靠近固体表面的靶标的PH调节成像的制作方法

对相关申请的交叉引用

本申请要求2018年12月31日提交的美国临时申请号62/787,162和2019年3月15日提交的美国专利申请号16/355,113的权益和优先权，它们的内容通过引用整体并入本文并特此要求其优先权。

领域

本公开内容涉及生物样本的成像方法，其涉及电化学ph调节和ph敏感标记物。

背景

通过从非常薄且界限清楚的样品层中收集图像，可以促进研究特定的生物学过程，例如与细胞膜相关的现象和基于囊泡的运输。目前可得到的可实现此目的的方法包括共焦显微术、全内反射荧光（tirf）显微术和表面等离子体共振增强荧光（sprf）成像。共焦显微术使用针孔口以仅聚焦在靶样品的非常薄层上。tirf通过内部反射激光仅激活表面附近的染料，以使得倏逝场仅在溶液中延伸短距离。sprf基于表面等离子体倏逝波来激发位于界面处的荧光团。原子力显微术（afm）也在小的局部表面区域上提供地形信息。扫描电化学显微术（secm）除用于显示地形信息外经常用于探测局部电化学界面行为。

这些成像技术的常见生物学应用包括观察细胞的凋亡和坏死、各种底物与细胞表面的结合以及各种配体与捕获试剂（诸如蛋白、dna、rna、适体、肽、多糖或其它生物分子）的结合。这些应用需要高的垂直分辨率以有效地从界限清楚的局部感兴趣区域捕获信息。结果，目前可得到的解决方案（例如上述成像技术）需要光学和/或物理组件的特殊集合，其通常作为昂贵的独立系统或高成本附加设备提供。

概述

因此，仍然需要廉价的解决方案，其提供与现有的显微仪器兼容并且可以用于广泛范围的生物学应用中的局部成像。

在一个方面，本公开内容提供了对生物样本成像的方法，所述方法包括

(a)用ph敏感标记物标记生物样本以形成经标记的生物样本，

(b)将经标记的生物样本和电极的表面浸没在具有ph值的缓冲溶液中，其中

所述缓冲溶液包含ph调节剂；

所述表面任选地包含微结构；

将经标记的生物样本偶联至所述表面或所述微结构；和

所述微结构当存在时限定所述生物样本和所述表面之间的体积，ph调节剂通过所述体积扩散，

(c)将电势或电流施加于所述电极，由此所述ph调节剂造成邻近电极表面的地带中ph值的变化，从而造成在所述地带内的ph敏感标记物产生光信号，和

(d)检测所述光信号，由此对经标记的生物样本成像。

在另一个方面，本公开内容提供了对生物样本成像的方法，其包括

(a)用ph敏感标记物标记生物样本以形成经标记的生物样本，

(b)将经标记的生物样本和电极的表面浸没在具有ph值的缓冲溶液中，其中

所述表面包含涂层；

所述涂层包含ph调节剂；

所述涂层任选地包含微结构；

所述缓冲溶液任选地包含ph调节剂；

将经标记的生物样本偶联至所述涂层或所述微结构；和

所述微结构当存在时限定所述生物样本和所述表面之间的体积，缓冲溶液中的ph调节剂当存在时通过所述体积扩散，

(c)将电势或电流施加于所述电极，由此所述ph调节剂造成邻近涂层的地带中ph值的变化，从而造成在所述地带内的ph敏感标记物产生光信号，和

(d)检测所述光信号，由此对经标记的生物样本成像。

通过考虑详细的描述和附图，将明白其它方面、特征和实施方案。

附图简述

图1a是说明ph调节成像系统的示意图，其中ph改变没有起作用。

图1b是说明ph调节成像系统的示意图，其中ph改变在起作用。

图2是显示了通过1mm磷酸盐缓冲液中的醌在氧化铟锡电极上的氧化/还原来改变溶液的ph的图。通过在表面上图案化的预校准的氧化铱感测电极确定ph值，且闭环控制以准确且快速的方式达到靶ph值。

图3a是说明ph调节成像底物的示例性构型的示意图，其中ph调节剂在溶液中。

图3b是类似于图3a的说明ph调节成像底物的示例性构型的示意图，其具有额外表面拓扑结构。

图3c是说明ph调节成像底物的示例性构型的示意图，其中ph调节剂嵌入在涂层中。

图3d是类似于图3c的说明ph调节成像底物的示例性构型的示意图，其具有额外表面拓扑结构。

详述

在详细解释任何实施方案之前，应当理解，本公开内容不旨在将其应用限于以下描述中阐述的或在以下附图中示出的构造细节和组件布置。实施方案能够具有其它构型并且能够以不同的方式被实践或执行。

本公开内容提供了用靠近表面的非常小的成像窗口执行生物样本的成像的技术解决方案，所述成像窗口可以被添加到现有成像平台诸如荧光显微镜上。本技术涉及使用电化学ph调节来实现用ph敏感标记物标记的生物样本的局部成像。本技术可以实现高垂直轴向分辨率，类似于共焦显微术或全内反射荧光(tirf)显微术。

本文中使用的术语“包含”、“包含”、“包括”、“包括”、“具有”、“具有”、“含有”、“含有”及其变体是开放式的过渡短语、术语或短语，其意在涵盖其后所列项目及其等同项目以及其它项目。单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数所指对象，除非上下文另外清楚地指明。在使用术语“包含”的情况下，本公开内容也涵盖“包含”本文所提出的实施方案或要素、“由其组成”和“基本上由其组成”的其它实施方案，无论是否明确提出。

本文列举的任何数值范围包括从下限值到上限值的所有值。例如，如果将浓度范围阐述为1％至50％，则意图在本说明书中明确列举诸如2%至40%、10%至30%或1%至3%等等的值。这些仅是特别意图说明的实例，并且在所列举的最小值和最大值之间并包括它们的数值的所有可能组合均应视为在本申请中明确地阐述。

与数量结合使用的修饰词“约”包括所述值，并且具有上下文指示的含义（例如它至少包括与特定数量的测量相关的误差程度）。修饰词“约”也应视为公开了由两个端点的绝对值定义的范围。例如，表述“约2至约4”也公开了范围“2至4”。术语“约”可以表示所指示数字的±10%。例如，“约10%”可以指示9％至11％的范围，并且“约1”可以是指0.9-1.1。“约”的其它含义可以从上下文显而易见，例如四舍五入，所以例如“约1”也可以是指0.5-1.4。

在下面更详细地描述了具体官能团和化学术语的定义。为了本公开内容的目的，根据元素周期表（cas版本，handbookofchemistryandphysics，第75版，内封面）来鉴别化学元素，且具体官能团一般如本文所述进行定义。另外，有机化学的一般原理以及具体的官能部分和反应性描述于organicchemistry,thomassorrell,universitysciencebooks,sausalito,1999;smith和marchmarch'sadvancedorganicchemistry,第5版,johnwiley&sons,inc.,newyork,2001;larock,comprehensiveorganictransformations,vchpublishers,inc.,newyork,1989;carruthers,somemodernmethodsoforganicsynthesis,第3版,cambridgeuniversitypress,cambridge,1987；它们中的每一篇的整个内容通过引用并入本文。

在一个方面，本公开内容提供了对生物样本成像的方法，其包括

(a)用ph敏感标记物标记生物样本以形成经标记的生物样本，

(b)将经标记的生物样本和电极的表面浸没在具有ph值的缓冲溶液中，其中

所述缓冲溶液包含ph调节剂；

所述表面任选地包含微结构；

将经标记的生物样本偶联至所述表面或所述微结构；和

所述微结构当存在时限定所述生物样本和所述表面之间的体积，ph调节剂通过所述体积扩散，

(c)将电势或电流施加于所述电极，由此所述ph调节剂造成邻近电极表面的地带中ph值的变化，从而造成在所述地带内的ph敏感标记物产生光信号，和

(d)检测所述光信号，由此对经标记的生物样本成像。

在另一个方面，本公开内容提供了对生物样本成像的方法，其包括

(a)用ph敏感标记物标记生物样本以形成经标记的生物样本，

(b)将经标记的生物样本和电极的表面浸没在具有ph值的缓冲溶液中，其中

所述表面包含涂层；

所述涂层包含ph调节剂；

所述涂层任选地包含微结构；

所述缓冲溶液任选地包含ph调节剂；

将经标记的生物样本偶联至所述涂层或所述微结构；和

所述微结构当存在时限定所述生物样本和所述表面之间的体积，缓冲溶液中的ph调节剂当存在时通过所述体积扩散，

(c)将电势或电流施加于所述电极，由此所述ph调节剂造成邻近涂层的地带中ph值的变化，从而造成在所述地带内的ph敏感标记物产生光信号，和

(d)检测所述光信号，由此对经标记的生物样本成像。

通过生物样本与表面、涂层或微结构上的相应部分之间的各种物理或化学相互作用，生物样本可以偶联至本文所述的表面或涂层或微结构。这样的相互作用的实例包括、但不限于接触、粘附、共价键合、氢键合、离子键合、配体-受体结合和抗原-抗体结合。在某些实施方案中，所述偶联可以是简单接触或粘附的形式。例如，在本发明的方法中，可以将生物样本放置成与表面、涂层或微结构物理接触或粘附在其上。生物样本的结构的至少一部分可以偶联至表面、涂层或微结构上的至少一个相应部分。

生物样本可以是固定的组织，细胞诸如固定的细胞和活细胞，细胞外囊泡，以及表面图案化的生物分子诸如蛋白、dna、rna和肽或它们的组合。在某些实施方案中，所述生物样本是组织样品、细胞、小囊泡或它们的组合。在某些实施方案中，所述生物样本是细胞。

本文公开的ph敏感标记物表示响应于ph值的变化而直接或间接产生光信号的任何试剂。合适的ph敏感标记物包括、但不限于荧光染料、荧光蛋白、酶及其组合。使用本领域已知的方法，可以通过ph敏感标记物来标记生物样本。在某些实施方案中，所述标记方法可以包括使用已知的经标记的捕获试剂诸如抗体、dna、rna、适体、肽、脂质和小分子。在某些实施方案中，所述标记方法可以包括通过官能团诸如甲氧基-或乙氧基-、乙酰氧基-和三氯硅烷、伯胺或仲胺、nhs酯、马来酰亚胺、叠氮化物或硫醇的化学改性。

在某些实施方案中，所述ph敏感标记物是ph敏感的荧光染料。合适的荧光染料包括、但不限于phrodo、protonex、俄勒冈绿、lysosensorgreen、phab、荧光素、fam、罗丹明b衍生物和snarf。

合适的荧光蛋白包括、但不限于绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和蓝绿色荧光蛋白。在某些实施方案中，所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白(gfp)。

可用作ph敏感标记物的合适酶包括、但不限于辣根过氧化物酶(hrp)、葡萄糖氧化酶和碱性磷酸酶。

ph调节剂表示响应于电势或电流在溶液中发生化学反应从而造成溶液的ph值的变化的化合物或组合物。所述化学反应可以是氧化还原反应，其中ph调节剂的氧化还原态被改变。通过电刺激对ph调节剂的电化学氧化和/或还原可能会通过质子的产生或消耗与缓冲溶液的缓冲能力之间的平衡来引入局部ph变化。这可以产生与电极表面具有非常短的垂直距离（例如几nm到几µm）的ph调节地带，这允许仅在ph调节体积内对生物样本进行成像。在某些实施方案中，ph调节剂可以包括可进行质子偶联的电子转移的材料。合适的ph调节剂包括、但不限于醌衍生物、氨基酚衍生物、苯胺衍生物、联苯胺衍生物、肼衍生物、酚-ru(2,2'-联吡啶)3²⁺及其组合。合适的ph调节剂还可以包括具有上面未举例说明的ph响应部分的其它已知化合物。

在某些实施方案中，所述ph调节剂是式(i)-(xii)中的任一个的醌衍生物

其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7和r8各自独立地选自：h;cnh2n+1;cl;f;i,br,om,no2,oh,ocnh2n,ocnh2noh,o(cnh2no)yoh,o(cnh2no)yocnh2n+1,o(cnh2no)ycooh;o(cnh2no)ycoom;cooh;coom;coocnh2n+1;conhcnh2n+1;con(cnh2n+1)2;so3h;so3m;nh2;nhcnh2n+1;n(cnh2n+1)2;nhcnh2noh;nhcnh2nnh2;n(cnh2noh)2;n(cnh2nnh)2;nhcocnh2n+1;ncnh2ncocnh2n+1;ncnh2ncocnh2noh;ncnh2ncocnh2nnh2;ncnh2ncocnh2nsh;sh;scnh2n+1;scnh2noh;s(cnh2no)yoh;s(cnh2no)yocnh2n+1;s(cnh2no)ycooh;s(cnh2no)ycoom;ocnh2nsh;o(cnh2no)ysh;o(cnh2no)yscnh2n+1;cnh2n;cnh2nocnh2n;cnh2nscnh2n;cnh2nnhcnh2n;cnh2nn(cnh2n+1)cnh2n;cnh2n+1;cnh2noh;cnh2n+1ocnh2n;cnh2nocnh2noh;cnh2no(cnh2no)ycooh;cnh2no(cnh2no)ycoom;cnh2ncooh;cnh2ncoom;cnh2ncoocnh2n+1;cnh2nconhcnh2n+1;cnh2nconh(cnh2n+1)2;cnh2nso3h;cnh2nso3m;cnh2nnh2;cnh2nnhcnh2n+1;cnh2nn(cnh2n+1)2;cnh2nnhcnh2noh;cnh2nnhcnh2nnh2;cnh2nn(cnh2noh)2;cnh2nn(cnh2nnh2)2;cnh2nnhcocnh2n+1;cnh2nncnh2ncocnh2noh;cnh2nncnh2ncocnh2nnh2;cnh2nncnh2ncocnh2nsh;cnh2nsh;cnh2n+1scnh2n;cnh2nscnh2noh;cnh2ns(cnh2no)yoh;cnh2ns(cnh2no)yocnh2n+1;cnh2ns(cnh2no)ycooh;cnh2ns(cnh2no)ycoom；糖；肽；和氨基酸，

其中

m是任何金属阳离子或nh4⁺，

n是1至10⁹的整数，且

y是1至10⁹的整数。

在某些实施方案中，r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7和r8各自独立地选自：cnh2noh;cnh2nocnh2noh;cnh2no(cnh2no)ycooh;cnh2no(cnh2no)ycoom;cnh2ncooh;cnh2ncoom;cnh2ncoocnh2n+1;cnh2nconhcnh2n+1;cnh2nconh(cnh2n+1)2;cnh2nso3h;cnh2nso3m;cnh2nnh2;cnh2nnhcnh2n+1;cnh2nn(cnh2n+1)2;cnh2nnhcnh2noh;cnh2nnhcnh2nnh2;cnh2nn(cnh2noh)2;cnh2nn(cnh2nnh2)2;cnh2nnhcocnh2n+1;cnh2nncnh2ncocnh2noh;cnh2nncnh2ncocnh2nnh2;cnh2nncnh2ncocnh2nsh;cnh2nsh;cnh2nscnh2noh;cnh2ns(cnh2no)yoh;cnh2ns(cnh2no)yocnh2n+1;cnh2ns(cnh2no)ycooh;和cnh2ns(cnh2no)ycoom。

合适的醌衍生物可以含有各种官能团以调节其溶解度、生物相容性和电化学性质。合适的醌衍生物的其它实例包括在us9766197、us9874538、us9910008、us10011549、us10041905、us20170010238和wo2017005587(pct/ep2016/065252)中描述的那些，其整个内容通过引用并入本文。

缓冲溶液表示可以将其ph值维持在几乎恒定水平并且不干扰成像仪器的操作的水溶液或有机溶液。在某些实施方案中，所述缓冲溶液是水溶液，诸如磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液或在生物应用中使用的其它缓冲液。在某些实施方案中，所述缓冲溶液是在其中可以检测或监测生物样本的生物学功能的溶液。例如，所述缓冲溶液可以是用于细胞培养的培养基。

在某些实施方案中，用ph敏感标记物标记的生物样本直接偶联至电极表面（例如与其接触）。在某些实施方案中，所述电极在其表面上包含涂层，并且生物样本偶联至该涂层（例如与其接触）。所述涂层可以形成覆盖电极表面的一部分或整个电极表面的层。在某些实施方案中，将所述生物样本和所述生物样本所偶联的电极表面浸没在缓冲溶液中。在某些实施方案中，将所述生物样本和在所述生物样本所偶联的电极表面上的涂层浸没在缓冲溶液中。

在某些实施方案中，所述缓冲溶液包含本文公开的ph调节剂。例如，可以将ph调节剂均匀地溶解在缓冲溶液中。

在某些实施方案中，在电极表面上的涂层包含ph调节剂。例如，ph调节剂可以嵌入或固定化在涂层中。ph调节剂嵌入层可以是小分子的单层，或聚合物层，或3d交联的金属/聚合物复合网络。所述层可以共价连接或物理吸附至电极。在某些实施方案中，电极或ph调节剂嵌入层可以是光学透明的。在某些实施方案中，导电聚合物可以用作电极和ph调节剂层两者。导电聚合物可以是例如聚吡咯、聚噻吩、聚芴或聚苯胺等。

在某些实施方案中，ph调节剂可以通过官能团诸如甲氧基-或乙氧基-、乙酰氧基-和三氯硅烷、伯胺或仲胺、nhs酯、马来酰亚胺、叠氮化物或硫醇共价连接至电极表面。在某些实施方案中，在电极表面上的涂层包含聚合物，并且ph调节剂作为聚合物的主链的一部分或作为聚合物的侧链整合在聚合物中。

作为非限制性实例，在图式1中显示了可以嵌入在涂层中的ph调节剂。可以将ph调节剂官能化以用于氧化还原反应以产生酸(h3o⁺)或碱(oh^-)。图式1小图(a)解释了用磷酸根基团官能化的小分子单层，其可以结合至玻璃电极。图式1小图(b)解释了用于电极或用醌作为侧基官能化的电极的导电聚合物，从而产生具有可控制的膜厚度的聚合物。图式1小图(c)解释了用亲水基团官能化的聚合物，其可以任选地与要用ph调节剂官能化的聚合物混合以便增加水、氢氧化物和水合氢离子向聚合物中的渗入、或与ph调节剂共聚。例如，可以将亲水性聚合物与ph调节剂掺合，以增加水向聚合物层中的渗透。可以将ph调节官能团和亲水基团组合在相同聚合物中（共聚合）。替代地，可以将两种聚合物（一种包含ph调节官能团且另一种包含疏水部分）物理混合在一起。

在某些实施方案中，缓冲溶液和在电极表面上的涂层都包含ph调节剂。

图式1

在图式1小图(a)和(b)中，ph调节剂的氧化形式显示在左侧，且还原形式显示在右侧，并且ph调节可以通过ph调节剂嵌入层中的电化学活性部分对质子的释放或吸收而实现。例如，为了使电极附近的溶液层比本体溶液更具酸性，该层中的ph调节剂会从还原形式转化为氧化形式；为了使靠近电极的溶液层的ph更碱性，该层中的ph调节剂会从氧化态转化为还原态。在这两种情况下，醌/氢醌部分被用作具有ph调节功能的官能团的非限制性实例。也可以使用具有相似官能团的其它合适的ph调节剂。

在本方法中产生的光信号可以是比色测量信号诸如颜色变化、化学发光信号诸如化学发光发射、或荧光信号诸如荧光发射。光信号的产生和强度取决于在生物样本上的ph敏感标记物。在某些实施方案中，所述光信号是响应于ph调节而来自ph敏感标记物的荧光发射，其可以通过本领域已知的荧光显微镜检测到。在特定实施方案中，所述光信号还可以表示在本方法的各个阶段所检测到的光输出（例如荧光强度）之间的差异。例如，光信号可以表示如本文所公开的在将电势或电流施加于电极之前和之后检测到的荧光强度的变化。

本方法的ph调节可以通过向电极施加电流或电压来进行。在某些实施方案中，本文中用于ph调节的电势或电流可以由这样的波形来定义：所述波形能够基于开环和/或闭环控制方案进行调节，以改变ph调节地带的大小。例如，通过调节波形的参数，可以控制与电极的表面或电极上的涂层相邻的ph调节地带的大小。在某些实施方案中，可以改变地带的高度（z高度），从而造成生物样本上的活化的ph敏感标记物的数目的改变，并且可以在成像过程的持续时间中分析得到的光信号（例如荧光）的改变（时间分析）。例如，可以对距电极表面高达约300nm的地带高度的生物样本上的活化荧光团进行测量，然后对高达约350nm的地带高度重复进行活化荧光团的这种测量。从这些结果，可以分辨来自50nm部分的信号贡献（两次测量结果之间的差异）。

在某些实施方案中，电极的表面或在电极的表面上的涂层包含生物样本可以与之偶联（例如通过粘附、化学键合或其它相互作用）的微结构，从而限定生物样本与表面之间（例如生物样本与表面或涂层上的微结构之间）的体积，ph调节剂通过所述体积扩散。例如，溶解在缓冲溶液中的ph调节剂可能会通过该体积扩散。

在某些实施方案中，生物样本与具有微结构的表面或涂层的偶联（例如粘附、化学键合或其它相互作用）的程度高于生物样本与没有所述微结构的表面或涂层的偶联的程度。例如，微结构可以促进生物样本（例如细胞）对电极表面的粘附或结合。在某些实施方案中，所述微结构还可提供改变生物样本的实际成像区域的额外方式。对于ph调节地带的相同高度，在生物样本上的活化的荧光团的面积（或数量）可能有所不同，这取决于生物样本所偶联的微结构的高度。例如，如果ph调节地带具有高达约500nm的地带高度并且微结构的高度为450nm，则从生物样本贡献的实际信号可以为50nm。如果微结构的高度为400nm，则信号贡献可能来自生物样本的100nm。

在某些实施方案中，在生物样本与具有微结构的表面之间的体积中的ph调节剂的浓度高于在生物样本与没有微结构的电极表面或涂层之间的体积中的ph调节剂的浓度。例如，将生物样本（例如细胞）偶联至电极表面或涂层后然后活化后，ph调节剂可能会局部耗尽，因为生物样本阻断带来新的氧化还原分子以调节ph值的缓冲溶液的扩散。所述微结构化可增加在生物样本和电极表面之间产生的ph地带的大小。通过具有微结构化的电极表面，当生物样本和电极表面之间有更多的体积来供应ph调节剂时，耗尽的程度得以降低，从而维持ph调节地带。因此，微结构可以使得ph调节剂充分地可用于改变邻近电极表面的地带的ph。

合适的电控制单元包括、但不限于具有电流/电压源输出和感应输入的电子器件、控制电参数的软件。

电极可以被包括在基质诸如玻璃基质上，可以在所述基质上执行生物样本的成像。合适的基质包括具有图案化电极的基质，包括工作电极（we）和/或感测电极（se）。在所公开的方法中使用至少一个电极（we）。在所公开的方法中可以任选地使用感测电极。

对电极（ce）和参比电极（re）通常在本方法中用于电化学控制。这些电极可以是外部电极或掺入基质中的电极。

在某些实施方案中，本方法可以包括闭环控制单元。通过ph感测电极信号在调节过程中监测实际ph可以允许闭环控制的实现，从而实现更快且更精确的ph控制。用于控制接近电极表面的ph的合适闭环控制单元的实例包括、但不限于在us20170010238中描述的那些，其通过引用整体并入本文。

在某些实施方案中，所述基质是载玻片。载玻片基质、电极和控制单元的实例包括在us9910008中描述的那些，其通过引用整体并入本文。

在某些实施方案中，本方法进一步包括在控制和/或成像模块的阵列中对生物样本进行成像，每个模块包含本文公开的(a)-(d)的独立循环。合适的阵列技术包括、但不限于互补金属氧化物半导体(cmos)阵列、电极阵列、薄膜晶体管(tft)阵列和本领域已知的其它技术。合适的阵列的实例包括如us9810688中所述的多位点阵列，其整个内容通过引用并入本文。

代表性成像过程

本方法的示意图在图1a和1b中示出。代替使用特殊的光学或物理设置，利用具有电极图案化基质的简单电控制单元。当ph调节没有起作用时（图1a），生物样本（例如细胞）上的ph敏感染料没有被活化，并且没有观察到光信号。当将电势施加于工作电极时（图1b），在电极表面附近产生ph调节地带，从而激活该地带内的ph敏感染料以产生光信号（例如荧光）。

ph调节剂（诸如醌衍生物、肼衍生物）或水的可逆电化学氧化/还原可以在局部区域中诱导快速ph变化。已经证实，可以用醌衍生物在3-10范围内调节ph。ph调节限值可以取决于特定ph调节剂的pka和氧化/还原电势及其浓度。图2显示了在1mm磷酸盐缓冲液中通过氧化铟锡电极上的2,5-二甲基氢醌的氧化而进行的按需ph调节。当将阳极电流施加于电极时，质子产生会克服缓冲能力，且溶液的ph变得更酸性。这是用于在酸性ph下具有最佳荧光的ph敏感染料（诸如phrodo或protonex）的选择性成像的应用情况的一个实例。

在将ph调节剂固定化至涂层的情况下，ph调节剂的量可能是一个限制因素，并且可引入持续时间限值——在1µs和1min之间。在这种情况下，基于脉冲的调节方案可能是更合适的。单个电压或电流脉冲可产生ph调节窗口，该窗口可能会暂时持续，这可能允许以短持续时间进行单次成像。如果所选ph调节剂的氧化还原过程是可逆的，例如在醌的情况下，则可能通过氧化/还原循环进行多轮成像。

通过调节溶液的缓冲能力和电控制参数，可以控制ph调节地带的厚度。较高的缓冲能力将导致较薄的调节地带，就像与电脉冲相关的电流斜率或在脉冲开始与图像收集开始之间允许的时间等等因素。以此方式，ph调节成像可以允许任何现有的荧光显微镜产生类似于tirf显微术或共焦显微术（其聚焦于非常接近基质的体积）的图像。原则上，可以将ph调节成像与这些技术中的任何一种结合使用，以通过增加经由ph控制对成像环境的动态控制来进一步提高成像能力。

图3a-3d显示了不同实验方案的示例性构型。图3a显示了将ph调节剂添加到溶液中的情况。在该情况下，可以进行较长持续时间的连续ph调节。但是，对于活细胞成像，可以使用不干扰细胞的生理功能的生物相容性ph调节剂。

图3c显示了使用具有嵌入的ph调节剂的涂层的情况。在这种情况下，ph调节剂与靶标生物样本之间的直接接触可以被最小化（与将ph调节剂溶解在整个缓冲溶液中相比），并且可以减少ph调节剂（如果有的话）的不利影响。

如在图3b和图3d中所示，通过纳米和/或微米制造或表面化学等，基质可以具有附加的拓扑结构（例如微结构）。这些特征可能引入生物样本与电极基质的更强粘附，充当细胞生物学的额外信号传递线索，并成为控制3d结构变化的另一个来源。

ph调节可以基于扩散，并且成像的时机以及电参数的特定组合可以用于控制从其捕获图像的电极上方的高度。通过在一时间段内拍摄多个图像，可以产生在电极表面附近的物体的3d模型。在某些实施方案中，可以使用脉冲型刺激，并且可以施加多个ph调节脉冲以获得随时间拍摄的一组图像以进行长期的延时监测。

优点

本方法涉及电化学ph调节与ph敏感染料的组合使用以实现具有高垂直轴向分辨率的生物样本（诸如组织样品、细胞和小囊泡）的局部成像，这类似于共焦显微术或全内反射荧光（tirf）显微术。可以将在溶液中或在电极表面上的薄层中的ph调节剂进行电化学氧化或还原以产生ph调节地带，其覆盖从表面的纳米至微米距离。在特定实施方案中，来自ph敏感染料（其在包含成像对象的一部分的ph调节地带内）的荧光可能有助于该信号。因此，本方法可以用于通过在活跃的ph调节周期期间拍摄图像而仅使靠近电极表面的样品的薄切片暂时可视化。

通过简单地利用电化学ph调节单元和载玻片，本方法可以能够利用常规荧光显微镜执行表面聚焦成像。另外，通过非光学参数，诸如电输入、微结构、ph调节剂浓度和缓冲剂浓度等，可以控制成像窗口大小。此外，ph调节可以提供对生化相互作用的额外控制。例如，某些酶的活性具有ph依赖性；分子中官能团的保护基也可以通过ph控制；通过在不同ph条件下进行试验，可以改善血清中基于抗体的检测的特异性、灵敏度和再现性，可以将其扩展到免疫染色应用中。

在某些实施方案中，可以采用生物相容的ph调节剂，诸如适合用于活细胞成像的那些。生物相容的ph调节剂可以包括化学改性和/或可以固定化在电极上，这可以使这样的试剂与要成像的生物样本的直接相互作用最小化。

在以下条款中阐述了各种特征、优点和实施方案：

条款1.对生物样本成像的方法，所述方法包括

(a)用ph敏感标记物标记生物样本以形成经标记的生物样本，

(b)将经标记的生物样本和电极的表面浸没在具有ph值的缓冲溶液中，其中

所述缓冲溶液包含ph调节剂；

所述表面任选地包含微结构；

将经标记的生物样本偶联至所述表面或所述微结构；和

所述微结构当存在时限定所述生物样本和所述表面之间的体积，ph调节剂通过所述体积扩散，

(c)将电势或电流施加于所述电极，由此所述ph调节剂造成邻近电极表面的地带中ph值的变化，从而造成在所述地带内的ph敏感标记物产生光信号，和

(d)检测所述光信号，由此对经标记的生物样本成像。

条款2.条款1的方法，其中所述ph调节剂是醌衍生物、氨基酚衍生物、苯胺衍生物、联苯胺衍生物、肼衍生物、酚-ru(2,2'-联吡啶)3²⁺或它们的组合。

条款3.条款2的方法，其中所述ph调节剂是式(i)-(xii)中的任一个的醌衍生物

其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7和r8各自独立地选自：h;cnh2n+1;cl;f;i,br,om,no2,oh,ocnh2n,ocnh2noh,o(cnh2no)yoh,o(cnh2no)yocnh2n+1,o(cnh2no)ycooh;o(cnh2no)ycoom;cooh;coom;coocnh2n+1;conhcnh2n+1;con(cnh2n+1)2;so3h;so3m;nh2;nhcnh2n+1;n(cnh2n+1)2;nhcnh2noh;nhcnh2nnh2;n(cnh2noh)2;n(cnh2nnh)2;nhcocnh2n+1;ncnh2ncocnh2n+1;ncnh2ncocnh2noh;ncnh2ncocnh2nnh2;ncnh2ncocnh2nsh;sh;scnh2n+1;scnh2noh;s(cnh2no)yoh;s(cnh2no)yocnh2n+1;s(cnh2no)ycooh;s(cnh2no)ycoom;ocnh2nsh;o(cnh2no)ysh;o(cnh2no)yscnh2n+1;cnh2n;cnh2nocnh2n;cnh2nscnh2n;cnh2nnhcnh2n;cnh2nn(cnh2n+1)cnh2n;cnh2n+1;cnh2noh;cnh2n+1ocnh2n;cnh2nocnh2noh;cnh2no(cnh2no)ycooh;cnh2no(cnh2no)ycoom;cnh2ncooh;cnh2ncoom;cnh2ncoocnh2n+1;cnh2nconhcnh2n+1;cnh2nconh(cnh2n+1)2;cnh2nso3h;cnh2nso3m;cnh2nnh2;cnh2nnhcnh2n+1;cnh2nn(cnh2n+1)2;cnh2nnhcnh2noh;cnh2nnhcnh2nnh2;cnh2nn(cnh2noh)2;cnh2nn(cnh2nnh2)2;cnh2nnhcocnh2n+1;cnh2nncnh2ncocnh2noh;cnh2nncnh2ncocnh2nnh2;cnh2nncnh2ncocnh2nsh;cnh2nsh;cnh2n+1scnh2n;cnh2nscnh2noh;cnh2ns(cnh2no)yoh;cnh2ns(cnh2no)yocnh2n+1;cnh2ns(cnh2no)ycooh;cnh2ns(cnh2no)ycoom；糖；肽；和氨基酸，

其中

m是任何金属阳离子或nh4⁺，

n是1至10⁹的整数，且

y是1至10⁹的整数。

条款4.条款1-3中的任一个的方法，其中所述ph敏感标记物是荧光染料、荧光蛋白、酶或它们的组合。

条款5.条款4的方法，其中所述ph敏感标记物是选自phrodo、protonex、俄勒冈绿、lysosensorgreen、phab、荧光素、fam、罗丹明b衍生物和snarf的荧光染料，或荧光蛋白，或选自hrp、葡萄糖氧化酶和碱性磷酸酶的酶。

条款6.条款1-5中的任一个的方法，其中所述光信号是比色测量信号、化学发光信号或荧光信号。

条款7.条款1-6中的任一个的方法，其中在(c)中的电势由这样的波形来定义：所述波形能够基于开环和/或闭环控制方案进行调节，以改变ph调节地带的大小。

条款8.条款1-7中的任一个的方法，其中在(b)中生物样本与微结构的偶联的程度高于生物样本与没有微结构的表面的偶联的程度，或其中在生物样本和具有微结构的表面之间的体积中的ph调节剂的浓度高于在生物样本和没有微结构的表面之间的体积中的ph调节剂的浓度。

条款9.条款1-8中的任一个的方法，所述方法进一步包括在控制和/或成像模块的阵列中对生物样本进行成像，每个模块包含执行(a)-(d)的独立循环，其中控制和/或成像模块的阵列是互补金属氧化物半导体(cmos)阵列、电极阵列或薄膜晶体管(tft)阵列。

条款10.条款1-9中的任一个的方法，其中所述生物样本是固定的组织、单个细胞、选自固定细胞和活细胞的细胞、囊泡、蛋白、肽、dna、rna或它们的组合。

条款11.对生物样本成像的方法，所述方法包括

(a)用ph敏感标记物标记生物样本以形成经标记的生物样本，

(b)将经标记的生物样本和电极的表面浸没在具有ph值的缓冲溶液中，其中

所述表面包含涂层；

所述涂层包含ph调节剂；

所述涂层任选地包含微结构；

所述缓冲溶液任选地包含ph调节剂；

将经标记的生物样本偶联至所述涂层或所述微结构；和

所述微结构当存在时限定所述生物样本和所述表面之间的体积，缓冲溶液中的ph调节剂当存在时通过所述体积扩散，

(c)将电势或电流施加于所述电极，由此所述ph调节剂造成邻近涂层的地带中ph值的变化，从而造成在所述地带内的ph敏感标记物产生光信号，和

(d)检测所述光信号，由此对经标记的生物样本成像。

条款12.条款11的方法，其中所述ph调节剂是醌衍生物、氨基酚衍生物、苯胺衍生物、联苯胺衍生物、肼衍生物、酚-ru(2,2'-联吡啶)3²⁺、或它们的组合。

条款13.条款12的方法，其中所述ph调节剂是式(i)-(xii)中的任一个的醌衍生物

其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7和r8各自独立地选自：h;cnh2n+1;cl;f;i,br,om,no2,oh,ocnh2n,ocnh2noh,o(cnh2no)yoh,o(cnh2no)yocnh2n+1,o(cnh2no)ycooh;o(cnh2no)ycoom;cooh;coom;coocnh2n+1;conhcnh2n+1;con(cnh2n+1)2;so3h;so3m;nh2;nhcnh2n+1;n(cnh2n+1)2;nhcnh2noh;nhcnh2nnh2;n(cnh2noh)2;n(cnh2nnh)2;nhcocnh2n+1;ncnh2ncocnh2n+1;ncnh2ncocnh2noh;ncnh2ncocnh2nnh2;ncnh2ncocnh2nsh;sh;scnh2n+1;scnh2noh;s(cnh2no)yoh;s(cnh2no)yocnh2n+1;s(cnh2no)ycooh;s(cnh2no)ycoom;ocnh2nsh;o(cnh2no)ysh;o(cnh2no)yscnh2n+1;cnh2n;cnh2nocnh2n;cnh2nscnh2n;cnh2nnhcnh2n;cnh2nn(cnh2n+1)cnh2n;cnh2n+1;cnh2noh;cnh2n+1ocnh2n;cnh2nocnh2noh;cnh2no(cnh2no)ycooh;cnh2no(cnh2no)ycoom;cnh2ncooh;cnh2ncoom;cnh2ncoocnh2n+1;cnh2nconhcnh2n+1;cnh2nconh(cnh2n+1)2;cnh2nso3h;cnh2nso3m;cnh2nnh2;cnh2nnhcnh2n+1;cnh2nn(cnh2n+1)2;cnh2nnhcnh2noh;cnh2nnhcnh2nnh2;cnh2nn(cnh2noh)2;cnh2nn(cnh2nnh2)2;cnh2nnhcocnh2n+1;cnh2nncnh2ncocnh2noh;cnh2nncnh2ncocnh2nnh2;cnh2nncnh2ncocnh2nsh;cnh2nsh;cnh2n+1scnh2n;cnh2nscnh2noh;cnh2ns(cnh2no)yoh;cnh2ns(cnh2no)yocnh2n+1;cnh2ns(cnh2no)ycooh;cnh2ns(cnh2no)ycoom；糖；肽；和氨基酸，

其中

m是任何金属阳离子或nh4⁺，

n是1至10⁹的整数，且

y是1至10⁹的整数。

条款14.条款11-13中的任一个的方法，其中所述ph敏感标记物是荧光染料、荧光蛋白、酶或它们的组合。

条款15.根据权利要求14所述的方法，其中所述ph敏感标记物是选自phrodo、protonex、俄勒冈绿、lysosensorgreen、phab、荧光素、fam、罗丹明b衍生物和snarf的荧光染料，或荧光蛋白，或选自hrp、葡萄糖氧化酶和碱性磷酸酶的酶。

条款16.条款11-15中的任一个的方法，其中所述涂层包含聚合物，且所述ph调节剂作为所述聚合物的主链的一部分或作为所述聚合物的侧链整合在所述聚合物中。

条款17.条款11-16中的任一个的方法，其中在(c)中的电势由这样的波形来定义：所述波形能够基于开环和/或闭环控制方案进行调节，以改变ph调节地带的大小。

条款18.条款11-17中的任一个的方法，其中在(b)中生物样本与具有微结构的涂层的偶联的程度高于生物样本与没有微结构的涂层的偶联的程度，或其中在生物样本和具有微结构的表面之间的体积中的ph调节剂的浓度高于在生物样本和没有微结构的表面之间的体积中的ph调节剂的浓度。

条款19.条款11-18中的任一个的方法，所述方法进一步包括在控制和/或成像模块的阵列中对生物样本进行成像，每个模块包含执行(a)-(d)的独立循环，其中控制和/或成像模块的阵列是互补金属氧化物半导体(cmos)阵列、电极阵列或薄膜晶体管(tft)阵列。

条款20.条款11-19中的任一个的方法，其中生物样本是固定的组织、单个细胞、选自固定细胞和活细胞的细胞、囊泡、蛋白、肽、dna、rna或它们的组合。

在以下权利要求中阐述了各种特征、优点和实施方案。