本发明涉及临床体外检测领域，具体涉及一种新型冠状病毒检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
2019新型冠状病毒(2019-ncov)属于β冠状病毒属，其基因组为一长约29kb的正单链rna。其基因组可编码至少四种病毒结构蛋白，分别为刺突蛋白(spike，s)、膜蛋白(membrane，m)，包膜蛋白(envelop，e)以及核蛋白(nucleocapsid，n)。
化学发光免疫分析法(chemiluminescenceimmunoassay,clia)兴起于上世纪70年代中期，发展至今已经成为一种成熟先进的超微量活性物质检测技术，应用范围十分广泛。该技术近10年发展迅猛，是目前推广应用最快的免疫分析方法，也是目前最先进的标记免疫测定技术，灵敏度和精确度比酶免法、荧光法高几个数量级。
在化学发光免疫分析中包含两个部分，即免疫反应技术和化学发光技术。其基本原理是免疫反应中的酶作用于发光底物，使之发生化学反应并释放出大量的能量，产生激发态的中间体。这种激发态中间体回到稳定的基态时，可同时发射出光子。利用发光信号测量仪器即可测量出光量子产额，该光量子产额与样品中的待测物质的量成正比，由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量。化学发光免疫分析技术常采用双抗体夹心法、竞争法及间接法等反应模式。
磁微粒是指磁性纳米粒子与无机或有机分子结合形成的可均匀分散于一定基液中具有高度稳定性的胶态复合材料。由于磁微粒具有磁响应性，成本低、能耗少和无污染等特点，人们在磁微粒表面或通过磁微粒表面的功能基团(如氨基、羧基、巯基及环氧乙烷等)将酶、抗体、寡核苷酸等生物活性物质进行固定，可进一步用于酶的固定化、靶向药物载体、细胞分选、免疫检测、蛋白与核酸的分离纯化及杂交检测等领域。
传统的免疫学检测多以酶标板为固相载体，而悬浮性磁微粒作为载体具有较高的比表面积，能够更为充分地与样品反应，加之外加磁场的灵活应用，较之酶标板载体具有更高的灵敏度、更快的检测速度和更好的重复性等优点，目前已被广泛应用于生物及医学检测等领域。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现要素：
发明目的
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒检测试剂盒及其制备方法。本发明实施例提供的新型冠状病毒检测试剂盒，采用间接法原理定性检测人血清或血浆中新型冠状病毒iga抗体：用新型冠状病毒抗原标记磁微粒，加入待检样本，样本中的抗新型冠状病毒抗体与标记抗原反应，再与辣根过氧化物酶标记的鼠抗人iga抗体结合，通过免疫反应形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，该复合物催化发光底物发出光子，发光强度与待测样本中的新型冠状病毒iga抗体的含量成正比。通过对部分临床已确诊为新型冠状病毒感染阳性，但pcr核酸检测阴性的患者的血样进行复检，该试剂盒能检出相当部分(iga)阳性，提示可与核酸检测形成互补。
解决方案
为实现本发明目的，本发明实施例提供了一种新型冠状病毒检测试剂盒，所述新型冠状病毒检测试剂盒包括：辣根过氧化物酶标记的抗人iga抗体(iga-hrp)；
和，偶联有新型冠状病毒抗原的磁微粒。所述新型冠状病毒指2019新型冠状病毒(2019novelcoronavirus，2019-ncov)。
上述新型冠状病毒检测试剂盒在一种可能的实现方式中，抗人iga抗体包括鼠抗人iga抗体，羊抗人iga抗体或兔抗人iga抗体中的一种或多种；可选地，抗人iga抗体为鼠抗人iga抗体。
上述新型冠状病毒检测试剂盒在一种可能的实现方式中，新型冠状病毒抗原包括新型冠状病毒n蛋白，新型冠状病毒n蛋白片段，新型冠状病毒s蛋白或新型冠状病毒s蛋白片段中的一种或多种。
上述新型冠状病毒检测试剂盒在一种可能的实现方式中，新型冠状病毒抗原包括新型冠状病毒n蛋白或新型冠状病毒n蛋白片段；可选地，新型冠状病毒抗原包括新型冠状病毒n蛋白。
上述新型冠状病毒检测试剂盒在一种可能的实现方式中，新型冠状病毒抗原包括新型冠状病毒s蛋白或新型冠状病毒s蛋白片段；可选地，新型冠状病毒抗原包括新型冠状病毒s蛋白片段。
上述新型冠状病毒检测试剂盒在一种可能的实现方式中，新型冠状病毒抗原包括新型冠状病毒n蛋白和新型冠状病毒s蛋白片段。
上述新型冠状病毒检测试剂盒在一种可能的实现方式中，新型冠状病毒n蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示。
上述新型冠状病毒检测试剂盒在一种可能的实现方式中，编码新型冠状病毒n蛋白的基因序列如seqidno.2所示。
上述新型冠状病毒检测试剂盒在一种可能的实现方式中，新型冠状病毒s蛋白片段的氨基酸序列如seqidno.3所示。seqidno.3所示的序列为新型冠状病毒s蛋白氨基酸序列的340-650区域，该区域为s蛋白的受体结合域，富含b细胞表位，用作抗原，特异性好。
上述新型冠状病毒检测试剂盒在一种可能的实现方式中，编码新型冠状病毒s蛋白片段的基因序列如seqidno.4所示。
上述新型冠状病毒检测试剂盒在一种可能的实现方式中，新型冠状病毒抗原中，新型冠状病毒n蛋白和新型冠状病毒s蛋白片段的质量比为5-9：1-6；可选地为7：3。
上述新型冠状病毒检测试剂盒在一种可能的实现方式中，所述新型冠状病毒检测试剂盒包括：发光底物液a、发光底物液b、标本稀释液、酶标工作液、校准品和磁珠悬浮液；
其中，酶标工作液包括所述辣根过氧化物酶标记的抗人iga抗体(iga-hrp)，磁珠悬浮液包括所述偶联有新型冠状病毒抗原的磁微粒。
上述新型冠状病毒检测试剂盒在一种可能的实现方式中，发光底物液a包括下述组分：tris(三羟甲基氨基甲烷)，盐酸和鲁米诺；可选地，发光底物液a包括下述终浓度的组分：tris0.01-0.05g/l，盐酸0.002-0.01ml/l，鲁米诺0.001-0.007g/l；进一步可选地，发光底物液a包括下述终浓度的组分：tris0.02g/l，盐酸0.006ml/l，鲁米诺0.003g/l。
上述新型冠状病毒检测试剂盒在一种可能的实现方式中，发光底物液b包括下述组分：磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，过氧化脲和氯化钠；可选地，发光底物液b包括下述终浓度的组分：磷酸二氢钠0.1-0.5g/l，磷酸氢二钠2.0-4.0g/l，过氧化脲0.002-0.05g/l，氯化钠3-15g/l；进一步可选地，发光底物液b包括下述终浓度的组分：磷酸二氢钠0.2g/l，磷酸氢二钠2.9g/l，过氧化脲0.01g/l，氯化钠9g/l。
上述新型冠状病毒检测试剂盒在一种可能的实现方式中，标本稀释液包括下述组分：bsa(牛血清白蛋白)，氯化钠和proclin300；可选地，标本稀释液包括下述终浓度的组分：bsa(牛血清白蛋白)8-15g/l，氯化钠5-12g/l，proclin3000.1-1ml/l；进一步可选地，标本稀释液包括下述终浓度的组分：bsa(牛血清白蛋白)10g/l，氯化钠9g/l，proclin3000.5ml/l。
上述新型冠状病毒检测试剂盒在一种可能的实现方式中，酶标工作液包括下述组分：所述辣根过氧化物酶标记的鼠抗人iga抗体(iga-hrp)，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，氨基比林，proclin300和casein(酪蛋白)；可选地，酶标工作液包括下述终浓度的组分：iga-hrp0.7-1.5mg/l，磷酸二氢钠0.05-0.4g/l，磷酸氢二钠2.0-4.0g/l，氨基比林0.2-1.5g/l，proclin3000.1-1.0ml/l，casein(酪蛋白)1.0-4.0g/l；进一步可选地，酶标工作液包括下述终浓度的组分：iga-hrp1mg/l，磷酸二氢钠0.2g/l，磷酸氢二钠2.9g/l，氨基比林1g/l，proclin3000.5ml/l，casein(酪蛋白)2.5g/l。
辣根过氧化物酶标记的鼠抗人iga抗体(iga-hrp)为本领域常规产品，本领域通用的标记比例为1mghrp上标记2mg鼠抗人iga抗体。本发明试剂盒中，iga-hrp的终浓度以iga的质量计，即“iga-hrp0.7-1.5mg/l”指以iga的质量计，酶标工作液中iga-hrp的终浓度为0.7-1.5mg/l。
上述新型冠状病毒检测试剂盒在一种可能的实现方式中，校准品包括：抗新型冠状病毒抗体；可选地，校准品包括下述终浓度的组分：抗新型冠状病毒抗体160au/ml。本发明中，所用校准品为抗体血清。
上述新型冠状病毒检测试剂盒在一种可能的实现方式中，磁珠悬浮液包括下述终浓度的组分：偶联有新型冠状病毒抗原的磁微粒(以磁微粒的质量计)0.2-2g/l，其中，1g磁微粒上偶联有2-15mg的新型冠状病毒抗原；可选地，磁珠悬浮液包括下述终浓度的组分：偶联有新型冠状病毒抗原的磁微粒(以磁微粒的质量计)0.2-2g/l，其中，1g磁微粒上偶联有5-9mg的新型冠状病毒n蛋白和1-6mg的新型冠状病毒s蛋白片段；进一步可选地，磁珠悬浮液包括下述终浓度的组分：偶联有新型冠状病毒抗原的磁微粒1g/l，其中，1g磁微粒上偶联有7mg的新型冠状病毒n蛋白和3mg的新型冠状病毒s蛋白片段。
本发明实施例还提供了利用上述新型冠状病毒检测试剂盒的组分制备新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法。
上述制备方法在一种可能的实现方式中，发光底物液a的制备方法包括下述步骤：称取各组分，分别溶于蒸馏水中，定容，即得；
发光底物液b的制备方法包括下述步骤：称取各组分，分别溶于蒸馏水中，定容，即得；
标本稀释液的制备方法包括下述步骤：称取各组分，分别溶于蒸馏水中，定容，即得；
酶标工作液的制备方法包括下述步骤：称取各组分，分别溶于蒸馏水中，定容，即得。
上述制备方法在一种可能的实现方式中，磁珠悬浮液的制备方法包括下述步骤：称取磁微粒，用碳二亚胺(edc)活化，加入新型冠状病毒抗原，混悬，清洗，定容。
本发明实施例还提供了上述新型冠状病毒检测试剂盒的使用方法，所述使用方法包括下述步骤：
将校准品梯度稀释；在全自动化学发光仪的反应杯中，每孔分别加入样品稀释液，校准品或待测样本，磁微粒悬浮液，酶标工作液，发光底物液a和发光底物液b；检测发光强度，输出检测结果；
计算：以校准品发光强度rlu值建立定标曲线，将待测样本的rlu值代入定标曲线中计算待测样本中新型冠状病毒iga抗体的含量。
有益效果
(1)本发明实施例中提供的新型冠状病毒检测试剂盒，首次在酶标工作液中加入了iga-hrp来检测人血清或血浆中新型冠状病毒iga抗体从而检测新型冠状病毒感染，检测灵敏度高，特异性好。通过对部分临床已确诊为新型冠状病毒感染阳性(但pcr核酸检测阴性的)患者血样进行复检，该试剂盒能检出相当部分(iga)阳性，提示可与核酸检测形成互补。通过对部分临床已确诊为新型冠状病毒感染阳性的患者血样进行复检，发现本发明实施例中提供的新型冠状病毒iga抗体检测试剂盒，灵敏度明显高于新型冠状病毒igm抗体检测试剂盒，特异性明显好于新型冠状病毒igg抗体检测试剂盒。
常用的抗体检测一般为igg和igm两种，但是，冠状病毒的核蛋白(n端)在冠状病毒家族中高度保守，2019-ncov和其它冠状病毒n蛋白之间存在交叉反应，即针对2019-ncovn蛋白的igg抗体与针对其他冠状病毒n蛋白的igg抗体有相似的结构，而igg抗体具有长期存在的特性，因此igg抗体检测容易出现假阳性；igm抗体检测的窗口期短，所以不容易被检测到，容易漏检；而核酸检测的阳性检出率仅为40％-50％。此时iga的检测就正好弥补了核酸检测、igg检测和igm检测的缺点，所以iga检测在新型冠状病毒感染患者中更加有意义。
(2)本发明实施例中提供的新型冠状病毒检测试剂盒，新型冠状病毒n蛋白为核蛋白，是病毒体含量最丰富的结构蛋白，其刺激机体产生抗体应答能力强，使用此蛋白抗原用于生产灵敏度高。新型冠状病毒s蛋白主要的跨膜糖蛋白，在受体结合和病毒入胞过程中发挥关键作用，其结构中拥有受体结合区域(receptor-bindingregion，rbd)，使用此蛋白作为抗原，特异性好。n蛋白或n蛋白的片段或s蛋白或s蛋白的片段均可在本发明的新型冠状病毒检测试剂盒中作为抗原使用。
(3)本发明实施例中提供的新型冠状病毒检测试剂盒，进一步将新型冠状病毒的n蛋白和s蛋白片段共同作为抗原，联合使用可以在不影响特异性的基础上，提高相关产品的灵敏度。
此外，本发明对n蛋白和s蛋白片段联用时二者的比例和浓度作了进一步选择，作为抗原的n蛋白用量太大时，可能与其它冠状病毒产生交叉出现假阳性；而降低n蛋白的使用浓度时，有漏检的可能性。在本发明提供的比例和使用浓度内，可充分发挥n蛋白和s蛋白各自的作用，进一步提高试剂盒的检测灵敏度和特异性。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
1.下述实施例和对比例中，除特别说明的，所述原料均为市售商品；其中，
辣根过氧化物酶标记的鼠抗人iga抗体(iga-hrp)购自武汉奥科博泰生物科技有限公司，型号为a0051e；
辣根过氧化物酶标记的鼠抗人igg抗体(igg-hrp)购自珠海启尼亚生物技术有限公司；
辣根过氧化物酶标记的鼠抗人igm抗体(igm-hrp)购自杭州隆基生物技术有限公司，型号为ms00704e；
磁微粒购自jsrcorporation，型号为ms160/carboxyi，粒径为1.5μm。
可以直接商购hrp标记的鼠单体，也可以商购抗体后自行标记hrp。本发明中辣根过氧化物酶标记的鼠单抗的制备方法为本领域通用方法，具体如下：
取4mghrp，加入1ml水，0.2ml高碘酸钠，避光搅拌30min；加入80μl乙二醇，避光搅拌30min；加入8mg鼠单抗(鼠抗人igm抗体或鼠抗人igg抗体或鼠抗人iga抗体)，混匀后使用50mm的碳酸盐缓冲液透析，4℃避光透析24h；加入硼氢化钠1mg，混匀后静置6h，加入丙三醇2ml，即得；-20℃储存备用。
2.下述实施例和对比例中，所用的新型冠状病毒s蛋白片段的氨基酸序列如seqidno.3所示；所用的新型冠状病毒n蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示；
二者通过下述方法制得：
(1)2019-ncovs蛋白(刺突蛋白，spikeprotein)的氨基酸序列信息来自于genebank(qhd43416.1)，本发明选取s蛋白的340-650区域进行表达纯化，其氨基酸序列如seqidno.3所示。针对大肠杆菌表达偏好密码子对此区域(340-650)进行密码子优化，得到编码该区域的基因序列，如seqidno.4所示；按照pet28b载体的多克隆位点序列信息，在基因序列两端分别添加ncoi和xhoi酶切位点；全基因合成后，亚克隆到pet28a表达载体中。
将测序验证正确的表达质粒转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，挑取单菌落进行培养，0.6mmiptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)于32℃诱导表达4h；蛋白包涵体表达后，8m尿素溶解，利用镍柱亲和层析介质以及deae离子交换介质对目的蛋白进行纯化；采用梯度浓度尿素溶液对目的蛋白进行复性，最终保存于pbs溶液中。
(2)2019-ncovn蛋白(核蛋白，nucleoprotein)的氨基酸序列信息来自于genebank(qhd43423.2)，本发明选取全长n蛋白进行表达纯化，其氨基酸序列如seqidno.1所示。针对大肠杆菌表达偏好密码子对n蛋白氨基酸序列进行密码子优化，得到编码n蛋白的基因序列，如seqidno.2所示；按照pet28b载体的多克隆位点序列信息，在基因序列两端分别添加ncoi和xhoi酶切位点；全基因合成后，亚克隆到pet28a表达载体中。
将测序验证正确的表达质粒转化bl21(de3)感受态细胞中，挑取单菌落进行培养，利用0.6mmiptg于32℃诱导表达4h。蛋白以可溶性形式表达后，10mmtris-hcl(ph8.0)溶解，利用镍柱亲和层析介质以及deae离子交换介质对目的蛋白进行纯化；采用pbs溶液对目的蛋白进行透析后，最终保存于pbs溶液中。
3.下述实施例和对比例中，所用的校准品(160au/ml的抗新型冠状病毒抗体)为兔抗血清，通过下述方法制得：
(1)免疫动物的选择：兔，大耳白，2.5kg左右；
(2)新型冠状病毒抗原免疫用量：每只注射新型冠状病毒n蛋白0.7mg，新型冠状病毒s蛋白片段0.3mg；初次免疫用完全福氏佐剂乳化抗原，二次免疫和三次免疫用不完全福氏佐剂乳化；
(3)抗原免疫方法：背部皮下多点注射；
(4)免疫间隔：初免与二免间隔2周，二免和三免间隔3周；二免后7天检测效价；
(5)效价检测方法：取兔子耳血，用pbs稀释不同的浓度进行检测(1000倍、2000倍、4000倍、8000倍、16000倍、32000倍、64000倍)；使用新型冠状病毒抗原(新型冠状病毒n蛋白0.7mg/l，新型冠状病毒s蛋白0.3mg/l)包被酶标板(0.1μg/孔)，加入稀释后的兔抗血清，37℃反应30min后，洗板，加入羊抗鼠igg-hrp(羊抗鼠igg购自武汉雁达生物技术有限公司，货号为a011e；羊抗鼠igg-hrp采用本领域通用方法制得)，37℃反应30min后，洗板，加入tmb显色，最后使用酶标仪读取a450-a630的吸光度a值；兔抗血清8000倍稀释后检测a值大于1.8即为合格；
(6)抗新型冠状病毒抗体血清的分离：颈动脉放血；血液放置室温中凝固1h，然后置4℃过夜；在4℃条件下12000rpm离心20min，取上清液分装；
(7)160au/ml的校准品的制备：
先用牛血清稀释抗新型冠状病毒兔抗血清，稀释1000倍、2000倍、4000倍、8000倍、16000倍、32000倍、64000倍、128000倍、256000倍、512000倍；
使用实施例1提供的新型冠状病毒检测试剂盒检测稀释后的兔抗血清与牛血清，得到的兔抗血清的检测浓度接近牛血清的检测浓度时，则将该兔抗血清的抗新型冠状病毒抗体浓度定为0au/ml；例如，稀释256000倍的兔抗血清的抗新型冠状病毒抗体浓度是0au/ml时，此浓缩的上一个浓度(稀释128000倍)时兔抗血清的抗新型冠状病毒抗体浓度就定为5au/ml，稀释64000倍的兔抗血清的抗新型冠状病毒抗体的浓度就定为10au/ml，稀释32000倍的兔抗血清的抗新型冠状病毒抗体的浓度就定为20au/ml，稀释16000倍的兔抗血清的抗新型冠状病毒抗体的浓度就定为40au/ml，稀释8000倍的兔抗血清的抗新型冠状病毒抗体的浓度就定为80au/ml，稀释4000倍的兔抗血清的抗新型冠状病毒抗体浓度就定为160au/ml；
以5-160au/ml的兔抗血清为校准品，使用实施例1提供的新型冠状病毒检测试剂盒检测阳性质控血清(确诊患者的血清)10例，阴性质控血清(正常人血清)10例，如均检测准确则符合要求；
如果符合要求，将此批号的兔抗血清稀释4000倍，即可得到抗新型冠状病毒抗体浓度为160au/ml的校准品。
实施例1
1.一种新型冠状病毒检测试剂盒，所述新型冠状病毒检测试剂盒包括：
发光底物液a、发光底物液b、标本稀释液、酶标工作液、校准品和磁珠悬浮液；
其中，发光底物液a包括下述终浓度的组分：tris0.02g/l，盐酸0.006ml/l，鲁米诺0.003g/l；
发光底物液b包括下述终浓度的组分：磷酸二氢钠0.2g/l，磷酸氢二钠2.9g/l，过氧化脲0.01g/l，氯化钠9g/l；
标本稀释液包括下述终浓度的组分：bsa(牛血清白蛋白)10g/l，氯化钠9g/l，proclin3000.5ml/l；
酶标工作液包括下述终浓度的组分：辣根过氧化物酶标记的鼠抗人iga抗体(iga-hrp)1mg/l，磷酸二氢钠0.2g/l，磷酸氢二钠2.9g/l，氨基比林1g/l，proclin3000.5ml/l，casein(酪蛋白)2.5g/l；
校准品包括下述终浓度的组分：抗新型冠状病毒抗体160au/ml；
磁珠悬浮液包括下述终浓度的组分：偶联有新型冠状病毒抗原的磁微粒1g/l，其中，1g磁微粒上偶联有7mg的新型冠状病毒n蛋白和3mg的新型冠状病毒s蛋白片段。
2.上述新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法，所述制备方法包括下述步骤：
发光底物液a的制备方法包括下述步骤：称取各组分，分别溶于蒸馏水中，定容，即得；发光底物液b的制备方法包括下述步骤：称取各组分，分别溶于蒸馏水中，定容，即得；标本稀释液的制备方法包括下述步骤：称取各组分，分别溶于蒸馏水中，定容，即得；酶标工作液的制备方法包括下述步骤：称取各组分，分别溶于蒸馏水中，定容，即得；校准品的制备方法见上述；
磁珠悬浮液的制备方法包括下述步骤：
称取1g磁微粒加入10ml25mm的mes缓冲液清洗磁微粒1次，磁分离弃上清；加入10ml水和100mgedc，混悬活化30min，磁分离弃上清；加入10ml25mm的mes缓冲液，新型冠状病毒抗原n蛋白7mg和新型冠状病毒抗原s蛋白片段3mg，混匀，然后放置于4℃混悬过夜(16-20小时)；加入10ml25mm的mes缓冲液清洗磁微粒1次，磁分离弃上清；加入保存液(磷酸二氢钠0.2g/l，磷酸氢二钠2.9g/l，氨基比林1g/l，proclin3001ml/l，casein(酪蛋白)2.5g/l)，定容，即得。
实施例2
1.一种新型冠状病毒检测试剂盒，所述新型冠状病毒检测试剂盒包括：发光底物液a、发光底物液b、标本稀释液、酶标工作液、校准品同实施例1；
其中，磁珠悬浮液包括下述终浓度的组分：偶联有新型冠状病毒抗原的磁微粒1g/l，其中，1g磁微粒上偶联有7mg的新型冠状病毒n蛋白。
2.上述新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法参照实施例1。
实施例3
1.一种新型冠状病毒检测试剂盒，所述新型冠状病毒检测试剂盒包括：发光底物液a、发光底物液b、标本稀释液、酶标工作液、校准品同实施例1；
其中，磁珠悬浮液包括下述终浓度的组分：偶联有新型冠状病毒抗原的磁微粒1g/l，其中，1g磁微粒上偶联有3mg的新型冠状病毒s蛋白片段。
2.上述新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法参照实施例1。
实施例4
1.一种新型冠状病毒检测试剂盒，所述新型冠状病毒检测试剂盒包括：发光底物液a、发光底物液b、标本稀释液、酶标工作液、校准品和磁珠悬浮液；
其中，发光底物液a包括下述终浓度的组分：tris0.01g/l，盐酸0.004ml/l，鲁米诺0.001g/l；
发光底物液b包括下述终浓度的组分：磷酸二氢钠0.1g/l，磷酸氢二钠2.0g/l，过氧化脲0.005g/l，氯化钠5g/l；
标本稀释液包括下述终浓度的组分：bsa(牛血清白蛋白)8g/l，氯化钠5g/l，proclin3000.2ml/l；
酶标工作液包括下述终浓度的组分：辣根过氧化物酶标记的鼠抗人iga抗体(iga-hrp)0.7mg/l，磷酸二氢钠0.1g/l，磷酸氢二钠2.0g/l，氨基比林0.5g/l，proclin3000.2ml/l，casein(酪蛋白)1.5g/l；
校准品包括下述终浓度的组分：抗新型冠状病毒抗体160au/ml；
磁珠悬浮液包括下述终浓度的组分：偶联有新型冠状病毒抗原的磁微粒0.5g/l，其中，1g磁微粒上偶联有5mg的新型冠状病毒n蛋白和6mg的新型冠状病毒s蛋白片段。
2.上述新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法参照实施例1。
实施例5
1.一种新型冠状病毒检测试剂盒，所述新型冠状病毒检测试剂盒包括：发光底物液a、发光底物液b、标本稀释液、酶标工作液、校准品和磁珠悬浮液；
其中，发光底物液a包括下述终浓度的组分：tris0.05g/l，盐酸0.01ml/l，鲁米诺0.007g/l；
发光底物液b包括下述终浓度的组分：磷酸二氢钠0.5g/l，磷酸氢二钠3.0g/l，过氧化脲0.05g/l，氯化钠10g/l；
标本稀释液包括下述终浓度的组分：bsa(牛血清白蛋白)12g/l，氯化钠12g/l，proclin3000.8ml/l；
酶标工作液包括下述终浓度的组分：辣根过氧化物酶标记的鼠抗人iga抗体(iga-hrp)1.5mg/l，磷酸二氢钠0.4g/l，磷酸氢二钠3.0g/l，氨基比林1.5g/l，proclin3001.0ml/l，casein(酪蛋白)2.5g/l；
校准品包括下述终浓度的组分：抗新型冠状病毒抗体160au/ml；
磁珠悬浮液包括下述终浓度的组分：偶联有新型冠状病毒抗原的磁微粒1.5g/l，其中，1g磁微粒上偶联有9mg的新型冠状病毒n蛋白和1mg的新型冠状病毒s蛋白片段。
2.上述新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法参照实施例1。
对比例1
1.一种新型冠状病毒igg抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括：发光底物液a、发光底物液b、标本稀释液、酶标工作液、校准品和磁珠悬浮液；
其中，发光底物液a、发光底物液b、标本稀释液、校准品、磁珠悬浮液同实施例1；
酶标工作液包括下述终浓度的组分：辣根过氧化物酶标记的鼠抗人igg抗体(igg-hrp)1mg/l，磷酸二氢钠0.2g/l，磷酸氢二钠2.9g/l，氨基比林1g/l，proclin3000.5ml/l，casein(酪蛋白)2.5g/l。
2.上述新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法参照实施例1。
对比例2
1.一种新型冠状病毒igm抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括：发光底物液a、发光底物液b、标本稀释液、酶标工作液、校准品和磁珠悬浮液；
其中，发光底物液a、发光底物液b、标本稀释液、校准品、磁珠悬浮液同实施例1；
酶标工作液包括下述终浓度的组分：辣根过氧化物酶标记的鼠抗人igm抗体(igm-hrp)1mg/l，磷酸二氢钠0.2g/l，磷酸氢二钠2.9g/l，氨基比林1g/l，proclin3000.5ml/l，casein(酪蛋白)2.5g/l。
2.上述新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法参照实施例1。
试验例1
利用中航赛维生物生产的vi-200全自动化学发光仪对实施例1提供的新型冠状病毒检测试剂盒进行检测验证，程序及参数如下：
1.在反应杯中分别加入样品稀释液100μl/孔；每孔分别加入校准品(将160au/ml的校准品稀释为160、80、40、20、10、5au/ml六个梯度)或样本10μl；
2.每孔分别加入磁微粒悬浮液20μl；
3.混匀后37±0.5℃温育15min；
4.磁分离去上清；
5.加300μl清洗液至检测管中，混匀；
6.磁分离去上清；
7.重复步骤5、6，三遍；
8.每孔分别加入酶标工作液100μl；
9.混匀后37±0.5℃温育15min；
10.磁分离去上清；
11.重复步骤5、6，三遍；
12.每孔加入发光底物a液和发光底物b液各50μl；
13.混匀后1-5min检测发光强度，输出检测结果；
14.手工结果计算方式：应用microsoftofficeexcel，以校准品浓度值的log值作为x轴，以校准品发光强度rlu值的log值为y轴建立定标曲线，得到曲线方程y＝m(x)+c及其线性相关系数r2；将所读样品rlu值的对数(y)代入上述曲线方程，求得对应的x值，再求反对数后，即为所测样品中新型冠状病毒抗体的浓度。
通过对部分临床已确诊为新型冠状病毒感染阳性，但pcr核酸检测为阴性的患者血样进行复检，该试剂盒能检出相当部分(iga)阳性，提示可与核酸检测形成互补。
实验数据如下表1所示：
表1
测定p1-p10时的发光值大于8au/ml时判断为阳性，通过实验测定结果可以看到实施例1提供的新型冠状病毒检测试剂盒能检出相当部分(iga)阳性，提示可与核酸检测形成互补。
试验例2
用实施例1-3生产的新型冠状病毒检测试剂盒同时检测新型冠状病毒感染患者的血清p1-p20，检测流程与试验例1相同。检测结果如表2所示：
表2
测定p1-p20时的发光值大于8au/ml时判断为阳性。通过实验测定结果，可以看到实施例1的新型冠状病毒检测试剂盒能检出16/20的阳性；实施例2的新型冠状病毒检测试剂盒能检出14/20的阳性；实施例3的新型冠状病毒检测试剂盒能检出15/20的阳性。上述结果说明，n蛋白和s蛋白片段分别均可作为抗原应用于本发明的新型冠状病毒iga抗体检测试剂盒中；n蛋白和s蛋白片段联用作为抗原的实施例1的阳性检出率高于单独使用n蛋白作为抗原的实施例2和单独使用s蛋白片段作为抗原的实施例3。
试验例3
用实施例1提供的新型冠状病毒检测试剂盒与对比例1提供的新型冠状病毒igg抗体检测试剂盒同时检测新冠状病毒感染阴性患者血清n1-n10，检测流程与试验例1相同。检测结果如表3所示：
表3
测定n1-n10时的发光值小于8au/ml时判断为阴性。通过实验测定结果，可以看到实施例1的新型冠状病毒检测试剂盒能检出10/10的阴性；对比例1的新型冠状病毒igg抗体检测试剂盒能检出8/10的阴性。对比例1出现了2份假阳性结果，说明对比例1的特异性不如实施例1。
试验例4
用实施例1生产的新型冠状病毒检测试剂盒与对比例2生产的新型冠状病毒igm抗体检测试剂盒同时检测新冠状病毒感染患者血清p1-p10，检测流程与试验例1相同。检测结果如表4所示：
表4
测定p1-p10时的发光值大于8au/ml时判断为阳性。通过实验测定结果，可以看到实施例1新型冠状病毒检测试剂盒能检出7/10的阳性；对比例2新型冠状病毒igm抗体检测试剂盒能检出5/10的阳性；虽然都提示可与核酸检测形成互补，但是可以看到实施例1的灵敏度和阳性检出率都高于对比例2。
本发明实施例中提供的新型冠状病毒检测试剂盒首次在酶标工作液中加入了iga-hrp；常用的抗体检测一般为igg和igm，因为冠状病毒的核蛋白(n端)在冠状病毒家族中高度保守，2019-ncov和其它冠状病毒n蛋白之间存在交叉反应，igg抗体具有长期存在的特性，所以igg检测容易出现假阳性；igm检测因为窗口期短，所以不容易被检测到，容易漏检；核酸检测的阳性检出率不能达到100％；此时iga的检测就正好弥补了核酸检测、igg检测和igm检测的缺点，所以iga检测在新型冠状病毒感染患者中更加有意义。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
sequencelisting
<110>北京贝尔生物工程股份有限公司
<120>一种新型冠状病毒检测试剂盒及其制备方法
<130>200060f
<160>4
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>419
<212>prt
<213>2019-ncov
<400>1
metseraspasnglyproglnasnglnargasnalaproargilethr
151015
pheglyglyproseraspserthrglyserasnglnasnglygluarg
202530
serglyalaargserlysglnargargproglnglyleuproasnasn
354045
thralasertrpphethralaleuthrglnhisglylysgluaspleu
505560
lyspheproargglyglnglyvalproileasnthrasnserserpro
65707580
aspaspglnileglytyrtyrargargalathrargargilearggly
859095
glyaspglylysmetlysaspleuserproargtrptyrphetyrtyr
100105110
leuglythrglyproglualaglyleuprotyrglyalaasnlysasp
115120125
glyileiletrpvalalathrgluglyalaleuasnthrprolysasp
130135140
hisileglythrargasnproalaasnasnalaalailevalleugln
145150155160
leuproglnglythrthrleuprolysglyphetyralagluglyser
165170175
argglyglyserglnalaserserargserserserargserargasn
180185190
serserargasnserthrproglyserserargglythrserproala
195200205
argmetalaglyasnglyglyaspalaalaleualaleuleuleuleu
210215220
aspargleuasnglnleugluserlysmetserglylysglyglngln
225230235240
glnglnglyglnthrvalthrlyslysseralaalaglualaserlys
245250255
lysproargglnlysargthralathrlysalatyrasnvalthrgln
260265270
alapheglyargargglyprogluglnthrglnglyasnpheglyasp
275280285
glngluleuileargglnglythrasptyrlyshistrpproglnile
290295300
alaglnphealaproseralaseralaphepheglymetserargile
305310315320
glymetgluvalthrproserglythrtrpleuthrtyrthrglyala
325330335
ilelysleuaspasplysaspproasnphelysaspglnvalileleu
340345350
leuasnlyshisileaspalatyrlysthrpheproprothrglupro
355360365
lyslysasplyslyslyslysalaaspgluthrglnalaleuprogln
370375380
argglnlyslysglnglnthrvalthrleuleuproalaalaaspleu
385390395400
aspasppheserlysglnleuglnglnsermetserseralaaspser
405410415
thrglnala
<210>2
<211>1257
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
atgtctgacaacggtccgcagaaccagcgtaacgctccgcgtatcaccttcggtggtccg60
tctgactctaccggttctaaccagaacggtgaacgttctggtgctcgttctaaacagcgt120
cgtccgcagggtctgccgaataacaccgcttcttggttcaccgctctgacccagcacggt180
aaagaagacctgaaatttccgcgtggtcagggtgttccgatcaacaccaactcttctccg240
gatgaccagatcggttactaccgtcgcgctactcgtcgcatccgtggtggtgacggtaaa300
atgaaagacctgtctccgcgttggtacttctactatctgggtaccggtccggaagctggt360
ctgccgtacggtgctaacaaagacggtatcatctgggttgctaccgaaggtgctctgaac420
actccgaaagaccacatcggtacccgtaatccggctaataacgctgctatcgttctgcag480
ctgccgcagggtaccactctgccgaaaggtttctacgctgaaggttctcgtggtggttct540
caggctagctctcgtagctctagccgttctcgtaactctagccgtaactctactccgggt600
agctctcgtggtacctctccggctcgtatggctggtaacggtggtgacgcagctctggct660
ctgttactgttagaccgtctgaaccagctggaatctaagatgtctggtaaaggtcagcaa720
cagcaaggtcagaccgttaccaagaaatctgcagctgaagcttctaagaaaccgcgtcag780
aaacgtaccgctaccaaagcttacaacgttacccaggctttcggtcgtcgtggtccggaa840
cagacccagggtaacttcggtgaccaggaactgatccgtcagggtaccgactacaaacac900
tggccgcagatcgctcagttcgctccgtctgcttctgctttcttcggtatgtctcgtatc960
ggtatggaagttactccgtctggtacctggctgacctacaccggtgctatcaaactggac1020
gacaaagacccgaacttcaaagaccaggttatcctgctgaacaaacacatcgacgcttac1080
aagaccttcccgccgaccgaaccgaagaaagacaagaagaagaaagctgacgaaacccag1140
gctctgccgcagcgtcagaagaaacagcagaccgttaccctgctgccggctgctgacctg1200
gatgacttctctaaacagctgcagcagtctatgtcttctgctgactctacccaggct1257
<210>3
<211>312
<212>prt
<213>2019-ncov
<400>3
metgluvalpheasnalathrargphealaservaltyralatrpasn
151015
arglysargileserasncysvalalaasptyrservalleutyrasn
202530
seralaserpheserthrphelyscystyrglyvalserprothrlys
354045
leuasnaspleucysphethrasnvaltyralaaspserphevalile
505560
argglyaspgluvalargglnilealaproglyglnthrglylysile
65707580
alaasptyrasntyrlysleuproaspaspphethrglycysvalile
859095
alatrpasnserasnasnleuaspserlysvalglyglyasntyrasn
100105110
tyrleutyrargleuphearglysserasnleulysprophegluarg
115120125
aspileserthrgluiletyrglnalaglyserthrprocysasngly
130135140
valgluglypheasncystyrpheproleuglnsertyrglyphegln
145150155160
prothrasnglyvalglytyrglnprotyrargvalvalvalleuser
165170175
phegluleuleuhisalaproalathrvalcysglyprolyslysser
180185190
thrasnleuvallysasnlyscysvalasnpheasnpheasnglyleu
195200205
thrglythrglyvalleuthrgluserasnlyslyspheleuprophe
210215220
glnglnpheglyargaspilealaaspthrthraspalavalargasp
225230235240
proglnthrleugluileleuaspilethrprocysserpheglygly
245250255
valservalilethrproglythrasnthrserasnglnvalalaval
260265270
leutyrglnaspvalasncysthrgluvalprovalalailehisala
275280285
aspglnleuthrprothrtrpargvaltyrserthrglyserasnval
290295300
pheglnthrargalaglycysleu
305310
<210>4
<211>936
<212>dna
<213>人工序列(artificial)
<400>4
atggaagtgttcaacgctactcgtttcgcttctgtttacgcttggaaccgtaaacgtatc60
tctaactgcgttgctgactactctgttctgtacaactctgcttctttctctaccttcaaa120
tgctacggtgtttctccgactaaactgaacgacctgtgcttcactaacgtttacgctgac180
tctttcgttatccgtggtgacgaagttcgtcagatcgctccgggtcagactggtaaaatc240
gctgactacaactacaaactgccggacgacttcactggttgcgttatcgcttggaactct300
aacaacctggactctaaagttggtggtaactacaactacctgtaccgtctgttccgtaaa360
tctaacctgaaaccgttcgaacgtgacatctctactgaaatctaccaggctggttctact420
ccgtgcaacggtgttgaaggtttcaactgctacttcccgctgcagtcttacggtttccag480
ccgactaacggtgttggttaccagccgtaccgtgttgtggttctgtctttcgaactgctg540
cacgctccggctactgtttgcggtccgaagaaatctactaacctggttaagaacaaatgc600
gttaacttcaacttcaacggtctgactggtactggtgttctgactgaatctaacaagaaa660
ttcctgccgttccagcagttcggtcgtgacatcgctgacaccactgacgctgttcgtgac720
ccgcagactctggaaatcctggacatcactccgtgctctttcggtggtgtttctgttatc780
actccgggtactaacacctctaaccaggttgctgttctgtaccaggacgttaactgcact840
gaagttccggttgctatccacgctgaccagctgactccgacctggcgtgtttactctact900
ggttctaacgtgttccagactcgtgctggttgcctc936