一种颐和春制剂的薄层色谱检测方法与流程

本发明属于药品质量控制技术领域，具体涉及一种颐和春制剂的薄层色谱检测方法。

背景技术：

颐和春口服液由人参、川牛膝、狗肾、熟地黄、鹿茸、淫羊藿、韭菜子、蛇床子、锁阳、鹿鞭、北沙参等15味药材经提取制备而成，能够补肾壮阳，用于肾阳虚引起的阳痿、遗精、腰膝酸软，其疗效显著、副作用小、使用方便。其中人参为君药，为了保证产品质量，研究一种适合颐和春口服液中人参的鉴别方法尤为重要。

传统高效液相色谱具有灵敏度高、准确度高等优点，已成为控制中药质量的重要手段之一，其基本模式为等度和梯度洗脱，将这两种模式组合应用，可将成分较好分离开。现有技术中常采用高效液相色谱法测定含人参中药制剂中人参皂苷rg1，re，rb1的含量。

中国专利申请cn102435697a公开了一种心舒胶囊中人参皂苷rg1和rb1含量的测定方法，检测方法为梯度洗脱方法，同时检测rb1和rg1。

中国专利申请cn104807905a公开了一种心脑宁片中人参皂苷rg1和re含量的测定方法。采用梯度洗脱方法，同时检测re和rg1，线性关系良好、精密度高、稳定性好、回收率高，简便、快捷并且准确可行。

以上现有技术中均公开了采用hplc等度和梯度结合方式进行检测中药制剂中人参皂苷rg1，re，rb1的含量检测。但由于颐和春制剂由15种中药组成，其组分比较复杂，多于其他中药制剂组分；同时等度和梯度洗脱的组合方式难以计数，且梯度洗脱的分离机理比较复杂，现有文献披露的实验方案无法满足颐和春制剂中人参皂苷rg1，re，rb1的分离和含量检测，而且采用hplc方法需要有价格昂贵的相应仪器，且分离时间长。

薄层色谱又称薄层层析，可以快速的的进行药物成分的定性，它是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、检定和定量的一种层析分离技术。但颐和春口服液处方中药味较多，成分复杂，现行标准中人参皂苷rg1、re对照品斑点的rf值均小于0.1，效果不佳。

因此，提供一种适合颐和春口服液中人参的薄层色谱鉴别方法具有重要的意义。

技术实现要素：

为克服以上技术问题，本发明提供了一种颐和春制剂中人参的薄层色谱检测方法，该方法简单易行，能够得到准确的鉴别结果。

为实现以上目的，本发明提供的技术方案如下：

一种颐和春制剂中人参的薄层色谱检测方法，包括以下步骤：

取颐和春制剂供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液分别点于同一硅胶g薄层板上，以正丁醇-乙酸乙酯-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以显色剂，加热至斑点显色清晰，分别置于日光和紫外光灯(365nm)下检视；得色谱检视图。

颐和春制剂中人参的薄层色谱检测方法，包括以下步骤：

(1)制备供试品溶液：

a)取颐和春制剂配置成水溶液，经乙醚萃取后的水相用正丁醇提取，正丁醇提取液经氨试液洗涤，浓缩干燥，得正丁醇提取物；

b)正丁醇提取物经大孔树脂柱层析洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，以干燥物制备供试品溶液；

(2)制备对照品溶液：

以人参皂苷rg1对照品制备对照品溶液；和/或以人参药材制备对照品溶液；

(3)薄层检测：

分别将供试品溶液和对照品溶液在薄层板上点样，以正丁醇-乙酸乙酯-水系统为展开剂展开，显色，检视，比对即可。

优选地，所述柱层析的洗脱条件为依次用水、30-50％乙醇、60-80％乙醇洗脱，收集60-80％乙醇洗脱液；优选用水、40％乙醇、70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液。

优选地，所述柱层析的洗脱液为1.7-3.1个柱体积的水、1.0-2.0个柱体积的40％乙醇、1.7-2.5个柱体积的70％乙醇。

优选地，所述柱层析的洗脱溶剂为2.4个柱体积的水、1.4个柱体积的40％乙醇、2.4个柱体积的70％乙醇洗脱。

优选地，所述乙醚萃取次数为1-3次，正丁醇提取次数为1-4次，氨试液洗涤1-3次；所述浓缩干燥为蒸干干燥。

优选地，所述薄层板为硅胶g薄层板。

优选地，所述颐和春制剂供试品溶液的制备方法如下：

(1)取颐和春制剂的水溶液30ml，加乙醚提取2次，每次20ml，得乙醚液和水相，弃去乙醚液，水相用水饱和正丁醇提取3次(30ml、30ml、20ml)，合并正丁醇提取液；

(2)将正丁醇提取液用氨试液洗涤2次，每次40ml，置于水浴上蒸干后的残渣加水30ml溶解，得水溶液；

(3)将水溶液通过d101大孔树脂柱(内径为1.5cm，柱高为12cm)，依次用水50ml、40％乙醇30ml和70％乙醇50ml洗脱，收集70％乙醇洗脱液，蒸干后的残渣加1ml甲醇溶解。

优选地，供试品溶液的点样量为3-7μl，人参皂苷rg1对照品溶液的点样量为1-4μl，人参药材对照品溶液的点样量为1-3μl。

优选地，供试品溶液的点样量为3μl，人参皂苷rg1对照品溶液的点样量为2μl，人参药材对照品溶液的点样量为2μl。

优选地，所述展开剂为体积比为3-5:1-2:4-7的正丁醇-乙酸乙酯-水的上层溶液。

优选地，所述展开剂为体积比为4:1:5的正丁醇-乙酸乙酯-水的上层溶液。

优选地，所述显色的显色剂为5-20％硫酸乙醇溶液。

优选地，所述显色的显色剂为10％硫酸乙醇溶液。

优选地，所述显色的条件为加热；

优选地，所述显色的加热温度为90-110℃。

优选地，所述显色的加热温度为105℃。

优选地，所述检视为置于日光和/或紫外光灯下观察。

优选地，所述干燥物用甲醇溶解制备供试品溶液；所述人参皂苷rg1对照品用甲醇溶解制备对照品溶液。

优选地，所述以人参药材制备对照品溶液的步骤为：

取人参对照药材，三氯甲烷加热回流，药渣加水饱和正丁醇，超声处理，吸取上清液加2-5倍量氨试液，摇匀，放置分层，取上层液蒸干，残渣加甲醇。

优选地，所述以人参药材制备对照品溶液的步骤为：

取人参对照药材1g，加三氯甲烷40ml，加热回流1小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，加水0.5ml搅拌湿润，加水饱和正丁醇10ml，超声处理30分钟，吸取上清液加3倍量氨试液，摇匀，放置分层，取上层液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解。

本发明所述的颐和春制剂选自颗粒剂、片剂、胶囊剂、口服液以及其他药学上可接受的的剂型中的任一种。

本发明所述的颐和春制剂，由人参、川牛膝、狗肾(制)、锁阳、鹿茸(去毛)、淫羊藿、鹿鞭(制)、沙参、冰片、蛇床子、熟地黄、韭菜子(炒)、复盆子、附子(制)、路路通为十五味原料制备而得。

优选地，本发明所述的颐和春制剂，由人参60～90g、川牛膝40-60g、狗肾(制)80-120g、锁阳80-120g、鹿茸(去毛)10-15g、淫羊藿160-240g、鹿鞭(制)2.4-3.6g、沙参80-120g、冰片2-3g、蛇床子160-240g、熟地黄80-120g、韭菜子(炒)100-150g、复盆子60-90g、附子(制)40-60g、路路通60-90g十五味原料制备而得。

优选地，本发明所述的颐和春制剂组合物，由人参75g、川牛膝50g、狗肾(制)100g、锁阳100g、鹿茸(去毛)12.5g、淫羊藿200g、鹿鞭(制)3g、沙参100g、冰片2.5g、蛇床子200g、熟地黄100g、韭菜子(炒)125g、复盆子75g、附子(制)50g、路路通75g，十五味原料制备而得。

本发明所述的颐和春制剂的制备方法，参见卫生部药品标准中药成方制剂第十九册。包括如下步骤：

取所述十五味原料，将熟地黄、复盆子、附子、川牛膝、路路通、锁阳、淫阳藿、沙参、韭菜子、蛇床子酌予碎断，置提取器内，加水适量浸泡8～12小时，煎煮三次，分次滤过，合并滤液，浓缩至适量，喷雾干燥，得提取物1，备用；

人参、狗肾、鹿鞭、鹿茸，共研细粉；

取冰片研细与上述细粉、提取物1混匀，即得颐和春提取物，经后续制剂工艺，即可制备得到，也可直接分装胶囊制得胶囊剂，或者直接溶解于水得到溶液剂。该颐和春提取物也可直接作为颐和春制剂使用。

与现有技术比，本发明具有如下有益效果：

与现有质量标准相比，本发明得到的人参皂苷rg1的rf值达到0.2以上，增加人参对照药材后，使鉴别结果更全面。

附图说明

图1：实施例1中日光下检视图，从左到右的色谱点分别为：人参皂苷re对照品、人参皂苷rg1对照品、供试品溶液3μl、5μl、7μl；

图2：实施例1中紫外光灯下检视图，从左到右的色谱点分别为：人参皂苷re对照品、人参皂苷rg1对照品、供试品溶液3μl、5μl、7μl；

图3：实施例2中展开系统一的日光下检视图，从左到右的色谱点分别为：人参皂苷re对照品、人参皂苷rg1对照品、供试品溶液；

图4：实施例2中展开系统一的紫外光灯下检视图，从左到右的色谱点分别为：人参皂苷re对照品、人参皂苷rg1对照品、供试品溶液；

图5：实施例2中展开系统二的日光下检视图，从左到右的色谱点分别为：人参皂苷re对照品、人参皂苷rg1对照品、供试品溶液；

图6：实施例2中展开系统二的紫外光灯下检视图，从左到右的色谱点分别为：人参皂苷re对照品、人参皂苷rg1对照品、供试品溶液；

图7：实施例2中展开系统三的中日光下检视图，从左到右的色谱点分别为：人参皂苷re对照品、人参皂苷rg1对照品、供试品溶液；

图8：实施例2中展开系统三的紫外光灯下检视图，从左到右的色谱点分别为：人参皂苷re对照品、人参皂苷rg1对照品、供试品溶液；

图9：实施例3中日光下检视图，从左到右的色谱点分别为：人参皂苷re对照品、人参皂苷rg1对照品、70％乙醇部位供试品溶液、40％乙醇部位供试品溶液；

图10：实施例3中紫外光灯下检视图，从左到右的色谱点分别为：人参皂苷re对照品、人参皂苷rg1对照品、70％乙醇部位供试品溶液、40％乙醇部位供试品溶液；

图11：实施例3中日光下检视图(手动描绘图)，从左到右的色谱点分别为：人参皂苷re对照品、人参皂苷rg1对照品、70％乙醇部位供试品溶液、40％乙醇部位供试品溶液；

图12：实施例3中紫外光灯下检视图(手动描绘图)，从左到右的色谱点分别为：人参皂苷re对照品、人参皂苷rg1对照品、70％乙醇部位供试品溶液、40％乙醇部位供试品溶液；

图13：实施例4中日光下检视图，从左到右的色谱点分别为：人参皂苷rg1对照品、70％乙醇部位供试品溶液、对照药材溶液；

图14：实施例4中紫外光灯下检视图，从左到右的色谱点分别为：人参皂苷rg1对照品、70％乙醇部位供试品溶液、对照药材溶液；

图15：实施例4中日光下检视图(手动描绘图)，从左到右的色谱点分别为：人参皂苷rg1对照品、70％乙醇部位供试品溶液、对照药材溶液；

图16：实施例4中紫外光灯下检视图(手动描绘图)，从左到右的色谱点分别为：人参皂苷rg1对照品、70％乙醇部位供试品溶液、对照药材溶液；

图17：实施例5中日光下检视图，从左到右的色谱点分别为：人参皂苷rg1对照品、对照药材溶液、阴性样品、17080810供试品、18072301供试品、18122904供试品；

图18：实施例5中紫外光灯下检视图，从左到右的色谱点分别为：人参皂苷rg1对照品、对照药材溶液、阴性样品、17080810供试品、18072301供试品、18122904供试品；

图19：实施例5中日光下检视图(手动描绘图)，从左到右的色谱点分别为：人参皂苷rg1对照品、对照药材溶液、阴性样品、17080810供试品、18072301供试品、18122904供试品；

图20：实施例5中紫外光灯下检视图(手动描绘图)，从左到右的色谱点分别为：人参皂苷rg1对照品、对照药材溶液、阴性样品、17080810供试品、18072301供试品、18122904供试品；

现结合附图和实施例对本发明作进一步说明：

具体实施方式

实施例1点样量的比较

1、供试品溶液制备

取颐和春口服液30ml，加乙醚萃取2次，每次20ml，弃乙醚液，水液用饱和正丁醇萃取3次(30ml、30ml、20ml)，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次40ml，正丁醇液置于水浴上蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为供试品溶液。

2、对照品溶液制备

精密称取人参皂苷rg1，加甲醇制成浓度为2mg/ml的对照品溶液；精密称取人参皂苷re，加甲醇制成浓度为2mg/ml的对照品溶液。

3、点样、展开

吸取供试品溶液3μl、5μl、7μl，1.2对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15:40:22:10)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外灯(365nm)下检视结果如图1、图2所示，但人参皂苷rg1的rf值小于0.1，供试品溶液选择3μl作为点样量。实验结果见图1、图2。

实施例2展开系统的比较

1、供试品溶液制备

取颐和春口服液30ml，加乙醚萃取2次，每次20ml，弃乙醚液，水液用饱和正丁醇萃取3次(30ml、30ml、20ml)，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次40ml，正丁醇液置于水浴上蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为供试品溶液。

2、对照品溶液制备

精密称取人参皂苷rg1，加甲醇制成浓度为2mg/ml的对照品溶液；精密称取人参皂苷re，加甲醇制成浓度为2mg/ml的对照品溶液。

3、点样

吸取供试品溶液3μl，对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上。

4、展开

展开系统一

以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15:40:22:10)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，再次展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外灯(365nm)下检视结果如图3、4所示，人参皂苷re和rg1的rf值均大于0.2，但供试品色谱中，与人参皂苷re和rg1对照品色谱相应位置上的斑点形状欠圆整，且人参皂苷rg1对应的斑点有黄色斑点干扰。实验结果见图3、图4。

展开系统二

以正丁醇-乙酸乙酯-甲醇-水(15:40:22:10)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外灯(365nm)下检视结果如图5、6所示，供试品色谱中，在对照品色谱相应的位置上，斑点无法分离，不能鉴别。实验结果见图5、图6。

展开系统三

以正丁醇-乙酸乙酯-水(4:1:5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外灯(365nm)下检视结果如图7、8所示，供试品色谱中，在对照品色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点和荧光斑点，人参皂苷re和rg1的rf值均大于0.2，但供试品色谱中人参皂苷re处有黄色荧光斑点干扰且供试品斑点分离效果较差。实验结果见图7、图8。

实施例3供试品溶液处理方法的改进

1、供试品溶液制备

取颐和春口服液30ml，加乙醚萃取2次，每次20ml，弃乙醚液，水液用饱和正丁醇萃取3次(30ml、30ml、20ml)，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次40ml，正丁醇液置于水浴上蒸干，残渣加水30ml溶解，通过d101型大孔树脂(内径为1.5cm，柱高为12cm)，先后用水50ml、40％乙醇30ml和70％乙醇50ml洗脱，收集各部位洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为供试品溶液。

2、对照品溶液制备

精密称取人参皂苷rg1，加甲醇制成浓度为2mg/ml的对照品溶液；精密称取人参皂苷re，加甲醇制成浓度为2mg/ml的对照品溶液。

3、点样、展开

吸取供试品溶液40％、70％洗脱部位3μl，对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以正丁醇-乙酸乙酯-水(4:1:5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外灯(365nm)下检视结果如图9、10所示，70％乙醇部位供试品色谱中，在对照品色谱相应的位置上，分别显相同颜色斑点和荧光斑点，且分离度较好，人参皂苷re和rg1的rf值均大于0.2，但人参皂苷re处有黄色荧光干扰；40％乙醇部位供试品色谱中，总体斑点较淡，难以识别，选择70％乙醇部位作为供试品溶液。本实施例中分别提供了tlc照片及根据tlc照片绘制的手动描绘图，以更清楚的表达本实施例的效果，分别见图9、图10，图11、图12。

实施例4增加人参对照药材

1、供试品溶液制备

取颐和春口服液30ml，加乙醚萃取2次，每次20ml，弃乙醚液，水液用饱和正丁醇萃取3次(30ml、30ml、20ml)，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次40ml，正丁醇液置于水浴上蒸干，残渣加水30ml溶解，通过d101型大孔树脂(内径为1.5cm，柱高为12cm)，先后用水50ml、40％乙醇30ml和70％乙醇50ml洗脱，收集各部位洗脱液，其中70％为主要实验部位，蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为供试品溶液。

2、对照品溶液制备

精密称取人参皂苷rg1，加甲醇制成浓度为2mg/ml的对照品溶液。

3、对照药材溶液制备

取人参对照药材1g，加三氯甲烷40ml，加热回流1小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，加水0.5ml搅拌湿润，加水饱和正丁醇10ml，超声处理30分钟，吸取上清液加3倍量氨试液，摇匀，放置分层，取上层液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解。

4、点样、展开

吸取供试品溶液3μl，对照品溶液2μl，对照药材溶液2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以正丁醇-乙酸乙酯-水(4:1:5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外灯(365nm)下检视结果如图13、14所示，供试品色谱中，在对照药材色谱相应的位置上，分别显相同颜色主斑点和荧光主斑点，且分离度较好。本实施例中分别提供了tlc照片及根据tlc照片绘制的手动描绘图，以更清楚的表达本实施例的效果，分别见图13、图14、图15、图16。

实施例5三批样品检测

1、供试品溶液制备

取颐和春口服液(批号17080810、18072301、18122904)30ml，加乙醚萃取2次，每次20ml，弃乙醚液，水液用饱和正丁醇萃取3次(30ml、30ml、20ml)，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次40ml，正丁醇液置于水浴上蒸干，残渣加纯水30ml溶解，通过d101型大孔树脂(内径为1.5cm，柱高为12cm)，先后用水50ml、40％乙醇30ml和70％乙醇50ml洗脱，收集70％乙醇部位，蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为供试品溶液；

2、对照品溶液制备

精密称取人参皂苷rg1，加甲醇制成浓度为2mg/ml的对照品溶液。

3、对照药材溶液制备

取人参对照药材1g，加三氯甲烷40ml，加热回流1小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，加水0.5ml搅拌湿润，加水饱和正丁醇10ml，超声处理30分钟，吸取上清液加3倍量氨试液，摇匀，放置分层，取上层液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解。

4、阴性样品溶液制备

制备不含人参的阴性样品，取阴性样品30ml，加乙醚萃取2次，每次20ml，弃乙醚液，水液用饱和正丁醇萃取3次(30ml、30ml、20ml)，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次40ml，正丁醇液置于水浴上蒸干，残渣加纯水30ml溶解，通过d101型大孔树脂(内径为1.5cm，柱高为12cm)，先后用水50ml、40％乙醇30ml和70％乙醇50ml洗脱，收集70％乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为阴性样品溶液。

5、点样、展开

取供试品溶液3μl，阴性样品溶液3μl、对照品溶液2μl，对照药材溶液2μl分别点于同一硅胶g薄层板上，以正丁醇-乙酸乙酯-水(4:1:5)上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置于日光和紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，分别显示相同颜色的斑点或荧光斑点。该方法检测结果全面、准确。本实施例中分别提供了tlc照片及根据tlc照片绘制的手动描绘图，以更清楚的表达本实施例的效果，分别见图17、图18、图19、图20。

上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。