杀菌止痒洗剂指纹图谱的建立方法与流程

本发明涉及医药检测领域，具体涉及一种杀菌止痒洗剂指纹图谱的建立方法。
背景技术：
：杀菌止痒洗剂是贵州长生药业独家生产，由黄柏、苦参、蛇床子、土茯苓、冰片、苍术6味中药制备而成，具有清热解毒、杀虫止痒的功效，适用于改善滴虫性、霉菌性、非特异性阴道炎及外阴瘙痒症所致的带下量多、阴痒等症。现有研究如《杀菌止痒洗剂的hpl指纹图谱研究》中建立了一种杀菌止痒洗剂的c指纹图谱技术，但仅对苦参碱、槐果碱两种苦参成分特征峰进行了考察，并未对黄柏、蛇床子、土茯苓、苍术等其他药材的特征峰进行归属。杀菌止痒洗剂成分较为复杂，仅以苦参成分作为质量控制指标显然是不全面的，具有一定的局限性。因此，开发建立一种简便易行，准确性高，重复性良好且能尽可能多地反映复方制剂所含多成分的指纹图谱检测方法对于杀菌止痒洗剂的质量控制和评价非常必要。技术实现要素：本发明的发明目的是，针对上述问题，提供一种杀菌止痒洗剂指纹图谱的建立方法，标定了16个共有峰，并确定了其归属于处方中的5种药材，建立的特征图谱技术含量高，避免了现有质量控制方法的单一性和片面性。为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种杀菌止痒洗剂指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：s1.混合对照品溶液的制备：分别精密称取苦参碱、落新妇苷、黄柏碱、盐酸小檗碱、蛇床子素、苍术素对照品，加甲醇制成混合对照品溶液。s2.杀菌止痒洗剂样品溶液的制备：精确称量杀菌止痒洗剂，加无水甲醇，提取，过滤，取上清液，得供试品溶液。s3.单味对照药材溶液的制备：将黄柏、苦参、蛇床子、土茯苓、苍术药材粉碎成粉末，分别取各单味药材粉末，精密称定，加无水甲醇，提取，过滤，取上清液，即分别得黄柏对照药材溶液、苦参对照药材溶液、蛇床子对照药材溶液、土茯对照药材溶液苓、苍术对照药材溶液。s4.测定：分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，用指纹图谱软件对图谱进行处理，即得杀菌止痒洗剂的指纹图谱。优选的，所述检测条件包括：色谱柱为watersxbridgec18色谱柱；以体积分数0.1％磷酸水溶液为流动相a，乙腈为流动相b进行梯度洗脱，流动相流速为0.8～1.2ml/min；柱温为20～35℃，检测波长为285nm，进样量为5～15μl。优选的，流动相流速为0.8ml/min；柱温为25℃，进样量为10μl。优选的，所述梯度洗脱过程中，流动相a和流动相b的变化为：0min，流动相a85％，流动相b15％；15min，流动相a64％，流动相b36％；22min，流动相a60％，流动相b40％；45min，流动相a50％，流动相b50％；50min，流动相a35％，流动相b65％；55min，流动相a24％，流动相b76％；70min，流动相a18％，流动相b82％。优选的，步骤s2中，精确称量杀菌止痒洗剂，加无水甲醇，超声提取30min，放冷，减压抽滤，取上清液13000r/min离心10min，得供试品溶液。优选的，步骤s3中，将黄柏、苦参、蛇床子、土茯苓、苍术药材粉碎成粉末，分别取各单味药材粉末，精密称定，加无水甲醇，超声提取30min，放冷，减压抽滤，取上清液13000r/min离心10min，分别得各单味对照药材溶液。优选的，对指纹图谱的共有峰进行药材归属，确定指纹图谱的16个共有峰中，第1、10、11、15号峰属于蛇床子药材，第4、5、8号峰属于土茯苓药材，第7、9、13、14号峰属于黄柏药材，第3、6、12号峰属于苦参药材，第2、16号峰属于苍术药材。优选的，对指纹图谱的共有峰进行活性成分归属，其中3号峰为苦参碱，4号峰为落新妇苷，7号峰为黄柏碱，9号峰为盐酸小檗碱，10号峰为蛇床子素，16号峰为苍术素。由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：1.本发明所建立的杀菌止痒洗剂指纹图谱，标定了16个共有峰，并确定了其归属于处方中的5种药材，建立的特征图谱技术含量高，避免了现有质量控制方法的单一性和片面性。为杀菌止痒洗剂的生产提供了有效的质量控制依据，并且为其药效物质基础同药理作用的相关性研究奠定了基础。2.本发明所建立的杀菌止痒洗剂指纹图谱，具有16个共有峰，且对其进行了指认和归属分析，各特征峰分离效果较好，能够较全面的反映出产品的质量信息，有利于全面监控产品质量，及鉴别产品的真伪。对16个峰中的6个峰的所对应的活性成分进行了确认，有效的将指纹峰与治疗功效关联起来，可进一步控制好杀菌止痒洗剂的生产质量。指纹图谱的16个共有峰中，第1、10、11、15号峰属于蛇床子药材，其中10号峰为蛇床子素；第4、5、8号峰属于土茯苓药材，其中4号峰为落新妇苷；第7、9、13、14号峰属于黄柏药材，其中7号峰为黄柏碱，9号峰为盐酸小檗碱；第3、6、12号峰属于苦参药材，其中3号峰为苦参碱；第2、16号峰属于苍术药材，其中16号峰为苍术素。可见，杀菌止痒洗剂组成药材的主要成分(除冰片成分无紫外吸收外)均在本技术得到的指纹图谱中得到了整体表征。3.本发明杀菌止痒洗剂指纹图谱的建立，采用高效液相色谱图的方法对杀菌止痒洗剂进行定性和定量的检测，根据杀菌止痒洗剂的有效成分的特性，确定了最优的色谱条件，得到了准确的指纹图谱。其中，流动相选择0.1％磷酸水、乙腈，并按程序连续改变流动相中各相之间的比例进行梯度洗脱，可使各成分的色谱峰之间的分离度好，干扰小，峰形好，基线平稳，且较低浓度的酸溶液有利于保护色谱柱。说明书附图图1为本发明实验例比较不同波长的色谱图；图中，1：220nm；2：240nm；3：260nm；4：285nm；5：290nm；6：300nm；7：320nm；8：340nm；图2为本发明实验例比较不同色谱柱的色谱图；图中，1：watersxbridgec18；2：comatexc18－aa；3：zorbaxeclipseplus；4：zorbaxsb；5：phenomenexluna；图3为本发明实验例比较不同流动相的色谱图；图中，1：纯水-乙腈；2：0.1％磷酸水-乙腈；3：0.05％甲酸水-乙腈；4：0.04％三乙胺缓冲液－乙腈；图4为本发明实验例比较不同柱温的色谱图；图中，1：35℃；2：30℃；3：25℃；图5为本发明实验例比较不同流速的色谱图；图中，1：1.2ml/min；2：1.0ml/min；3：0.8ml/min；图6为本发明实验例比较不同提取溶剂的色谱图；图中，1：30％甲醇；2：50％甲醇；3：80％甲醇；4：无水甲醇；图7为本发明实验例比较不同提取方法的色谱图；图中，1：加热回流；2：超声；图8为本发明实验例比较不同提取时间的色谱图；图中，1：60min；2：45min；3：30min；4：15min；图9为本发明实验例10批次杀菌止痒洗剂样品hplc叠加图；图10为本发明实验例对照品混合溶液hplc图谱；图中，1、苦参碱；2、落新妇苷；3、黄柏碱；4、盐酸小檗碱；5、蛇床子素；6、苍术素；图11为本发明实验例对照药材hplc叠加图；图中，1、特征指纹图谱2、土茯苓3、蛇床子4、黄柏5、苦参6、苍术。图12为本发明杀菌止痒洗剂的指纹图谱。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。材料：本发明实施例使用的仪器见下表1。表1使用仪器本发明实施例使用试剂为：苦参碱、落新妇苷、黄柏碱、盐酸小檗碱、蛇床子素、苍术素标准品，购自中国食品药品检定研究院。各标准品纯度均大于98.0％。样品：10批次杀菌止痒洗剂(批号20190301、20190302、20190303、20190304、20190305、20190601、20190602、20190603、20190604、20190605)，及黄柏、苦参、蛇床子、土茯苓、苍术各单味药材由贵州长生药业有限公司提供。乙腈(色谱纯)、甲酸(色谱纯)购自美国sigma公司。实施例1一种杀菌止痒洗剂指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：s1.混合对照品溶液的制备：分别取苦参碱、落新妇苷、黄柏碱、盐酸小檗碱、蛇床子素、苍术素对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度分别为248.3、190.7、154.1、198.5、251.4、183.6μg/ml的混合对照品溶液。s2.杀菌止痒洗剂样品溶液的制备：精确称量杀菌止痒洗剂，加无水甲醇，超声提取30min，放冷，减压抽滤，取上清液13000r/min离心10min，得供试品溶液。s4.单味对照药材溶液的制备：将黄柏、苦参、蛇床子、土茯苓、苍术药材粉碎成粉末，取各单味药材粉末约0.2g，精密称定，加无水甲醇，超声提取30min，放冷，减压抽滤，取上清液13000r/min离心10min，即分别得黄柏、苦参、蛇床子、土茯苓、苍术的药材供试品溶液。s4.测定分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，用指纹图谱软件对图谱进行处理，即得杀菌止痒洗剂的指纹图谱。所述检测条件包括：色谱柱为watersxbridgec18色谱柱；以体积分数0.1％磷酸水溶液为流动相a，乙腈为流动相b进行梯度洗脱，流动相流速为0.8ml/min；柱温为25℃，检测波长为285nm，进样量为10μl。所述梯度洗脱过程中，流动相a和流动相b的变化为：0min，流动相a85％，流动相b15％；15min，流动相a64％，流动相b36％；22min，流动相a60％，流动相b40％；45min，流动相a50％，流动相b50％；50min，流动相a35％，流动相b65％；55min，流动相a24％，流动相b76％；70min，流动相a18％，流动相b82％。实验例：1.提取条件考察1.1波长的考察在相同的条件下，分别比较不同波长下的色谱图，结果见图1。其中，1：220nm；2：240nm；3：260nm；4：285nm；5：290nm；6：300nm；7：320nm；8：340nm。结果显示：从色谱峰数目、峰强度、基线稳定性以及分离效果等方面综合考虑，确定285nm为最终检测波长。1.2色谱柱的考察取相同杀菌止痒洗剂样品溶液，在同样的色谱条件下，分别考察了以下5种不同c18色谱柱的分离效果，包括：watersxbridgec18(4.6×250mm,5μm)；comatexc18－aa(250mm×4.6mm，5μm)；zorbaxeclipseplusc18(4.6×250mm,5μm)；zorbaxsb-c18(4.6×250mm,5μm)；phenomenexlunac18(4.6×250mm,5μm)；结果见图2。图2中不同色谱柱下的高效液相指纹图谱1：watersxbridgec18；2：comatexc18－aa；3：zorbaxeclipseplus；4：zorbaxsb；5：phenomenexluna。结果表明，采用同样的色谱条件，不同色谱柱分离得到的具有不同峰型、保留时间以及分离效果的色谱图，综合考虑各方面，用watersxbridgec18色谱柱能更好的分离杀菌止痒洗剂的化学成分，因此使用此色谱柱完成杀菌止痒洗剂样品的指纹图谱测定。1.3流动相的考察本实验对不同的流动相系统进行了考察，结果见图3。图中3不同流动相下的高效液相指纹图谱：1：纯水-乙腈；2：0.1％磷酸水-乙腈；3：0.05％甲酸水-乙腈；4：0.04％三乙胺缓冲液－乙腈(磷酸调ph至6.5)结果表明在0.1％磷酸水-乙腈溶剂为流动相条件下，色谱峰存在较好的分离度，故选择该溶剂为流动相。1.4柱温的考察考察不同柱温的影响，包括：25℃、30℃和35℃，结果见图4。图4中不同柱温下的高效液相色谱图1：35℃；2：30℃；3：25℃。结果显示色谱分离效果差异不大，故选择对色谱柱保护最大的室温25℃为最佳柱温。1.5流速的考察考察了不同流速(0.8ml/min、1.0ml/min和1.2ml/min)对杀菌止痒洗剂色谱指纹图谱分离效果的影响，结果见图5。图5中不同流速下的高效液相色谱图1：1.2ml/min；2：1.0ml/min；3：0.8ml/min。结果显示，流速为1.2ml/min时峰数目较少，对比0.8ml/min、1.0ml/min流速下样品色谱峰的，峰数、峰型、分离度等无明显差异，故选择对溶剂耗量少的0.8ml/min为最佳流速。综上，经过一系列条件优化，最终确认杀菌止痒洗剂最优的色谱条件为：以watersxbridgec18(4.6×250mm,5μm)为色谱柱，流动相为0.1％磷酸水(a)-乙腈(b)，梯度如下：0min，流动相a85％，流动相b15％；15min，流动相a64％，流动相b36％；22min，流动相a60％，流动相b40％；45min，流动相a50％，流动相b50％；50min，流动相a35％，流动相b65％；55min，流动相a24％，流动相b76％；70min，流动相a18％，流动相b82％。体积流量为0.8ml/min；检测波长为285nm；柱温25℃；进样量10μl。2.提取条件优化2.1提取溶剂的选择精确称量杀菌止痒洗剂样品4份，每份2ml，倒入锥形瓶中，分别加入50ml无水甲醇、80％甲醇、50％甲醇和30％甲醇作为溶剂，超声提取，过滤收集滤液，将样品溶液13000r/min离心10min，抽取10μl注入高效液相色谱仪中，对色谱图进行采集(图6)。图6中不同提取溶剂的高效液相色谱图1：30％甲醇；2：50％甲醇；3：80％甲醇；4：无水甲醇。结果显示，以无水甲醇为提取溶剂所得的色谱图中色谱峰最多，分离度较好，各峰的峰面积值较大，说明无水甲醇提取的较完全，确定无水甲醇为提取溶剂。2.2提取方式的选择精确称量杀菌止痒洗剂样品2份，每份2ml，分别采用超声、回流两种不同的提取方法，过滤收集滤液，将样品在13000r/min离心10min，抽取10μl注入高效液相色谱仪中，采集色谱图(图7)。图7中不同提取方式的高效液相色谱图1：加热回流；2：超声结果显示两种提取方法效果相似，由于超声提取的操作较方便易行、重现性好，所以选用超声法提取杀菌止痒洗剂。2.3提取时间选择精确称量杀菌止痒洗剂样品4份，每份2ml，置锥形瓶中，以无水甲醇为溶剂，分别超声提取15min、30min、45min和60min，过滤收集滤液，将样品溶液在13000r/min条件下离心10min，抽取10μl注入高效液相色谱仪中，采集色谱图(图8)。图8中不同提取时间下的高效液相色谱图1：60min；2：45min；3：30min；4：15min。结果显示不同提取时间所得色谱图效果相似，为节省人力物力以及确保样品较完全提取，最后选取超声提取30min。综上，确定最后的提取工艺为：加无水甲醇，超声提取30min，放冷，减压抽滤，取上清液13000r/min离心10min，得供试品溶液。3.方法学考察3.1精密度试验取s1号样品，按实施例1的提取方法制备供试品溶液，按实施例1下的色谱方法进行样品信息采集，连续进样6针，将6次进样样品hplc图谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》进行相似度计算，结果相似度均在0.99以上。以分离度较好、峰面积适中的9号峰为参照峰，计算16个共有峰相对保留时间的rsd<0.05％，相对峰面积rsd<2％，结果见表1。表明实验所用仪器的精密度较好，分析结果稳定可靠，符合指纹图谱的要求。3.2稳定性试验取s1号样品，按实施例1下的提取方法制备供试品溶液，按实施例1下的色谱方法进行样品信息采集，分别于0h、2h、4h、8h、12h和24h注入液相色谱仪，将6个时间段样品hplc指纹图谱数据导入相似度评价系统进行计算，结果6个时间段样品图谱相似度均在0.99以上。以9号峰为参照峰，计算16个共有峰的相对保留时间rsd<0.20％，相对峰面积rsd为<3％，结果见表2。表明样品在24h内稳定。3.3重复性试验取s1号样品精密称定，平行制备6份供试品溶液，将6份样品hplc指纹图谱数据导入相似度评价系统进行计算，结果6批次样品图谱相似度均在0.96以上。以9号峰为参照峰，计算16个共有峰的相对保留时间rsd<0.3％，相对峰面积的rsd<3.09％，说明方法重复性良好。结果见表2。表2分析结果4.指纹图谱的建立分别精密吸取10批杀菌止痒洗剂样品溶液、对照品混合溶液以及各单味对照药材溶液各10μl，按实施例1下的色谱方法将样品注入高效液相色谱仪中，记录色谱图。结果见图9、10、11。其中，图9为10批次杀菌止痒洗剂样品hplc叠加图。图10对照品混合溶液hplc图谱1、苦参碱；2、落新妇苷；3、黄柏碱；4、盐酸小檗碱；5、蛇床子素；6、苍术素。图11对照药材hplc叠加图。1、特征指纹图谱2、土茯苓3、蛇床子4、黄柏5、苦参6、苍术。5.共有指纹图谱的建立及相似度评价将10批样品hplc色谱图数据导入相似度评价系统，使用中位数法进行自动匹配，加以多点校正，形成保留时间较为稳定、峰形明显的16个共有峰图谱作为样品共有特征hplc指纹图谱(见图12)，计算相似度结果见表3，表明各批次样品之间hplc图谱有良好的相似性。表310批杀菌止痒洗剂样品相似度计算结果s1s2s3s4s5s6s7s8s9s10s110.9920.9920.9850.9850.990.990.9920.9850.992s20.99210.9910.9830.9820.9920.9920.9990.9820.988s30.9920.99310.9830.9820.9920.9920.9910.9820.978s40.9850.9830.98310.9890.9760.9760.9830.9760.983s50.9850.9820.9820.98710.9760.9750.9820.9210.982s60.990.9920.9920.9760.97610.9760.9920.9760.992s70.990.9920.9920.9760.9750.98810.9920.9750.992s80.9920.9870.9870.9830.9820.9920.99210.9820.934s90.9850.9820.9820.9880.9850.9760.9750.98210.982s100.9920.9780.9870.9830.9820.9920.9920.9540.9821r0.9950.9970.9970.9920.9920.9930.9930.9970.9920.9976指纹图谱共有峰的指认与归属:根据色谱峰的保留时间信息，对指纹图谱的共有峰进行药材归属，确定指纹图谱的16个共有峰中，第1、10、11、15号峰属于蛇床子药材，其中10号峰为蛇床子素；第4、5、8号峰属于土茯苓药材，其中4号峰为落新妇苷；第7、9、13、14号峰属于黄柏药材，其中7号峰为黄柏碱，9号峰为盐酸小檗碱；第3、6、12号峰属于苦参药材，其中3号峰为苦参碱；第2、16号峰属于苍术药材，其中16号峰为苍术素。可见，杀菌止痒洗剂组成药材的主要成分(除冰片成分无紫外吸收外)均在本技术得到的指纹图谱中得到了整体表征。上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。当前第1页12