荷可能由此显著降低，并且于是免疫系统在较低程度上承受由于剩余细胞的死亡造成的负担。
去除这些特定的b细胞导致免疫系统不会像所有b细胞死亡时那样完全瘫痪并且丧失此前的免疫性(例如在感染或接种疫苗之后)，而是即使受到治疗患者仍然具有继续可用的免疫系统。
为了生成针对受体的抗体，一般将这些受体的可溶形式(以重组且经纯化的形式)用于对小鼠进行免疫。在少见的情况下还可以使用肽片段。借助于杂交瘤技术，由小鼠中产生的特定b细胞创造了产生抗体的杂交瘤细胞。
这些杂交瘤细胞产生抗体，然后借助于elisa或借助于所表达的受体在细胞系统中测试这些抗体。为此使用常规方式建立的细胞系，因为只有这些细胞系能够以简单方式得以培养。在此可以产生相对特异性地结合至某一受体类型(例如抗iggi、抗ige)的抗体。然而在此通常产生与其他受体或其他表位的交叉反应。
对于bcr抗体的治疗用途而言，总体上仅使用一种针对bcr的抗体在大多数情况下是不足的，因为如此的大范围使用可能触发严重的副作用。相反，值得期望的是，提供一种选择性结合到受体上的抗体，该受体具有活化作用、尤其例如不希望的(病理生理学的或自主的)活化作用。此类抗体在现有技术中是未知的，并且不存在用于制备或通过选择获得该抗体的方法。
技术实现要素：
因此，本发明的目的在于提供一种用于制备或提取并识别或选择生物结合分子、尤其如抗体或其功能性片段的系统，这些抗体或片段以高选择性结合到亲和力成熟的bcr上，该亲和力成熟的bcr与种系编码的bcr组分序列的区别在于超体细胞突变。由此可以开发针对疾病特异b细胞的抗体，这些抗体可以有利地在个体化治疗的范围内使用。在此重要的是，在选择范围内使用的受体或受体复合物具有正确的折叠并且由此优选是有效的。
根据一个优选的实施方式，在将bcr用于选择之前检验bcr的功能性。如果在测量之前用4-oh他莫昔芬诱导这些细胞，则可以通过测量钙信号来检测bcr的活化(dührenvonmindenetal.2012,nature489,309-313页)。作为特异选择的参照，构造了与没有体细胞超突变的靶bcr相对应的bcr。
这个目的通过提供根据独立权利要求的方法来实现。优选的实施方式是对应的从属权利要求的主题。
具体实施方式
在详细解说本发明的各个方面之前，对在本说明书范围内使用的相关术语进行解释。
种系型的b细胞受体(即，bcr，其氨基酸序列被基因序列编码，如在细胞基因组中存在并且由此与之对应的)通过基因合成产生并且相对于体细胞超突变的受体为同源受体类型。
“生物结合分子”在本文中例如但不仅仅理解为包括融合蛋白的抗体。有利地并且因此优选地，此类抗体选自由以下项组成的组：igg抗体、igm抗体、人源化的igg抗体和插入了表位识别序列的人类抗体。还可以以整个抗体的功能性片段的形式提供此类结合分子，例如作为fab片段。结合分子还可以包括其他另外的例如导致肿瘤形成物死亡/死掉并且由此具有免疫毒素和/或免疫细胞因子功能的区域(例如“抗原-药物共轭物”，adc)。此类结合分子尤其还可以为膜结合型或细胞结合型的。结合分子的此类膜结合形式例如为car-t细胞上的嵌合型抗原受体(“chimericantigenreceptor”，car)。对于诊断应用而言，结合分子可以包括可检测的标记物，尤其如一种或多种荧光染料。
在b细胞表面上b细胞受体复合物(bcr)的任务是识别并结合病原体。如已经提及的，这种结合导致bcr的构象变化，由此触发信号级联，该信号级联最终导致b细胞的活化。因为生成此类bcr的过程是基于基因片段的随机组装，所以可能出现的是，新产生的bcr不希望地识别身体自有的结构并且因此以不希望的方式“持续活化”。为了避免产生此类“有永久活性的或永久活化的”bcr，存在各种身体自有的保护机制。然而如果由于正在发育的b细胞的病理变化而克服了这些保护机制，则可能从中发育出恶性的或还有以自身免疫方式表现的疾病。在其他情况下可以通过暴露于抗原来使具有不希望的bcr特性的b细胞成熟。
在b细胞成熟期间，可能由于将b细胞暴露于抗原而造成被称为体细胞超突变的效果，其中通过酶活性来提高在种系中预先确定的bcr可变性。在此在bcr的dna序列中加入随机变化并对其进行选择。结果是，可以在其表位上形成具有高结合强度的抗体/bcr。这些抗体/bcr由此是唯一的。因为体细胞超突变是由已经有效的bcr所引起，所以可以通过这个过程形成单克隆还有寡克隆的b细胞群落。在这些b细胞中，bcr氨基酸序列形成被突变变化的基础。现在可以通过适合的结合分子(抗体及其片段)选择性地识别这些变化。由此可以特异地识别(在某些情况下诊断)并治疗与疾病关联的b细胞。识别例如可以借助于通流式细胞计来进行。当此时使用全都具有共同起源的(即寡克隆的)多种bcr变体时，则还可以获得针对寡克隆bcr的抗体。换言之，在此情况下，使用呈同源寡克隆子代形式的多个不同的体细胞超突变的b细胞受体作为靶受体。
治疗例如可以借助于治疗型抗体来进行(人源的或人源化的抗体，免疫毒素)。如此设计的治疗的优点是，仅检测b细胞群落的致病部分，由此可以最小化或者甚至可以完全排除根据常规治疗方案通常出现的对治疗的系统性影响。
然而，在本发明所执行的大量实验的范围内，出人意料地发现，对于这些经改性的受体区域(表位)具有特殊特异性的抗体不能用常见的标准方法制备和选择。只有在匹配如下的实验条件之后才能获得具有所希望且必需的特异性的合适抗体：在结合实验的范围内使用在基因技术上改变的细胞，其经改性的b细胞受体处于初始的和/或经活化的或可活化的状态。换言之，对于根据本发明建议的解决方案而言具有关键意义的是，在结合实验中为了选择适合的预防性或治疗性以及诊断性抗体所使用的细胞以基本上初始的且可活化的形式来呈现其经改性的区域(表位)。在此发现，所谓的祖/前b细胞由于其生理学构造而是特别适合的。提供如此特异性的抗体及其功能性片段(同样具有这种特异性结合行为)由此可以实现对疾病特异性的处理，该处理的独特之处在于明显改进的处理成功率以及(由于降低了不希望的系统性影响)明显提高的治疗成功率。在诊断应用的范围内，使用如此特异的抗体的可能性意味着准确得多的分析，这关于待评价的患者状态的评估方面具有大得多的重要性。
例如在小鼠中b淋巴细胞(b细胞)的分化可以划分为彼此分离的阶段，这些阶段可以进一步被划分成表型和基因型。在野生小鼠骨髓中可以找到的最早的b前体(祖b细胞)源自多能性造血干细胞，该干细胞不表达细胞系特异的标记物，但是其独特之处在于在其表面上表达干细胞抗原1(sca-1)。在从祖b细胞到前b细胞的过渡中生成了在igh链中具有djh重排的细胞(祖/前b细胞)。对于这种基因重排，需要基因rag1和rag2。在这个阶段，所有其他ig基因座通常总是处于种系(gl)构型。具有djh重排的前b细胞被称为前b-i细胞，并且可以在特定条件下进行组织培养。在这些细胞中的下一个重排事件包括vh基因片段与先前存在的djh要素的重排。如果由此实现了任何等位基因的有效重排从而可以表达mh链，则这些细胞获得增殖信号，由此它们增殖并分化成前b-ii细胞。这些细胞不能再表达表面标记物c-kit，但是获得了表达cd25的能力。在igl等位基因中任何一者上的另一种有效重排导致分化成表达膜结合的免疫球蛋白(igm)的未成熟b细胞。这些未成熟的初始b细胞可以离开骨髓并且移动到淋巴器官中，在那里它们最终可以遇到抗原。在免疫反应过程中，这些b细胞可以分化成分泌抗体的浆细胞，同时可以造成在恒定igh区域的基因座中进一步的dna重排过程(类别转换重组)，这导致由浆细胞分泌的抗体同种型的变化。若干疾病是与除了亲和力成熟之外还已经经受所谓的类别转换(“classswitchrecombination”，csr)的b细胞相关联的。
在免疫学上将在免疫系统的b细胞中的同种型转换称为类别转换(csr＝“classswitchrecombination”或“同种型转换(isotypeswitching)”)。在免疫应答过程中需要b细胞上的不同同种型的免疫球蛋白。通过类别转换，b细胞可以改变其抗体同种型。在重链的vdj序列中，从c区域转换成另外的、位于下游的c区域。类别转换主要在淋巴结的生发中心中进行。
这种转换总是从igm和igd开始向igg、iga和ige进行的。
已知的是该同种型影响抗体的结合特性，即对抗体的三维结构施加影响。根据本发明将这些不同之处用于选择特异性抗体。
用于选择针对csr-bcr的抗体的一个优选的应用领域在于，在选择的范围内除了种系形式还提供igm形式。用于建立igm型的bcr的方法是在现有技术中已知的。
如已经提及的，通过本发明提供了一种用于制备(识别和选择)呈抗体或其功能性片段形式的生物结合分子的方法，其中结合分子选择性地结合到有活性的或可活化的b细胞受体或受体复合物的特定表位上，该b细胞已经(完全或部分)经历体细胞超突变。在此，通过以下方式来选择对于超突变bcr区域具有选择特异性的所希望的结合分子：对在选择方案中使用的结合分子(候选物)针对具有超突变区域的给定受体的结合行为与针对对应的(相对应的)重组式产生的呈种系构型(种系型)的受体的结合行为进行对比分析，所述重组式产生的受体对应于bcr在其成熟期间发生的体细胞超突变之前的状态，其中对于该对比分析或对于该选择，以基本上初始形式(也就是说在适合的b细胞(在前-祖阶段中的tko细胞)表面上表达的形式)提供两个受体类型(超突变/种系构型)作为选择平台。如果应选择针对寡克隆混合的bcr群落的结合分子(尤其如抗体)，则为了选择必须使用此群落的多个不同bcr，其中所希望的抗体的独特之处在于其在此群落的所有bcr上的特异性结合。换言之，在此情况下，使用呈同源寡克隆子代形式的多个不同的体细胞超突变的b细胞受体作为靶受体。
根据另一个实施方式，选择平台不仅用于识别有活性的和/或可活化的受体或者特异结合在此受体上的抗体，而且还用于选择能够使活化的bcr失活或者防止bcr活化的抗体。为此，将待研究的抗体与bcr激动剂(抗原)一起研究对结合特异的信号(参见实施例2)。当bcr在与激动剂接触后释放信号，但是由于用抗体(杂交瘤上清液)进行的预孵育，这个信号不再被释放，则抗体就具有拮抗特性。如果在用激动剂预孵育之后造成bcr信号的消除，则抗体能够抑制构象介导的信号传导。此类抗体为拮抗剂的一种特殊类型，因为它不抑制抗体-抗原结合，而是具有不同的相互作用机制并且由此还可以抑制预活化的或组成上有活性的bcr。
其中存在单克隆或寡克隆b细胞的疾病的例子例如包括但不仅仅是白血病(例如cll)和自身免疫疾病(ms、类风湿性关节炎、1型糖尿病、乳糜泻)。
以往的治愈手段只能通过以自由基方式破坏免疫系统(以及随后的干细胞移植)。但是这种方法是有危险的，从而仅应用在非常严重的情况下。(在持续的自身免疫下)可以通过完全手术式去除抗体来实现自身免疫反应的终止，但是这只有在器官的功能是可或缺或者可替代的情况下才纳入考虑。在1型糖尿病的情况下，自身免疫反应本身实现了完全排除抗原(产生胰岛素的β细胞)，仅治疗功能损失(通过胰岛素给药)。
下面详细阐释测试系统。
ep18162676说明了一种用于借助于基因改性的前-祖b细胞(tko细胞)来选择自主活性bcr的选择平台。这种系统允许bcr初始地被表达为使得能够以此前无法实现的特异性和选择性来选择针对这种bcr的抗体。虽然建立这种系统以用于使用自主活性bcr，但是允许在这种系统的应用中进行改变，即扩展到筛选其他bcr(并不一定必须是自主活性的)。由于该选择系统可以选择与“种系型”只相差一个点突变的抗体，所以产生了如下可能性：综合地扩展了此前仅对自主活性bcr设计的选择平台。虽然在ep18162676中自主活性和非自主活性bcr之间的对比是中心要素，但是本发明涉及体细胞超突变之后的bcr和基因技术产生的“野生型”bcr(对应于插入超突变之前的bcr)之间的对比。从超突变bcr的序列出发来产生对应的“野生型”bcr。在此，首先分离超突变bcr并测序，然后基于与bcr基因组组分的序列对比，以其在体细胞超突变之前的存在形式来产生bcr。然后借助于基因合成来产生这个以计算方式产生的序列。然后同样在tko细胞中表达这个合成的bcr。对杂交瘤上清液或一般而言所获得的抗体(在实际的纯化之前或之后)的结合的对比可以识别特异地结合到由于超突变出现的最小(但有效的)变化上的抗体。种系型对突变型的比较例如可以借助于通流式细胞计来进行。在此，该系统可以识别直至一个氨基酸的最小差别。作为例子，该方法展示了产生在cll情况下针对bcr的r110突变的抗体。但是还可能简化该过程并且省去对照组。于是此时仅将具有体细胞超突变bcr的tko细胞与同源种系型的tko细胞进行对比。但是本领域技术人员了解，此类工作方式并不提供与该方法包括使用对照组时同样好的结构。
下文将借助实施例详细阐释本发明的各个方面。
实施例1
从对cll的遗传学研究已知突变受体的氨基酸序列。该受体由两个氨基酸链组成，即轻链(lc)和重链(hc)。
r110hc:seqidno1
evqlvesggglvkpggslrlscaasgftfrsysmnwvrqapgkglewvssiissssyiyyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtalyycardqnamdvwgqgttvtvssdsasaptlfplvscenspsdtssvavgclaqdflpdsitfswkyknnsdisstrgfpsvlrggkyaatsqvllpskdvmqgtdehvvckvqhpngnkeknvplpv
r110lc:seqidno02
irsleatmawtvlllgllshctgsvtsyeltqppsvsvapgktaritcagnnigsksvhwyqqkpgqapvlviyydsdrpsgiperfsgsnsgntatltisrveagdeadyycqvwdsgsdhpwvfgggtkltvlrqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs*efrps
对应的种系型bcr具有以下序列
wthc:seqidno03
evqlvesggglvkpggslrlscaasgftfssysmnwvrqapgkglewvssisssssyiyyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycardqnamdvwgqgttvtvssdsasaptlfplvscenspsdtssvavgclaqdflpdsitfswkyknnsdisstrgfpsvlrggkyaatsqvllpskdvmqgtdehvvckvqhpngnkeknvplpv
wtlc:seqidno04
syvltqppsvsvapgktaritcggnnigsksvhwyqqkpgqapvlviyydsdrpsgiperfsgsnsgntatltisrveagdeadyycqvwdsssdhpwvfgggtkltvlrqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs*efrps
在此情况下，这两个序列的区别在于不只一个氨基酸。
转基因小鼠形成制备三重敲除细胞(tko)的起始点，这些小鼠具有基因lambda5、rag2和slp65的相应敲除(dührenvonmindenetal.,2012,nature489,p309-313)。此类小鼠的准备方式是本领域技术人员已知并且属于现有技术。为了获得细胞，将在小鼠死后提取其大腿骨的骨髓。如此获得的细胞随后在有利于祖/前b细胞存活的条件下培养(37℃，7.5％co2，iscoves培养基，10％fcs，p/s，鼠类il7)。在多次传代后，为了对照进行facs分选，分选祖/前b细胞并且随后再次培养。为此使用的标记物是本领域技术人员已知的。
为了用“感兴趣的bcr”进行重构，合成对于重链(hc)和轻链(lc)编码的对应序列然后分别克隆到具有cmv启动子的表达载体中。借助于脂转染将这些表达载体引入到包装细胞系(菲尼克斯细胞系)中。在36小时的持续孵育之后，取出病毒上清液并且用于tko旋转转染(spinfektion)。用于获得上清液的工作以及tko的旋转转染是广泛已知的方法并且是本领域技术人员已知的。要注意的是，为了实施当前的选择方法不一定必须使用tko细胞，因为仅对于应检测受体活化的特殊实施方式而言需要基因slp65的“敲除”。换言之，当前的技术传授内容还可以在使用仅仅分别包括关于基因rag2和lambda5的“敲除”的细胞的情况下实施。
从对应的文献中得知子集2的b细胞受体的结构特殊性(见上)。由付费制造商以标准方法合成示例性的cll-r110vh和完整的lcdna片段。然后借助于pcr将其与鼠类iggi恒定片段融合并且克隆到cmv载体中。借助于sanger测序来确认成品载体的序列。
为了表达r110iggi(seqidno1和seqidno2-r110g为cll子集2型的bcr的组成部分(cll子集2尤其在以下出版物中说明：p.baliakasetal.,2017,haematologica103:el58-el61；b.stamatopoulosetal.,2018,clinicalcancerresearch24.20:5048-5057))，使用了基于hek293t细胞的人源细胞表达系统。为了转染，应用了基于聚亚乙基酰亚胺(pei)的实验方案。在多次传代后，将上清液汇集，并且借助于蛋白g小柱来纯化包含在合并的细胞上清液中的培养基。借助于westernblot法来确定r110iggi的纯度和品质。
根据标准方法在小鼠中制备单克隆抗体并且随后生成杂交瘤细胞。筛选阳性克隆体不是像常规情况那样借助于elisa进行的。因为靶结构为膜结合的受体，所以具有核心意义的是，即使在细胞系统中(也就是说在基本上保护对于此细胞类型而言初始的细胞生理学状态的情况下)也验证对潜在抗体的结合。首先借助于对结合事件的facs分析来研究汇集的上清液组。为此在细胞系(tko)表面上表达不同的cll-r110bcr变体，该细胞系自身不能表达bcr。于是，首先可以识别其抗体显示出结合作用的上清液。随后对单独杂交瘤克隆的上清液在其结合作用方面进行更详细地研究，以便以此方式识别具有高亲和力的高特异性克隆。
对于筛选方法而言，在上述转化的范围内将不同载体用于由对应cll-bcr的重链(hc)和轻链(lc)形成的以下组合，其中这些组合用在bcr重构系统的表面上：
·对照组(无bcr的转化载体)
·带有对于cll-r110gbcr编码的dna的载体
·带有对于种系型bcr对r110g编码的dna的载体
·带有对于cll-r110g型hc/种系型lc的载体
在第1轮选择中，将多个克隆体的上清液合并并且在其对选择基质的结合特征方面进行研究。当对“感兴趣的bcr”显示出特异性结合时，则给出阳性的结合特征。将显示出此类特征的组单独分出，并且在第二轮选择的范围内再次在该选择基质上表征单独克隆体的结合特征。在应用facs结合分析的情况下使用荧光标记的抗小鼠igg抗体来验证单克隆抗体的结合，其中使用了具有以下特异性的不同的b细胞：a)没有bcr(对照组)；b)cll-r110gbcr；c)cll-r110g种系型的bcr；d)具有cll-r110g型重链和种系型对cll-r110g轻链的bcr。
基于以下发现，即抗体仅结合到具有靶结构的细胞(cll-r110gbcr)，可以得出，在此存在特异地结合到具有突变受体的细胞上的抗体。
在此显示出，使用处于细胞发育的祖/前阶段的细胞对于检测所需的bcr准确表达而言是必需的。这些细胞在发育遗传学上被适配为通过准确的折叠和表达在其表面上形成新的bcr。通过rag2和lambda5的失活(敲除)防止内生的bcr或前bcr的表达。删除slp65并且后续重构可诱导的slp65允许表征“感兴趣的bcr”的活性级别，这例如可以通过添加抗原来进行。
为了确定借助于选择选出的单克隆抗体的氨基酸序列，从单独的杂交瘤克隆体中分离mrna、从其生成cdna并且借助于锚定pcr将其扩增(rapidexpressioncloningofhumanimmunoglobulinfabfragmentsfortheanalysisofantigenspecificityofbcelllymphomasandanti-idiotypelymphomavaccination；osterrothf,alkano,mackensena,lindemanna,fischp,skerraa,veelkenh.,jimmunolmethods1999oct29；229(1-2):141-53)。
在将对结合而言重要的区域(cdr)进行识别和序列测定之后，借助于pcr将其转移到人源抗体骨架上。为此，在生物信息学上(insilico)生成来自人源fr区域的vh序列和鼠类cdr区域，然后作为dna片段进行合成。随后借助于pcr将其与人源iggi融合并且克隆到适合于表达的载体中。
为了生成单克隆抗体，除了完整的免疫球蛋白之外还使用合成肽，这些肽呈现出用于自主信号能力的区域。
将针对r110gbcr的特异性单克隆抗体测序。在此确定了以下氨基酸序列，其中seqidno.5涉及重链(hc)的可变部分，并且seqidno.6涉及轻链(lc)的可变部分，并且其中所标记的区域(以所给出的顺序)标示cdr1、2和3。
seqidno.5(ava-mab01hc)
qvqlqqsgpglvqpsqslsitctvsgfsltsygihwvrqspgkglewlgviwrgggtdsnaafmsrlsitkdnsksqvffkmnslqaddtaiyycarsrydeeesmnywgqgtsvtvss
seqidno.6(ava-mab01lc)
qivltqspaslsasvgetvtitcrasgnihsylawyqqkqgkspqllvynaktladgvpsrfsgsgsgtqyslkinslqpedfgsyycqhfwntpptfgagtklelk
根据seqidno.5的重链的与cdr1、cdr2和cdr3相对应的子序列在seqidno.7至9中示出，而根据seqidno.6的轻链的与cdr1、cdr2和cdr3相对应的子序列在seqidno.10至12中示出。
seqidno.7(ava-mab01cdr1hc)
gfsltsyg
seqidno.8(ava-mab01cdr2hc)
iwrgggt
seqidno.9(ava-mab01cdr3hc)
arsrydeeesmny
seqidno.10(ava-mab01cdr1lc)
gnihsy
seqidno.11(ava-mab01cdr2lc)
nakt
seqidno.12(ava-mab01cdr3lc)
qhfwntppt
实施例2
使用了与在实施例i中一样的杂交瘤。仅选择方法有所不同。在这种情况下使用tko细胞来进行选择，这些tko细胞预先已经被孵育以暴露于bcr抗原(5pg/ml，5分钟)。由此形成抗原对bcr的结合。不发生bcr的活化(以及bcr的实际内化)，因为没有诱导slp65。然后将细胞分开。一部分在bdfortessaiifacs设备中测量以进行功能检验。这种设备允许中断测量并且用新的参数重新进行记录。大多数其他facs设备无法做到这点。为此，在测量之前根据制造商的指导用吲哚-1将细胞孵育45分钟。吲哚-1在钙向细胞内流入时产生荧光信号，然后可以由facs设备测量该荧光信号。测量这些细胞一分钟，以产生基线。然后加入4-oh-他莫昔芬(2mm)，由此重构bcr的信号传导，并且可以检测钙信号。这个钙信号表示bcr的活化。为了在bcr中检测活化(或失活)，必须将可活化受体的钙信号(在具有重构钙信号的细胞中)与在没有重构钙信号的细胞中相同的bcr的信号进行比较。在此比较用激动剂活化之前和之后的ca信号。在可以检测到细胞活化之后，则将第二细胞批次(没有4-oht活化)用于选择适合的针对活化bcr的抗体(参见实施例1)。当此时选择的抗体没有结合到未活化的bcr上时，则成功地选择了仅结合到有活性bcr的抗体。
实施例iii
然后在刺激之前用潜在的抑制剂孵育细胞(5μg/ml，5分钟)。然后用激动剂(抗原，参见实施例2)刺激这些细胞(或者在自主活性细胞的情况下以没有刺激的方式使用，因为刺激剂位于细胞自身上)，并且将用抑制剂抑制之后的ca信号与没有抑制剂的细胞的ca信号进行对比。抑制意味着，具有抑制剂的细胞的ca信号明显更小(至少为净对比信号的50％)。
为了在这种情况下进行筛选，使用了以下：(经诱导意味着，这些细胞预先已经用羟基他莫昔芬处理过)
·经诱导的对照组(无bcr的转化载体)
·经诱导的细胞：利用带有对于cll-r110gbcr编码的dna的载体转化的
·经诱导的细胞：利用带有对于种系型bcr编码以形成r110g的dna的载体转化的
在并非自主活性的bcr的情况下，另外还需要用激动剂预孵育的步骤。否则使用相同的方案。
序列表
<110>阿瓦生命科学有限公司
<120>用于选择生物结合分子的方法
<130>优先权日：2018年12月20日
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