一种检测玉米赤霉烯酮的比率荧光适配体传感器的制备方法与流程

本发明属于生物传感检测技术领域，具体涉及一种检测玉米赤霉烯酮的比率荧光适配体传感器的制备方法，并将其用于对玉米赤霉烯酮(zen)的选择性检测。

背景技术：

玉米赤霉烯酮(zen)是真菌侵染产生的一种次生代谢产物，由禾谷镰刀菌和大刀镰刀菌产生，并广泛存在于玉米、小麦、大麦和高粱等各种农作物中。由于其具有生殖和神经毒性，甚至致癌性，zen被国际癌症研究机构(iarc)归类为第三类致癌物。为了避免zen的中毒事件的发生，许多国家和机构对不同作物及其产品中zen的最大限量做出规定，中国国家标准要求玉米类和小麦类产品的zen最大限量为60μgkg^-1。因此，有必要发展一种准确、灵敏、选择性的分析方法来实现谷物中zen的定量检测，以此保障人类和动物健康。目前，现有的zen检测方法各有其优缺点。如高效液相色谱-串联质谱法(hplc-ms/ms)、高效液相色谱-串联紫外法(hplc-uv)等基于色谱的串联技术虽然具有较高的准确性和可靠性，但成本高且耗时，操作时必须由专业工作人员在专业实验室中进行。酶联免疫吸附测定(elisa)、电化学免疫传感器测定(eia)、表面等离振子共振(spr)、和荧光酶联免疫吸附测定(flisa)也被广泛用于zen的定量检测，抗体的使用在确保选择性检测的同时也带来了诸如成本高、稳定性差以及耗时培养等缺点。因此，在构建新传感方法时，需要引入更好的识别元件来降低检测成本、简化实验过程并增强稳定性。

适配体(apt)是单链dna或rna分子，可高特异性和高亲和力捕获靶分子，即目标物。由于具有合成简单、化学性质稳定、便于再生、易于储存和修饰等优点，适配体成为抗体替代者的首选。zen的适配体被成功筛选出来后，已有数篇荧光适配体传感方法用于zen选择性检测的文章报道。但是，它们均采用单信号输出模式，容易受到环境、操作、仪器灯源等干扰因素的影响，造成假阳性信号的产生。

双信号输出模式的比率荧光检测技术具有固有的内置校正，可消除微环境改变的影响，由于其具有灵敏度高、选择性好、可靠性高等优点，已经被广泛研究。但是，基于双信号输出模式的比率荧光适配体传感器用于zen分析检测的研究仍未见报道。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本文旨在发明一种高灵敏度、高选择性、高准确性的比率荧光适配体传感器用于zen的分析检测。

本发明利用cdte@sio2和适配体修饰的ngqds量子点(ngqds-aptamer)的荧光强度为双输出信号，基于适配体与米托蒽醌(mtx)之间的相互作用和mtx与cdte@sio2之间的内率效应，构建了一种比率荧光适配体传感器，实现实际样品中zen的灵敏、准确、选择性检测。

一种检测zen的比率荧光适配体传感器的制备方法，包括如下步骤：

(1)合成cdteqds；

(2)合成cdte@sio2，并制成溶液备用；

(3)合成ngqds；

(4)ngqds的羧基与zen适配体修饰的氨基之间发生酰胺反应合成ngqds-aptamer：

按比例将步骤(3)制备的ngqds和pbs溶液混合搅拌，在搅拌下缓慢加入zen适配体溶液，并将混合物溶液连续搅拌一定时间后，制得ngqds-aptamer，在一定温度下储存备用；

(5)混合cdte@sio2和ngqds-aptamer；

按比例将步骤(2)制备的cdte@sio2溶液和步骤(4)制备的ngqds-aptamer溶液混合，用pbs溶液调节ph后，得到比率荧光探针混合溶液；

(6)添加mtx；

按比例在步骤(5)制得的比率荧光探针混合溶液中加入米托蒽醌mtx溶液，作用一段时间后得到检测zen的比率荧光适配体传感器。

其中，步骤(1)中，合成cdteqds的具体方法为：在剧烈搅拌下，将0.1142gcdcl2·2.5h2o溶于50ml水中，加入75μl巯基丙酸，然后用1mol·l^-1naoh将溶液的ph调至8.5，通氮气15min；接着，快速加入2ml用0.0646gte和0.0457gnabh4合成的前驱体nahte溶液；接着通氮气10min后将混合溶液倒入三口烧瓶中，在100℃下回流20h，得到发射波长为665nm的红色cdteqds，并加入等体积乙醇离心去除杂质；烘干称重后溶于二次水中，并在4℃下储存。

步骤(2)中，合成cdte@sio2的具体方法为：将1ml10μmcdteqds溶液与6ml乙醇混合，并在室温下搅拌5min；随后，添加20μlaptes，并将混合物溶液连续搅拌6h；按顺序分别添加100μlteos和nh3·h2o后搅拌24h；最后，将产物用乙醇和水离心洗涤三次后烘干，得到cdte@sio2；将cdte@sio2重新溶于超纯水中，得到cdte@sio2溶液。

步骤(3)中，合成ngqds的具体方法为：将2g柠檬酸铵和60mlh2o在三口烧瓶中混合，并加热到200℃，此处注意将气球套在冷凝器的出口上方；回流30min后，溶液从无色变为亮黄色，表明粗产物已形成；用1mgml^-1naoh调节粗产物的ph至7.0，得到ngqds，保存在4℃下备用。

步骤(4)中，ngqds和pbs溶液的体积比为2:1，混合搅拌的时间为15-30min，其中，ngqds浓度为10mg·ml^-1，pbs浓度为100mm(ph＝7.4，含有10mmedc和5mmnhs)；ngqds与zen适配体溶液的体积比为1:1；其中，zen适配体溶液的浓度为1μm；混合物溶液连续搅拌的时间为2-4h；制得的ngqds-aptamer储存温度为4℃。

步骤(5)中，cdte@sio2溶液和ngqds-aptamer溶液的体积比是5:1，cdte@sio2溶液浓度为1mg·ml^-1，ngqds-aptamer的浓度为4mg·ml^-1，用pbs溶液调节ph到7.4。

步骤(6)中，比率荧光探针混合溶液与mtx溶液的体积比是9:1，mtx溶液的浓度为10μm，作用时间为5-20min。

将本发明制备的zen的比率荧光适配体传感器用于zen的用途。

检测方法为：

s1：在270μl检测zen的比率荧光适配体传感器中加入30μl0.001-1nm的zen标准溶液，反应5-40min后用荧光分光光度计在室温下分别检测溶液在435nm和687nm处的荧光强度，得出荧光强度比(687nm的荧光强度比435nm的荧光强度)与zen的对数浓度的标准曲线；所述荧光分光光度计的激发波长设置为350nm，激发狭缝宽度为2.5nm，发射狭缝宽度为2.5nm。

s2：在270μl检测zen的比率荧光适配体传感器中加入30μl的待测溶液，反应5-40min后用荧光分光光度计在室温下分别检测溶液在435nm和687nm处的荧光强度，将两处荧光强度做比值后代入步骤s1中的标准曲线，得出待测溶液中zen的浓度。

本发明的有益效果：

(1)引入特异性识别元件zen的适配体，实现对目标物zen的特异性分析；

(2)利用cdte@sio2和ngqds-aptamer的荧光强度为双荧光探针，双信号输出模式实现对目标物zen的准确性、可靠性检测。

(3)本发明构建的比率荧光适配体传感器用于zen的检测，灵敏度高、选择性好、成本低，线性范围为0.001-1nm。

附图说明

图1是该比率荧光适配体传感器检测zen的原理示意图。

图2是该比率荧光适配体传感器可行性分析中不同溶液的荧光光谱图，a-比率荧光探针混合溶液，b-比率荧光探针混合溶液加入mtx，c-比率荧光探针混合溶液加入mtx再加zen。

图3a是不同浓度zen标准溶液存在时溶液的荧光光谱图；b是zen浓度与荧光强度比之间的线性关系图。

图4是各种干扰物存在时溶液的荧光变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明的内容作更细致地阐述：

实施例1：

按照图1所述的的制备流程，比率荧光适配体传感器的制备方法包括以下步骤：

(1)合成cdteqds；

在剧烈搅拌下，将0.1142gcdcl2·2.5h2o溶于50ml水中，加入75μl巯基丙酸，然后用1moll^-1naoh将溶液的ph调至8.5，通氮气15min；接着，快速加入2ml用0.0646gte和0.0457gnabh4合成的前驱体nahte溶液；接着通氮气10min后将混合溶液倒入三口烧瓶中，在100℃下回流20h，得到发射波长为665nm的红色cdteqds，并加入等体积乙醇离心去除杂质；烘干称重后溶于二次水中，并在4℃下储存。

(2)合成cdte@sio2

将1ml10μmcdteqds溶液与6ml乙醇混合，并在室温下搅拌5min；随后，添加20μlaptes，并将混合物溶液连续搅拌6h；按顺序分别添加100μlteos和nh3·h2o后搅拌24h；最后，将产物用乙醇和水离心洗涤三次后烘干，得到cdte@sio2。将cdte@sio2重新溶于超纯水中，得到cdte@sio2溶液。

(3)合成ngqds

将2g柠檬酸铵和60mlh2o在三口烧瓶中混合，并加热到200℃，此处注意将气球套在冷凝器的出口上方；回流30min后，溶液从无色变为亮黄色，表明粗产物已形成；用1mgml^-1naoh调节粗产物的ph至7.0，得到ngqds，保存在4℃下备用。

(4)ngqds的羧基与zen适配体修饰的氨基之间发生酰胺反应合成ngqds-aptamer

将体积比为2:1的ngqds和pbs混合搅拌30min，其中ngqds浓度为10mg·ml^-1，pbs中含有10mmedc和5mmnhs。然后，在搅拌下加入与ngqds等体积的zen适配体溶液(浓度为1μm)，并将混合物溶液连续搅拌2h。最后，将溶液储存在4℃下。

(5)混合cdte@sio2和ngqds-aptamer

将cdte@sio2和ngqds-aptamer按5:1的体积比混合，其中cdte@sio2溶液浓度为1mgml^-1，ngqds-aptamer溶液的浓度为4mgml^-1，用pbs溶液调节ph到7.4，得到比率荧光探针混合溶液。

(6)添加mtx；

将mtx溶液按1:9的体积比加入到比率荧光探针混合溶液中，mtx溶液浓度为10μm，作用10min得到用于zen分析的比率荧光适配体传感器。

在270μl检测zen的比率荧光适配体传感器中加入30μl1nm的zen标准溶液，反应5-40min后用荧光分光光度计在室温下分别检测溶液在435nm和687nm处的荧光强度。所述荧光分光光度计的激发波长设置为350nm，激发狭缝宽度为2.5nm，发射狭缝宽度为2.5nm。如图2所示，比率荧光探针混合溶液存在两个互不干扰的荧光发射峰，分别在435nm和687nm(线a)；加入mtx后(线b)，可能由于其在适配体上的过饱和吸附，使687nm的荧光发射略微减小；加入1nm的zen标准溶液后(线c)，zen与适配体特异性结合，使适配体与mtx分离，由于分散的mtx与cdte@sio2之间更容易发生内率效应，使687nm的荧光发射被猝灭；整个检测过程中ngqds-aptamer的荧光信号不发生变化。综上，该比例荧光适配体传感器用于检测zen具有可行性。

实施例2：

绘制zen响应标准曲线及线性回归方程式：

步骤(1)～(5)中按照实施例一的步骤(1)～(5)，不同在于加入mtx后，作用20min，分别加入0、0.001、0.002、0.005、0.02、0.1、0.2、1nm的zen标准溶液，反应40min。用荧光分光光度计在室温下分别检测上述不同浓度zen标准溶液在435nm和687nm处的荧光强度，所得的谱图如图3a所示，其中，图中曲线从上到下分别对应zen标准液的浓度为0、0.001、0.002、0.005、0.02、0.1、0.2、1nm。加入0nmzen时687nm与435nm的荧光信号比记为(f687/f435)0，加入其它浓度zen时687nm与435nm的荧光信号比记为(f687/f435)，获得(f687/f435)/(f687/f435)0(以id表示)与zen对数浓度的标准曲线如图3b所示；线性方程为：id＝0.6247-0.1194logczen，相关系数r²＝0.9919，检测限为0.33pm(s/n＝3)。

实施例3：

zen检测选择性的考察：

按照实施例一的步骤制备比例荧光适配体传感器，在270μl检测zen的比率荧光适配体传感器中分别加入30μl3nm黄曲霉毒素b1(afb1)、3nm伏马菌素b1(fb1)、3nm赭曲霉毒素(ota)、0.2nmzen及3nmafb1、fb1、ota混合液，作用40min后，用荧光分光光度计在室温下分别检测上述不同溶液在435nm和687nm处的荧光强度。如图4所示，afb1、fb1、ota对双信号荧光探针的荧光强度无明显影响，而当zen引入体系后会使荧光信号明显猝灭。以上结果说明该比例荧光适配体传感体系可以实现zen的特异性检测。