一种检测三氯杀螨醇的试纸条及方法与流程

本发明涉及一种检测三氯杀螨醇的试纸条及方法，具体涉及一种用于检测三氯杀螨醇的胶体金试纸条，其特别适用于水果中三氯杀螨醇残留的检测。

背景技术：

三氯杀螨醇(dicofol)是一种有机氯杀螨剂，可防治棉花、果树、蔬菜等农作物上的螨类，对成螨、若螨、卵有很强的触杀和胃毒作用，药效期和速效期长。研究表明，该药物对人畜有一定毒性，主要中毒症状为头痛、头晕、多汗、胸闷、瞳孔散大、视物不清，以及恶心、呕吐、腹泻，局部接触可引起接触性皮炎。我国已将三氯杀螨醇禁用，国家标准gb2763-2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中也规定了水果中三氯杀螨醇的残留限量为1mg/kg。

目前已报道的检测三氯杀螨醇的方法主要是气相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱串联质谱法等仪器方法。这些方法均须在实验室条件下操作，样品前处理繁琐费时，还需配备昂贵的仪器设备，检测成本较高、耗时长、操作复杂，在实际应用过程中有很大的限制性，难以满足大量样品和现场样品快速检测的需要。因此，开发一种简单快速、适用于水果中三氯杀螨醇残留的胶体金试纸条，可满足大量样品现场筛选和监控，能够更好地满足我国食品监管部门等开展检测工作。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种能够检测水果中三氯杀螨醇残留的胶体金试纸条，并且提供一种高效、准确、简便、适于现场监控和大量样本筛查的检测方法。

本发明所提供的检测三氯杀螨醇的试纸条，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板；所述反应膜上具有包被有三氯杀螨醇半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线；所述结合物释放垫上喷涂有三氯杀螨醇单克隆抗体-胶体金标记物。

所述三氯杀螨醇单克隆抗体是以三氯杀螨醇半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。

所述三氯杀螨醇半抗原-载体蛋白偶联物由三氯杀螨醇半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白，所述三氯杀螨醇半抗原是由邻氯苯乙酸、氯苯和三氯乙醛在硫酸的催化下反应得到，其分子结构式为：

所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次粘贴在底板上，所述结合物释放垫1/3～1/2被覆盖于样品吸收垫下。

所述底板可为pvc底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述结合物释放垫可为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：

1)制备喷涂有三氯杀螨醇单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2)制备具有包被有三氯杀螨醇半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。

具体地说，步骤包括：

1)由邻氯苯乙酸、氯苯和三氯乙醛在硫酸的催化下反应，制备三氯杀螨醇半抗原；

2)将三氯杀螨醇半抗原与载体蛋白偶联，制备三氯杀螨醇半抗原-载体蛋白偶联物；

3)用三氯杀螨醇半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌三氯杀螨醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

4)提取小鼠igg免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；

5)分别将三氯杀螨醇半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体包被于反应膜的检测线(t)和质控线(c)上；

6)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

7)将制备的三氯杀螨醇单克隆抗体加入到制备的胶体金中，得到三氯杀螨醇单克隆抗体-胶体金标记物；

8)将三氯杀螨醇单克隆抗体-胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘1h后取出，置于干燥环境中保存备用；

9)将样品吸收垫用含0.5％牛血清白蛋白、ph为7.2、0.1mol/l的磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；

10)在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖。最后切成3mm宽的小条，加塑料盒，真空包装，4～30℃条件下保存12个月。

本发明的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测水果中三氯杀螨醇残留的方法，它包括步骤：

(1)样品前处理；

(2)用试纸条进行检测；

(3)分析检测结果。

本发明的三氯杀螨醇快速检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，将三氯杀螨醇单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的三氯杀螨醇在流动过程中与结合物释放垫上的三氯杀螨醇单克隆抗体-胶体金标记物结合，形成药物-抗体-胶体金标记物。样本中的药物与反应膜检测线上的三氯杀螨醇半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合三氯杀螨醇单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带深浅来判断待测样品液中是否含有三氯杀螨醇残留。

检测时，样品经处理后滴入试纸条卡孔内，当三氯杀螨醇在样品中的浓度低于检测限或为零时，单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的三氯杀螨醇半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线(t)和质控线(c)上各出现一条红色条带，且t线显色比c线显色深或与c线显色一致；如果三氯杀螨醇在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体-胶体金标记物会与三氯杀螨醇全部结合，从而在t线处因为竞争反应不会与三氯杀螨醇半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带或比c线显色浅。如图3所示。

阴性：当质控线(c)显示出红色条带，检测线(t)同时也显示出红色条带，且(t)线颜色接近或深于(c)线时，判为阴性。

阳性：当质控线(c)显示出红色条带，而检测线(t)不显色或(t)线颜色浅于(c)线时，判为阳性。

无效：当质控线(c)不显示出红色条带，则无论检测线(t)显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效。

本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。用本发明试纸条检测三氯杀螨醇残留的方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。

附图说明

图1为三氯杀螨醇半抗原合成图。

图2为试纸条剖面结构示意图。

图3为试纸条检测结果判定图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1检测三氯杀螨醇的试纸条的制备

该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：

1)制备喷涂有三氯杀螨醇单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2)制备具有包被有三氯杀螨醇半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；

3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。

下面分步详细叙述：

1、三氯杀螨醇半抗原的合成(合成路线见附图1)

取邻氯苯乙酸1.7g加四氯化碳100ml溶解，加入氯苯1.12g，充分搅拌后，加入三氯乙醛1.47g，冷却至10～15℃，滴加10ml10％的硫酸溶液，继续搅拌反应4h，反应完毕后加入100ml0～5℃冷水，移至分液漏斗中，震荡，静置分层，水相用三氯甲烷萃取三次，每次80ml，合并有机相；四氯化碳加水再洗涤一次，与三氯甲烷萃取液合并蒸干，得到红色油状物，用硅胶柱纯化，用石油醚和乙酸乙酯体积比为6:1的混合溶剂洗脱分离，得到三氯杀螨醇半抗原。

2、免疫原的制备

取三氯杀螨醇半抗原14mg，加二甲基亚砜(dmso)1ml溶解，加n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)8.2mg、碳二亚胺(edc)15.7mg，室温反应3h，得到半抗原溶液a液；取牛血清白蛋白(bsa)50mg，加0.05mol/lpb缓冲液溶解，得到b液；将a液滴加到b液中，4℃反应12h，用0.02mol/lpbs透析纯化3天，每天换液3次，得到三氯杀螨醇半抗原-bsa偶联物，即为免疫原，分装，-20℃保存。

3、包被原的制备

取三氯杀螨醇半抗原8.1mg，加1,4-二氧六环1ml溶解，加nhs6.1mg、edc9.7mg，室温反应3h，得到半抗原溶液a液；取卵清蛋白(ova)50mg，加0.05mol/lpb缓冲液溶解，得到b液；将a液滴加到b液中，4℃反应12h，用0.02mol/lpbs透析纯化3天，每天换液3次，得到三氯杀螨醇半抗原-ova偶联物，即为包被原，分装，-20℃保存。

4、三氯杀螨醇单克隆抗体的制备

(1)动物免疫

将步骤2得到的免疫原注入balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。

(2)细胞融合和克隆化

取免疫balb/c小鼠脾细胞，按8:1(数量配比)比例与sp2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争elisa测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

(3)细胞冻存和复苏

将杂交瘤细胞用冻存液制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

(4)单克隆抗体的制备与纯化

增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。

所述细胞培养基为向rpmi1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(质量分数)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量分数)；所述细胞培养基的ph为7.4。

5、羊抗鼠抗抗体的制备

以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

6、三氯杀螨醇单克隆抗体-胶体金标记物的制备

(1)胶体金的制备

用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％(质量分数)，取100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5ml1％柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，在日光下观察颜色为酒红色。

(2)三氯杀螨醇单克隆抗体-胶体金标记物的制备

在磁力搅拌下，用0.2mol/l碳酸钾溶液调胶体金的ph值至7.2，按每毫升胶体金溶液中加入20～50μg抗体的标准向胶体金溶液中加入上述三氯杀螨醇单克隆抗体，继续搅拌混匀30min；静置10min后加入10％bsa，使其在胶体金溶液中的终浓度为1％，静置10min。12000r/min、4℃离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。

复溶缓冲液：含bsa的质量分数为0.1％～0.3％、吐温-80的质量分数0.05％～0.2％、ph7.2的0.02mol/l磷酸盐缓冲液。

7、结合物释放垫的制备

将结合物释放垫浸泡于含0.5％bsa、ph7.2、0.5mol/l的磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿1h，37℃烘3h备用。用isoflow喷膜仪将制备好的三氯杀螨醇单克隆抗体-胶体金标记物均匀喷涂在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫喷涂0.01ml三氯杀螨醇单克隆抗体-胶体金标记物后，置于37℃环境中(湿度＜20％)60min后取出，置于干燥环境(湿度＜20％)中保存备用。

8、样品吸收垫的制备

将样品吸收垫置于含0.5％牛血清白蛋白、ph为7.2、0.1mol/l的磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37℃下烘干2h备用。

9、反应膜的制备

将三氯杀螨醇半抗原-卵清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线。

包被过程：用磷酸缓冲液将三氯杀螨醇半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到1mg/ml，用isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(t线)，包被量为1.0μl/cm；用0.01mol/l、ph7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/ml，用isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(c线)，包被量为1.0μl/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用。

10、试纸条的组装

根据附图2所示试纸条剖面结构，将样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)依次按顺序粘贴在pvc底板(7)上；结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与pvc底板的始端对齐，吸水垫的末端与pvc底板的末端对齐；所述反应膜上有检测线(5)和质控线(6)，检测线(t线)和质控线(c线)均为与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫的末端的一侧；将试纸条用机器切成3mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，4～30℃的环境中贮存，有效期12个月。

实施例2水果中三氯杀螨醇的检测

1、样品前处理

检测前将样品去泥后切碎成小于1cm的碎片或细碎小丁；称取(2.00±0.05)g切碎的样品至15ml离心管中，加入4ml磷酸盐缓冲液，盖上盖子，手动振荡30s，静置1min，取上层清液作为待测样本液。

2、用试纸条检测

用微量移液器吸取待测样本液70μl垂直滴于加样孔中；液体流动开始计时，反应10min，判定结果。

3、分析检测结果

阴性(－)：t线显色比c线显色深或与c线显色一致，表示样品中三氯杀螨醇浓度低于检测限，如图3a、3b。

阳性(+)：t线显色比c线显色浅或t线不显色，表示样品中三氯杀螨醇浓度等于或高于检测限，如图3c、3d。

无效：未出现c线，表明不正确的操作过程或试纸条已变质失效，如图3e、3f。

实施例3样品检测实例

1、检测限试验

取空白苹果、梨样本，在其中分别添加三氯杀螨醇至终浓度为0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg，取试纸条进行检测，每个样本重复测定三次。

用试纸条检测苹果、梨样本时，当其中无三氯杀螨醇和其添加浓度为0.5mg/kg时，试纸条上显示出t线显色比c线显色深或与c线显色一致，呈阴性；当其中三氯杀螨醇添加浓度为1.0mg/kg、2.0mg/kg时，试纸条上显示出t线显色比c线显色浅或t线不显色，呈阳性，表明本试纸条对水果中三氯杀螨醇的检测限为1.0mg/kg。

2、假阳性率、假阴性率试验

取空白苹果、梨样本及添加三氯杀螨醇至终浓度为1.0mg/kg的阳性苹果、梨样本各20份，用3个批次生产的试纸条分别进行检测，计算其阴阳性率。

结果表明：用3个批次生产的试纸条检测阳性样本时，结果全为阳性，可知阳性符合率为100％，假阴性率为0；检测阴性样本时，结果全为阴性，可知阴性符合率为100％，假阳性率为0。说明本发明的检测三氯杀螨醇的试纸条可以对水果样本中三氯杀螨醇残留进行快速检测。

3、特异性试验

用本试纸条检测10mg/kg滴滴涕、六六六、三氯杀螨砜、五氯硝基苯等其他有机氯类农药时，试纸条上显示出t线显色比c线显色深或与c线显色一致，呈阴性，说明本试纸条对这些药物无交叉反应。