生物体液中代谢物分析用内标液及其应用的制作方法

本发明涉及生物样品分析领域，具体涉及一种生物体液中代谢物分析用内标液及其应用。

背景技术：

近年来，已知生物体内的代谢物不仅受遗传因素的影响，还大大受到环境因素的影响，这些代谢物的分析与基因、蛋白质的分析同样地被作为疾病诊断和健康状态的指标而受到关注。其中，生物体液中代谢物是代谢组之一，自古以来就对其进行定量分析，并且开发出各种各样的分析方法。

目前常用质谱、色谱或核磁的方法对生物体液中代谢物进行定性、定量分析。其中，核磁共振技术是当前代谢组学研究中不可或缺的主要技术，其优势在于能够对样品实现无创性、无偏向的检测，具有良好的客观性和重现性，并且样品处理简单。但由于生物体液中存在大量的蛋白，蛋白与加入的内标物质结合会导致生物体液中小分子内源代谢物的含量的检测受到干扰，并且常用的内标存在着易挥发的问题使得生物体液的核磁共振检测存在着极大的不稳定性。为此，核磁代谢组学中常用的定量方法有两种：一种是不使用内标时，采用归一积分法即binning法，该方法存在着极大的不准确性，只能用于初步提醒是否存在代谢异常；另一种是使用内标，将tsp等常用内标加入到内插管中使内标与样品隔离进行检测，该方法费时费力同时也增加了测样的成本。

因此，现有的生物体液中代谢物的定量方法有待改进。

技术实现要素：

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种生物体液中代谢物分析用内标液。该内标液具有非内源性且不与待测物中蛋白结合，同时其nmr信号峰不与体内代谢产物的信号峰重叠，能够与生物体液直接混合进行核磁共振检测进行定量定性。

为此，在本发明的一方面，本发明提出了一种生物体液中代谢物分析用内标液，其包含对苯醌。

根据本发明实施例的生物体液中代谢物分析用内标液，其采用高纯度对苯醌作为内标，其氢谱简单、不易挥发，性质稳定，谱峰简单为一个尖锐的单峰，具有非内源性且不与待测物中蛋白结合，同时其nmr信号峰不与体内代谢产物的信号峰重叠，能够与生物体液直接混合进行核磁共振检测进行定量。

另外，根据本发明上述实施例提出的一种生物体液中代谢物分析用内标液，还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述内标液为利用氘代溶剂配制的对苯醌溶液。

根据本发明的实施例，所述内标液为利用重水配制的对苯醌溶液。

根据本发明的实施例，所述内标液的配制为：1mg对苯醌用1ml氘代水进行溶解，即得所述内标液。

在本发明的另一个方面，本发明还提出了一种生物体液中代谢物的定量方法，该方法使用上述的内标液。

根据本发明的生物体液中代谢物的定量方法，通过内标液能够简便快捷的添加到待测物中后直接进行核磁共振测试，使得生物体液中代谢物的定量方法简便且高精度。

根据本发明的实施例，所述方法利用核磁共振仪进行测定。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为对苯醌在氘水中的氢核磁共振谱图；

图2为对苯醌在全血中的氢核磁共振谱图；

图3为对苯醌在血浆中的氢核磁共振谱图；

图4为对苯醌在血清中的氢核磁共振谱图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

实施例1

生物体液中代谢物的定量方法：

(1)内标液的配制：取1mg对苯醌用1ml氘代水进行溶解，得到内标液，备用。

(2)将上述内标液置于核磁管中，加封口膜密封，进行核磁共振氢谱测试，核磁共振氢谱测试条件为：核磁谱仪共振频率为600mhz，温度为25℃，延迟时间为2s，脉冲角度为90°，采样次数为96。得到图1所示的氢核磁共振谱图，可知，对苯醌的化学位移为6.69ppm。

(3)取100μl小鼠全血，加入200μl重水，3000rmp离心10min后，得到全血待测液。取100μl第一待测液，加入200μl氘代水和300μl上述配制的内标液混合，置于核磁管中，加封口膜密封，进行核磁共振氢谱测试，核磁测试条件与步骤(2)保持一致。得到图2所示的氢核磁共振谱图。

将内标对苯醌的化学位移定为6.69ppm，根据查阅文献指认确定化学位移为4.14ppm处峰为乳酸。

按1hnmr内标法，根据以下公式计算乳酸含量；

cl＝(al·vi·ni·ci)/(ai·vl·nl)；

其中，nl为被测样定量峰包含的质子数，ni为内标定量峰包含的质子数，al为被测样定量峰的积分面积，ai为内标定量峰的积分面积，cl为被测样浓度(mmol/l)，ci为内标浓度(mmol/l)，vi为内标加入的体积(μl)，vl为被测样加入的体积(μl)；

全血中乳酸含量为：cl＝(0.98*300*108*10)/(1*100*90)＝35mmol/l。

(4)取小鼠全血用0.1m的草酸钠作为抗凝剂，抗凝剂和血液1:9的比例抗凝，3000rmp离心10min，得到血浆待测液。取100ul血浆待测液，加入200ul氘代水和300ul上述配制的内标液混合，置于核磁管中，加封口膜密封，进行核磁共振氢谱测试，核磁测试条件与步骤(2)保持一致。得到图3所示的氢核磁共振谱图。

根据内标的化学位移定标，请补充这边代谢物确认是乳酸的说明；

按1hnmr内标法，根据以下公式计算乳酸含量；

cl＝(al·vi·ni·ci)/(ai·vl·nl)；

其中，nl为被测样定量峰包含的质子数，ni为内标定量峰包含的质子数，al为被测样定量峰的积分面积，ai为内标定量峰的积分面积，cl为被测样浓度(mmol/l)，ci为内标浓度(mmol/l)，vi为内标加入的体积(μl)，vl为被测样加入的体积(μl)；

血浆中乳酸含量为：cl＝(2.28*300*108*10)/(1*100*90)＝82mmol/l。

(5)取待测物全血室温放置1h，3000rmp离心10min，得到血清待测液。取100ul血清待测液加入200ul氘代水和300ul上述配制的内标液混合，置于核磁管中，加封口膜密封，进行核磁共振氢谱测试，核磁测试条件与步骤(2)保持一致。得到图4所示的氢核磁共振谱图。

根据内标的化学位移定标，请补充这边代谢物确认是乳酸的说明；

按1hnmr内标法，根据以下公式计算乳酸含量；

cl＝(al·vi·ni·ci)/(ai·vl·nl)；

其中，nl为被测样定量峰包含的质子数，ni为内标定量峰包含的质子数，al为被测样定量峰的积分面积，ai为内标定量峰的积分面积，cl为被测样浓度(mmol/l)，ci为内标浓度(mmol/l)，vi为内标加入的体积(μl)，vl为被测样加入的体积(μl)；

血清中乳酸含量为：cl＝(1.14*300*108*10)/(1*100*90)＝41mmol/l。

综上，上述的内标液在全血、血浆和血清中均具有较好的稳定性。

实施例2

通常从两方面评价内标化合物与蛋白的结合程度，一方面是半峰宽的变化，另一方面是峰面积的变化。半峰宽变宽的程度越小和峰面积减少的程度越低，说明与蛋白的结合程度越小，也就表明该化合物越合适作为内标化合物进行定量分析。

具体而言，用半峰宽比(内标/β-葡萄糖)，峰面积比(内标/乳酸δ4.14)来评价蛋白结合程度，由于β-葡萄糖较α-葡萄糖的耦合常数更大，谱锋裂分更清晰，所以以β-葡萄糖δ4.64处谱锋作为半峰宽参考。乳酸虽然与蛋白相结合，但其游离与结合的量比为常数，且在δ4.14处的谱峰不存在和脂类谱锋重叠的干扰，因此以乳酸δ4.14处谱锋作为峰面积参考。

该内标在全血中的半峰宽比(内标/β-葡萄糖)为0.53,峰面积比为1.02。

该内标在血浆中的半峰宽比(内标/β-葡萄糖)为0.40,峰面积比为0.44。

该内标在血清中的半峰宽比(内标/β-葡萄糖)为0.42,峰面积比为0.88。

综上，本发明的实施例的生物体液中代谢物分析用内标液，其采用高纯度对苯醌作为内标，其氢谱简单、不易挥发，性质稳定，谱峰简单为一个尖锐的单峰，具有非内源性且不与待测物中蛋白结合，同时其nmr信号峰不与体内代谢产物的信号峰重叠，能够与生物体液直接混合进行核磁共振检测进行定量；并且通过该内标液能够简便快捷的添加到待测物中后直接进行核磁共振测试，使得生物体液中代谢物的定量方法简便且高精度。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。