本申请涉及环保领域，具体而言，涉及一种土壤中三唑类杀菌剂的快速检测方法。
背景技术：
三唑类杀菌剂是指含有1,2,4-三唑环的化合物，具有高效、低毒、内吸性强等优点，是全球杀菌剂类别中品种最多的一个大类，被广泛应用于水果、蔬菜、谷物、中药材等的病虫害防治。
随着三唑类杀菌剂的广泛应用，其在作物中的残留问题越来越受到人们的关注，很多国家已经明确限定了三唑类杀菌剂在不同作物中的最高残留限量(mrl)，如国际食品法典委员会规定三唑酮在苹果和番茄中的mrl分别为0.3、0.2mg/kg；欧盟规定三环唑在葡萄、菠菜中的mrl均为0.05mg/kg；日本肯定列表中规定大豆和玉米中丙环唑的mrl分别为0.05、1.0mg/kg；我国新发布的gb2763-2019《食品中农药最大残留限量》中，新增了丙环唑、己唑醇、粉唑醇、戊唑醇4种三唑类杀菌剂的最大残留限量标准，覆盖谷物、蔬菜、水果、药用植物等43项最大残留限量。我国农业农村部种植业管理司于2019年5月24日发布的《食品安全国家标准食品中丙环唑等12种农药最大残留限量》(征求意见稿)中，对动物源性食品中三唑类杀菌剂也做了明确限量，规定哺乳动物脂肪(海洋哺乳动物除外)中，丙环唑的mrl为0.01mg/kg。农药不论以何种方式施用，大部分最终都将进入土壤，因此土壤是农药残留的储存库。三唑类杀菌剂在土壤环境中具有较强的稳定性，滞留期较长，长期施用必将造成此类农药在土壤环境中的累积，从而对土壤生态系统产生严重影响。同时，土壤环境中残留的农药还会通过植物根系活动逐渐转移至植物中，使得植物中农药残留量增大，影响农产品质量，对人体的健康造成危害。因此，对土壤中三唑类杀菌剂进行分析检测、准确了解土壤中三唑类杀菌剂的赋存浓度同样非常重要。
目前报道的有关三唑类杀菌剂分析方法的研究，主要围绕水果、农产品、水等介质，土壤介质中三唑类杀菌剂的提取净化方法研究较少。土壤基质复杂，含有大量有机质和色素等杂质，对一般污染物具有强吸附作用，同时背景基质的干扰还容易造成分析时的假阳性。土壤样品分析过程包括提取、净化及仪器分析等步骤，振荡提取、加速溶剂提取、超声提取是土壤样品中农药提取的主要方法；quechers方法是一种针对蔬菜、水果等样品中农药多残留检测的快速分析方法，此方法可以根据样品和目标物的特性，选择合适的提取溶剂和净化填料，具有快速、简便、安全等有点，该方法在生物、植株样品中应用广泛，但用于土壤样品中三唑类杀菌剂残留分析的研究较少。
本发明采用优化的quechers前处理方法，结合超高效液相色谱-串联质谱(uplc-ms/ms)，发明一种快速、准确的检测土壤中三唑类杀菌剂的分析方法，适用于土壤中三唑类杀菌剂的定性和定量分析。
技术实现要素：
基于建立土壤中三唑类杀菌剂快速检测方法的迫切需求，针对土壤介质中三唑类杀菌剂检测方法存在背景基质干扰、前处理净化步骤复杂、容易产生假阳性等问题，本申请提供一种土壤中三唑类杀菌剂的快速检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
1)建立三唑类杀菌剂的标准曲线；
2)采用改进的quechers法进行土壤样品的前处理；
3)结合标准曲线对三唑类杀菌剂进行定性定量的测定。
本发明的技术方案中，采用液质联用仪建立已知浓度梯度的多种三唑类杀菌剂的标准曲线，建立标准曲线的方法如下
(1)1000mg/l的丙环唑(编号：gbw(e)083565)、己唑醇(编号：gbw(e)083562)、粉唑醇(编号：gbw(e)082569a)的标准品分别用甲醇稀释至100mg/l的标准溶液。移取上述3种三唑类杀菌剂标准溶液各1ml，与1ml100mg/l的三环唑(编号：gbw(e)082338)标准品、1ml100mg/l的戊唑醇(编号：gbw(e)082333)标准品混合，并用甲醇定容至10ml，制成10mg/l的混合标准溶液。后用甲醇稀释并制成0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50μg/l的混合工作曲线溶液；
(2)利用qexactivefocus液质联用仪测定所述不同浓度混合工作曲线溶液中5种目标物的色谱峰保留时间和色谱峰面积，以浓度(μg/l)为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，分别绘制出5种目标物的标准曲线。
三唑类杀菌剂的定性定量测定，主要由以下步骤组成：
(1)定量：根据样品测定所得的相对响应值，从5种三唑类杀菌剂标准曲线中读出样品中各目标物的含量。
(2)定性：仪器方法中输入5种三唑类杀菌剂的精确质量数，在全扫描谱图中若发现这5个母离子时，即自动触发做母离子的二级质谱，将二级质谱图与标准谱图比对，即能判断出测定过程是否存在假阳性。具体原理为：化合物的分子经过离子化电离后，通过电压加速产生碎片离子，得到稳定的离子流；二级质谱通过二次电子轰击，得到进一步的确认离子碎片，母离子的裂解方式与化合物的化学结构相关，可作为化合物的定性依据。
优选地，所述改进的quechers法包括：
a)土壤样品制备：土壤样品风干、粉碎、过筛；
b)土壤样品提取：向样品中加入醇类溶剂，涡旋处理后使用超声提取，离心并收集上清液；
c)净化：使用吸附剂净化b)步骤中收集的上清液，涡旋处理后使用超声提取，离心并收集净化液，蒸发净化液中的溶剂；
d)复溶：使用醇类溶剂复溶c)步骤中去除溶剂后的净化液，过滤后得到待测样品。
优选地，所述a)步骤中，土壤样品粉碎至能过20目筛。
优选地，所述b)步骤中，醇类溶剂为甲醇。
本发明采用甲醇作为提取溶剂，土壤中的主要5种三唑类杀菌剂在丙酮、甲醇、乙腈中的溶解度均比较高，具体提取效率因各溶剂的极性不同会有所差异，本发明对上述三种溶剂进行了比较，选出了最佳提取溶剂。其中，丙酮对5种三唑类杀菌剂表现出较低的提取效率，甲醇和乙腈对5种三唑类杀菌剂的回收效率相当，考虑到成本，确定选取甲醇作为最优提取溶剂。
优选地，所述b)步骤的具体过程为，取3-7g步骤a)中粉碎后的土壤样品，加入醇类溶剂5-15ml，涡旋20-40s后，超声提取20-40min，于3000-5000rpm下离心3-7min，上清液转移至试管中，土壤样品重复前阶段操作，再提取一次，合并提取液，并用甲醇定容。
优选地，所述c)步骤中的净化剂为n-丙基乙二胺和florisil土的混合物。
优选地，所述n-丙基乙二胺和florisil土的比例为1：(0.5-1.5)，加入量为每毫升待净化的上清液加入30-50mg。
吸附剂选择上，本申请只采用psa和florisil土，不添加本领域常用的石墨化炭黑(gcb)和c18粉。gcb可有效吸附色素和甾醇等平面结构分子，但也吸附具有平面结构的农药分子，如具有环状结构的三唑类杀菌剂等，gcb的加入会严重降低三唑类杀菌剂的回收率。同时，三环唑和粉唑醇的回收率也会随着c18粉的添加量增加而降低，c18粉对三环唑的回收率影响显著。本发明中，样品量为5g土壤介质，在10ml土壤介质的提取液中添加200mgpsa和200mgflorisil土进行净化，净化后的提取液浓缩定容后，可直接用于液质联用仪分析测定，且无基质干扰、回收率高。
优选地，所述三唑类杀菌剂包括三环唑、粉唑醇、戊唑醇、己唑醇和丙环唑。
本发明的检测方法具有以下优点：
1、现有的方法中，多采用固相萃取净化，净化步骤复杂、净化过程中溶剂转换的步骤多，导致目标物损失较大，无法满足快速检测土壤介质中三唑类杀菌剂的需求。采用quechers法，通过简单的提取、净化步骤，获得高质量的快速、简便、廉价的前处理方法，可用于土壤中痕量三唑类杀菌剂的快速检测。
2、土壤中含有大量有机质和色素等杂质，背景基质干扰大，净化不充分易导致假阳性。本发明采用改进的quechers技术净化土壤样品提取液，在吸附剂选择时，考虑到psa可以有效去除提取液中脂肪酸、有机酸和一些极性色素及糖，florisil土可以去除色素、弱酸弱碱物质及大分子物质，且psa和florisil土对有机溶剂中的5种三唑类杀菌剂吸附均较弱，在有效去除杂质的同时也不影响目标物的回收率，所以最终选择这两种吸附剂，在10ml提取液中加入psa200mg、florisil土200mg，能够有效、快速去除土壤基质的背景干扰，获得理想的检测结果。
3、采用qexactivefocusorbitrap液质联用仪的全扫描联合目标物确认的检测方法，解决了常规检测器在检测复杂背景基质中痕量目标组分时选择性、灵敏度差的缺点，快速检测痕量三唑类杀菌剂。同时，方法中输入5种三唑类杀菌剂母体的精确质量数，在全扫描谱图中发现这5种三唑类杀菌剂母离子时，即会按照设置参数自动触发做母离子的二级质谱，用来作为目标物的定性确认，定量定性同步完成。
4、本发明同时分析了多种三唑类杀菌剂，添加浓度为0.001～0.1μg/g时各种目标物的空白加标回收率均能满足定量分析的要求，可检测范围广泛、全面、准确。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
用液质联用仪建立已知浓度梯度的5种三唑类杀菌剂的标准曲线，所述标准曲线的建立由以下步骤组成：
(1)1000mg/l的丙环唑(编号：gbw(e)083565)、己唑醇(编号：gbw(e)083562)、粉唑醇(编号：gbw(e)082569a)的标准品分别用甲醇稀释至100mg/l的标准溶液。移取上述3种三唑类杀菌剂标准溶液各1ml，与1ml100mg/l的三环唑(编号：gbw(e)082338)标准品、1ml100mg/l的戊唑醇(编号：gbw(e)082333)标准品混合，并用甲醇定容至10ml，制成10mg/l的混合标准溶液。后用甲醇稀释并制成0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50μg/l的混合工作曲线溶液；
(2)利用qexactivefocus液质联用仪测定所述不同浓度混合工作曲线溶液中5种目标物的色谱峰保留时间和色谱峰面积，以浓度(μg/l)为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，分别绘制出5种目标物的标准曲线；
其中，仪器色谱条件为：仪器选用thermofisher公司的qexactivefocusorbitrap液质联用仪；色谱柱选用agilent的c18色谱柱(infinitylabporoshell120ec-c18，2.1×150mm，2.7-micron，agilentpartno:693775-902)；柱温为40℃；流动相a为0.2％甲酸，流动相b为乙腈，流动相梯度为0min(a/b＝30/70，v/v)→3min(a/b＝10/90，v/v)→4min(a/b＝30/70，v/v)；流速为0.3ml/min；进样体积为2μl；
质谱条件为：离子源hesi-ⅱ；喷雾电压3500v(正离子模式)；气化温度350℃；鞘气压40arb；辅助气压10arb；离子传输管温度325℃；全扫面质量范围(m/z)100～1000；三环唑、粉唑醇、戊唑醇、己唑醇、丙环唑的精确质量数分别为190.04334、302.10995、308.15242、314.08214、342.07706。
第二部分，采用改进的quechers法，建立快速、简单、高效的土壤介质中5种三唑类杀菌剂的净化方法，主要由以下步骤组成：
(1)样品制备：土壤样品风干、粉碎后，过20目筛，取5g(±0.1g)放入50ml离心管中。
(2)提取：样品中加入甲醇10ml，涡旋30s后，超声提取30min，于4000rpm下离心5min，上清液转移至50ml试管中，土壤样品用10ml重复提取一次，合并提取液，并用甲醇定容至20ml。
(3)净化：15ml塑料管中称取n-丙基乙二胺(psa)200mg、florisil土200mg混合均匀，然后取10ml前述提取液加入到塑料管中，涡旋1min，4000rpm转速下离心3min后，取8ml净化液旋转蒸发至近干，氮气吹干后，用1ml甲醇复溶并超声助溶，样品过0.22μm有机滤膜后装瓶待测。
第三部分，5种三唑类杀菌剂的定性定量测定，主要由以下步骤组成：
(1)定量：根据样品测定所得的相对响应值，从5种三唑类杀菌剂标准曲线中读出样品中各目标物的含量。
(2)定性：仪器方法中输入5种三唑类杀菌剂的精确质量数，在全扫描谱图中若发现这5个母离子时，即自动触发做母离子的二级质谱，将二级质谱图与标准谱图比对，即能判断出测定过程是否存在假阳性。具体原理为：化合物的分子经过离子化电离后，通过电压加速产生碎片离子，得到稳定的离子流；二级质谱通过二次电子轰击，得到进一步的确认离子碎片，母离子的裂解方式与化合物的化学结构相关，可作为化合物的定性依据。
结果：
本发明方法，用于测定土壤介质中5种杀菌剂的浓度，仪器检测限(3倍信噪比)为0.01～0.05μg/l，仪器定量限为0.03～0.15μg/l(10倍信噪比)。工作曲线浓度设置为0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50μg/l，以每个浓度下的标准溶液所得相对响应值为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，建立工作曲线(见表1)。
表1五种杀菌剂的测定优化结果
土壤中5种杀菌剂的加标回收率结果见表2。添加浓度0.001～0.1μg/g条件下，三环唑的回收率为65.6～74.0％，相对标准偏差为6.6～7.8％；粉唑醇的回收率为74.9～90.9％，相对标准偏差为4.4～10.1％；戊唑醇的回收率为68.8～76.8％，相对标准偏差为1.1～6.7％；己唑醇的回收率为70.0～78.2％，相对标准偏差为7.1～8.1％；丙环唑的回收率为72.6～78.0％，相对标准偏差为2.9～8.5％。5种杀菌剂的回收率结果均能满足土壤介质中农药多残留检测的要求。
表2土壤中5种杀菌剂的加标回收率结果(n＝3)
吸附剂的确定
通过向含有5中三唑类杀菌剂的有机溶液中添加不同的吸附剂来监测不同吸附剂对其影响，结果如表3所示：
表3吸附剂对有机溶液中5种三唑类杀菌剂的影响
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。