苏木素染色液氧化程度的监控方法、苏木素染色液的质量控制方法与流程

本发明涉及一种苏木素染色液氧化程度的监控方法、苏木素染色液的质量控制方法，属于苏木素染色液
技术领域：
。
背景技术：
：苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining)，简称he染色法，是各个医院实验室最常用的染色方法，也是各病理科最经典的染色技术。he染色法的染色原理如下，细胞核内的染色质主要成份是去氧核糖核酸(简称dna)，dna的双螺旋结构中，两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键或氢键的方式结合而被染色，苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。苏木精染色后显现出的结果为：细胞核呈蓝色，软骨基质和钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。再利用胞浆染料伊红染胞浆，使胞浆的各种不同成分又呈现出深浅不同的粉红色。通过苏木精-伊红染色法染色后，各种组织或细胞成分与病变的一般形态结构特点均可显示出来。he染色法的核心是苏木素染液的配制，它是决定染色质量优劣的关键。苏木素染液的配方很多，其原理是一样的，都是先对苏木素进行氧化，氧化分子中一个羟基成为羰基，形成共轭π键，使氧化的苏木素具有的染色的能力；如果继续氧化则形成过氧化苏木素，剩余的羟基进一步被氧化共轭π键破坏，发色团被破坏，失去染色的能力。氧化苏木素在媒染剂的作用下，与细胞核染色质结合。常用的氧化苏木素的方法有两种：一是自然氧化，二是人工氧化。但这两种氧化方法都不易掌握氧化程度，如果氧化程度不够，着色慢且染色力较弱，如果过度氧化，易形成颗粒沉淀和表层金属氧化薄膜，影响染色效果和使用寿命，所使用的苏木素染色液的氧化程度将会影响染色得到的片子的质量，若无法确认苏木素染色液的氧化程度，将会导致染色出来的片子质量时好时坏。为了提高染色出来的片子的质量，就需要得到质量可控的含苏木素的染色液，目前，采取的策略主要有：一种策略是需要经常调整染色时间，去除金属氧化膜，另一种策略是需要配制新的he染色液；这两种方式都较为繁琐，影响工作效率。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种苏木素染色液氧化程度的监控方法，该苏木素染色液氧化程度的监控方法，缓解了现有技术无法确认苏木素染色液的氧化程度，而导致染色出来的片子质量时好时坏的情况。本发明的第二个目的在于提供一种苏木素染色液的质量控制方法。本发明的技术方案如下：一种苏木素染色液氧化程度的监控方法，包括以下步骤：(1)利用紫外分光光度计检测氧化前苏木素染色液的稀释液的od值，记为od0；(2)利用紫外分光光度计检测氧化后苏木素染色液的稀释液的od值，记为odt；(3)氧化前后，苏木素染色液的稀释液的od值规律变化，变化规律为：氧化程度越大，od值的数值越大；根据odt相对于od0的增加程度，监控苏木素染色液的氧化程度。本发明的苏木素染色液氧化程度的监控方法，能够根据odt相对于od0的增加程度，监控苏木素染色液的氧化程度，该监控方法操作简单，结果明了，较易实施。缓解了现有技术无法确认苏木素染色液的氧化程度，而导致染色出来的片子质量时好时坏的情况。应当理解的是，氧化前苏木素染色液指得是，没有经过氧化的苏木素染色液，既没有经过自然氧化，也未经过氧化剂氧化；氧化后苏木素染色液指的是经过氧化的苏木素染色液。应当理解的是，步骤(1)和步骤(2)所采用的稀释液中苏木素的浓度是一致的。本发明的苏木素染色液氧化程度的监控方法的原理为：苏木素染色液在未氧化前，其在紫外分光光度计检测下有其od值，但是经过氧化剂氧化后，氧化分子中一个羟基成为羰基，形成共轭π键，使氧化的苏木素具有的染色的能力，其紫外吸收od值增加，进而通过检测氧化后的od值来监控苏木素的的氧化程度。氧化后的苏木素再过媒介离子(如al3+或是fe3+)进而对细胞核进行染色。为了进一步提高监控精确度和准确度，优选地，所述紫外分光光度计的检测波长为562nm。紫外分光光度计的检测波长为562nm时，氧化前后的苏木素染色液的od值相差较为明显，有利于提高监控氧化程度的准确度和精确度。为稀释的苏木素染色液在氧化前后测得的od值相差较小，为了进一步提高监控精确度和准确度，优选地，所述苏木素染色液的稀释液是利用5％硫酸铝水溶液对苏木素染色液进行稀释得到的。5％硫酸铝水溶液对od值的影响较小，且以5％硫酸铝水溶液作为稀释剂对苏木素染色液进行稀释后，可大幅提高氧化前后的苏木素染色液的稀释液的od值的差。优选地，所述苏木素染色液的稀释液中苏木素的浓度为0.125mg/ml。苏木素染色液的稀释液中苏木素的浓度为0.125mg/ml时，氧化后的苏木素od值在2.5～3.5范围内时，氧化程度均合适，氧化前苏木素染色液仅为0.23，即氧化前后的苏木素的od值相差较大。对于苏木素染色液的具体种类不作限定，采用本领域常规的苏木素染色液即可，比如ehrlich苏木素染色液、harris苏木素染色液、cole苏木素染色液、mayer苏木素染色液、carazzi苏木素染色液、改良lillie-mayer苏木素染色液以及gill改良苏木素染色液。优选地，所述苏木素染色液主要由以下方法制备得到：将苏木素和硫酸铝溶于水中，然后加入碘酸钠进行氧化，分离除去固体，收集分离液，加入甘油，混匀即为苏木素染色液。优选地，所述苏木素与硫酸铝的质量比为1:10。所述苏木素与碘酸钠的质量比为10:1。氧化的温度为45℃。所述氧化的时间为2～5min。所述甘油在苏木素染色液中的体积分数为5％。一种苏木素染色液的质量控制方法，包括以下步骤：(1)采用上述苏木素染色液氧化程度的监控方法监控苏木素染色液的氧化程度，以od值评价苏木素染色液的氧化程度；结合苏木素染色液的染色效果，确定质量合格的od值，记为ods；所述od值是对苏木素染色液的稀释液检测得到的；(2)利用紫外分光光度计检测待检测苏木素染色液的稀释液的od值，记为odt，判断odt是否满足ods；如满足，则待检测苏木素染色液的质量合格。本发明的苏木素染色液的质量控制方法，只要确定了ods后，即可根据待测苏木素染色液的稀释液的od值，快速确定待检测苏木素染色液的质量是否合格，使苏木素氧化到合适的程度，使染片效果大大提高。该质量控制方法快速准确，易于推广使用。解决了现有苏木素染色液质量无法控制，而导致染色出来的片子质量时好时坏的情况。为了提高苏木素染色液的质量控制的准确度和精确度，优选地，所述紫外分光光度计的检测波长为562nm。为了提高苏木素染色液的质量控制的准确度和精确度，优选地，所述苏木素染色液的稀释液是利用5％硫酸铝水溶液对苏木素染色液进行稀释得到的。为了提高苏木素染色液的质量控制的准确度和精确度，优选地，所述苏木素染色液的稀释液中苏木素的浓度为0.125mg/ml。优选地，所述苏木素染色液主要由以下方法制备得到：将苏木素和硫酸铝溶于水中，然后加入碘酸钠进行氧化，分离除去固体，收集分离液，加入甘油，混匀即为苏木素染色液；利用5％硫酸铝水溶液对苏木素染色液进行稀释，稀释至苏木素的浓度为0.125mg/ml，形成苏木素染色液的稀释液；以562nm作为紫外分光光度计的检测波长；若待检测苏木素染色液的稀释液的od值为2.5～3.5，则苏木素染色液的质量合格；若待检测苏木素染色液的稀释液的od值小于2.5，则氧化程度不够，可通过继续氧化使得苏木素染色液的质量达到合格；若待检测苏木素染色液的稀释液的od值大于3.5，则过度氧化，苏木素染色液的质量不合格。应当理解的是，当氧化程度不够时，可通过继续氧化使得苏木素染色液达到较理想的od值，使得苏木素染色液的质量达到合格；对于氧化方式不作限定，可以采用本领域常规的氧化方式，比如加入氧化剂、增加氧化时间、增加氧化温度等。当苏木素氧化程度较高，过度氧化时，可直接弃之不用，有效防止染色出来的片子质量不好。附图说明图1为试验例2中he染色程序染色后的脾40倍镜图；图2为试验例3中od值为1.05、4.63、2.53时的染色效果图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。本发明的实施例中，所用的氧化前苏木素染色液的配置方法为：将与苏木素基础染色液相同的原料充分溶解，混合后得到。应当理解的是，为了避免氧化前的苏木素染色液氧化，应在氧化前的苏木素染色液配制完成后快速进行检测。本发明的实施例中，所用的苏木素染色液(100ml)基础配置方法：(1)称取苏木素0.5g，硫酸铝5g，放入烧杯中，加入90ml纯化水进行溶解，在水浴锅中进行加热促溶解。(2)当溶解完全同时溶液温度升高到45℃时，加入碘酸钠0.05g，保温2min，并不停搅拌，保证氧化充分。(3)自来水冷却至室温，用滤纸过滤。(4)添加甘油保护试剂5ml(体积分数约为5％)，混合均匀即可。本发明的实施例中，所用的氧化剂用量不同的苏木素染色液(100ml)配置方法：(1)称取苏木素0.5g，硫酸铝5g，放入烧杯中，加入90ml纯化水进行溶解，在水浴锅中进行加热促溶解；(2)当溶解完全同时溶液温度升高到45℃时，加入不同量碘酸钠(如表1所示)，保温2min，并不停搅拌，保证氧化充分；(3)自来水冷却至室温，用滤纸过滤；(4)添加甘油保护试剂5ml(体积分数约为5％)，混合均匀即可。表1氧化剂碘酸钠的用量12345氧化剂量0.001g0.025g0.05g0.10g0.20g本发明的实施例中，所用的氧化剂氧化不同时间的苏木素染色液(100ml)配置方法：(1)称取苏木素0.5g，硫酸铝5g，放入烧杯中，加入90ml纯化水进行溶解，在水浴锅中进行加热促溶解。(2)当溶解完全同时溶液温度升高到45℃时，加入碘酸钠0.05g，氧化不同时间(如表2所示)，并不停搅拌，保证氧化充分。(3)自来水冷却至室温，用滤纸过滤。(4)添加甘油保护试剂5ml(体积分数约为5％)，混合均匀即可。表2氧化的时间123456氧化时间30s2min5min20min40min60min本发明的实施例中，判断苏木素染色液染色效果采用的是he染色流程，可以是本领域常规的he染色流程，也可以是如试验例2的he染色流程。一、本发明的苏木素染色液氧化程度的监控方法的具体实施例如下：实施例1本实施例的苏木素染色液氧化程度的监控方法，本实施例以562nm作为紫外分光光度计的检测波长，对如表1所示的不同氧化剂用量对应的苏木素染色液的稀释液的od值进行检测，判断其氧化程度，检测所用的苏木素染色液的稀释液是利用5％硫酸铝水溶液对苏木素染色液进行稀释得到的，苏木素染色液的稀释液中苏木素的浓度为0.125mg/ml；步骤如下：(1)利用紫外分光光度计检测氧化前苏木素染色液的稀释液的od值，记为od0，od0＝0.23。(2)利用紫外分光光度计检测氧化后苏木素染色液的稀释液的od值，记为odt，如表3所示，不同氧化剂用量下的苏木素染色液的稀释液的od值依次为0.58、1.76、2.53、4.56、4.63。(3)氧化前后，苏木素染色液的稀释液的od值规律变化，变化规律为：氧化程度越大，od值的数值越大；根据odt相对于od0的增加程度，监控苏木素染色液的氧化程度。表3氧化剂碘酸钠的用量及对应的od值12345氧化剂量0.001g0.025g0.05g0.10g0.20godt0.581.762.534.564.63由表3可知，由序号1到序号5，odt相对于od0的增加程度变大，据本实施例的监控方法可得到：由序号1到序号5，苏木素染色液的氧化程度增加。这与氧化剂用量越多，氧化程度越大相符合，证明本实施例的苏木素染色液氧化程度的监控方法可行，可以准确判断出氧化程度的相对高低。实施例2本实施例的苏木素染色液氧化程度的监控方法，本实施例以562nm作为紫外分光光度计的检测波长，对如表2所示的不同氧化时间对应的苏木素染色液的稀释液的od值进行检测，判断其氧化程度，检测所用的苏木素染色液的稀释液是利用5％硫酸铝水溶液对苏木素染色液进行稀释得到的，苏木素染色液的稀释液中苏木素的浓度为0.125mg/ml；步骤如下：(1)利用紫外分光光度计检测氧化前苏木素染色液的稀释液的od值，记为od0，od0＝0.23。(2)利用紫外分光光度计检测氧化后苏木素染色液的稀释液的od值，记为odt，如表4所示，不同氧化时间的苏木素染色液的稀释液的od值依次为1.05、2.98、3.31、4.56、4.99、5.7。(3)氧化前后，苏木素染色液的稀释液的od值规律变化，变化规律为：氧化程度越大，od值的数值越大；根据odt相对于od0的增加程度，监控苏木素染色液的氧化程度。表4氧化不同及对应的od值123456氧化时间30s2min5min20min40min60minodt1.052.983.314.564.995.7由表4可知，由序号1到序号6，odt相对于od0的增加程度变大，据本实施例的监控方法可得到：由序号1到序号6，苏木素染色液的氧化程度增加。这与氧化时间增长，氧化程度越大相符合，证明本实施例的苏木素染色液氧化程度的监控方法可行，可以准确判断出氧化程度的相对高低。实施例3本实施例的苏木素染色液氧化程度的监控方法，本实施例以562nm作为紫外分光光度计的检测波长，检测所用的苏木素染色液的稀释液是利用5％硫酸铝水溶液对苏木素染色液进行稀释得到的，苏木素染色液的稀释液中苏木素的浓度为0.125mg/ml；步骤如下：(1)利用紫外分光光度计检测氧化前苏木素染色液的稀释液的od值，记为od0。(2)利用紫外分光光度计检测氧化后苏木素染色液的稀释液的od值，记为odt。(3)氧化前后，苏木素染色液的稀释液的od值规律变化，变化规律为：氧化程度越大，od值的数值越大；根据odt相对于od0的增加程度，监控苏木素染色液的氧化程度。odt相对于od0的增加程度越大，苏木素染色液的氧化程度越高。可以根据两种待测苏木素染色液的稀释液的odt相对于od0的增加程度，判断这两种待测苏木素染色液的相对氧化程度，odt相对于od0的增加程度大的，氧化程度相对较大。二、本发明的本发明的苏木素染色液的质量控制方法的具体实施例如下：实施例4本实施例的苏木素染色液的质量控制方法，步骤如下：(1)采用实施例1的苏木素染色液氧化程度的监控方法监控苏木素染色液的氧化程度，以od值评价苏木素染色液的氧化程度；结合苏木素染色液的染色效果，当odt为2.53时，染色效果最好，确定质量合格的od值，记为ods(2.53)；所述od值是对苏木素染色液的稀释液检测得到的。(2)利用紫外分光光度计检测待检测苏木素染色液的稀释液的od值，记为odt，判断odt是否满足ods(2.53)；如满足，则待检测苏木素染色液的质量合格。实施例5本实施例的苏木素染色液的质量控制方法，步骤如下：(1)采用实施例2的苏木素染色液氧化程度的监控方法监控苏木素染色液的氧化程度，以od值评价苏木素染色液的氧化程度；结合苏木素染色液的染色效果，当odt为2.98和3.31时，染色效果最好，确定质量合格的od值，记为ods(2.98～3.31)；所述od值是对苏木素染色液的稀释液检测得到的。(2)利用紫外分光光度计检测待检测苏木素染色液的稀释液的od值，记为odt，判断odt是否满足ods(2.98～3.31)；如满足，则待检测苏木素染色液的质量合格。实施例6本实施例的苏木素染色液的质量控制方法，以562nm作为紫外分光光度计的检测波长，检测所用的苏木素染色液的稀释液是利用5％硫酸铝水溶液对苏木素染色液进行稀释得到的，苏木素染色液的稀释液中苏木素的浓度为0.125mg/ml；步骤如下：(1)采用实施例3的苏木素染色液氧化程度的监控方法监控苏木素染色液的氧化程度，以od值评价苏木素染色液的氧化程度；结合苏木素染色液的染色效果，当odt为1.00之上均有染色能力，当odt为2.5～3.5之间时，苏木素染色液的氧化程度比较合适，染色质量较高，且染片量较多，苏木素染色液也较易储存。(2)利用紫外分光光度计检测待检测苏木素染色液的稀释液的od值，记为odt，判断odt是否满足ods(2.5～3.5)；若待检测苏木素染色液的稀释液的od值为2.5～3.5，则苏木素染色液的质量合格；若待检测苏木素染色液的稀释液的od值小于2.5，则氧化程度不够，可通过继续氧化使得苏木素染色液的质量达到合格；若待检测苏木素染色液的稀释液的od值大于3.5，则过度氧化，苏木素染色液的质量不合格。三、相关试验例试验例1紫外分光光度计检测波长以苏木素染色液基础配置方法(氧化温度为45℃，氧化时间为2min)得到的苏木素染色液作为检测对象，得到合适的紫外分光光度计检测波长。苏木素染色液的基础配方组成如表5所示。表5苏木素染色液的基础配方组成苏木素染色液100ml苏木素0.5g硫酸铝5g碘酸钠0.05g甘油5ml苏木素染色液基础配置方法为：(1)称取苏木素0.5g，硫酸铝5g，放入烧杯中，加入90ml纯化水进行溶解，在水浴锅中进行加热促溶解。(2)当溶解完全同时溶液温度升高到45℃时，加入碘酸钠0.05g，保温2min，并不停搅拌，保证氧化充分。(3)自来水冷却至室温，用滤纸过滤。(4)添加甘油保护试剂5ml(体积分数约为5％)，混合均匀即可。从上述苏木素染色液中取样50μl，利用5％硫酸铝水溶液稀释到2ml，混匀后即为氧化后苏木素染色液的稀释液，对氧化后苏木素染色液的稀释液进行检测，得到的od值如表6所示。同时对苏木素中的各组分进行检测，即组分1为纯化水、组分2为5％(体积分数)硫酸铝水溶液、组分3为5％(体积分数)甘油水溶液、组分4为0.05％(体积分数)碘酸钠水溶液，直接从上述四种组分中各取2ml进行检测，得到的od值如表6所示。未氧化的苏木素溶液的原料如表5所示，配制完成后，在保持未氧化的情况下立即取样50μl，利用5％硫酸铝水溶液稀释到2ml，混匀后进行检测，即得未氧化的苏木素溶液的稀释液对应的od值。表6不同检测波长下的od值由表6可知，检测波长为562nm时，氧化后苏木素的od值相较于氧化前苏木素的od值的变化较明显，且检测波长为562nm时，其它成分(纯化水、硫酸铝和甘油)对od值的影响很小，水和硫酸铝对于562nm波长的紫外光完全无吸收，对检测结果完全无影响。而检测波长为433nm、540nm、595nm时，氧化前后，苏木素的od值的变化不明显，因此，紫外分光光度计的检测波长以562nm为优。试验例2he染色程序本发明苏木素染色液的质量控制方法中，判断苏木素染色液的染色效果是利用he染色程序的染色效果来判断的，按照如表7所示的he染色程序对脾进行染色，得到的染色后的脾40倍镜如图1所示，染色效果良好，染色质量较高。表7he染色程序苏木素染色液(500ml)的配制方法为：1)称取苏木素2.5g，放入烧杯中；(2)称取硫酸铝75g倒入配液锅中，加入400ml纯化水加热溶解；(3)当试剂溶解完全同时溶液温度升高到45℃时，加入碘酸钠0.25g，保温2min，并不停搅拌，保证氧化充分；(3)自来水冷却至室温；(4)用滤纸过滤；(7)添加甘油保护试剂25ml(体积分数约为5％)，混合均匀即可。分化液(500ml)的配制方法为：称取酒石酸20g，加入490ml纯化水，用搅拌器搅拌，使之充分溶解后，用5mnaoh溶液调节ph值至2.4～2.6。返蓝液(500ml)的配制方法为：称取tris碱7.5g和氯化钠5g倒入量杯/配液桶中，加入490ml纯化水，用搅拌器搅拌使充分溶解，加入proclin950试剂(液体生物防腐剂)，充分混匀调节溶液ph值至7.5～7.7。伊红染液(500ml)的配制方法为：称取5g水溶性伊红y，加入95％酒精250ml(约47.5％)和乙二醇150ml(30％)，搅拌使其充分溶解，调ph值4.5左右，加入100ml纯化水即可。试验例3为了对实施例6中提到的染色效果给出视觉上的判断，以od为2.5～3.5之间的2.53为典型例、以od小于2.5的1.05为典型例，以od小于3.5的4.63为典型例，采用试验例2的he染色程序，对实施例6中较为典型的od值(od值为1.05、4.63、2.53)对应的染色效果进行表征，得到的结果如图2所示。由图2可知，od为1.05～4.63时，均有染色能力，但是，很明显地，od为2.53时，染色质量较高，当od为1.05时，苏木素部分被氧化，染色能力较弱，使染色时间延长，染色太浅，染片量也下降。当od为4.63时，苏木素过度氧化，配制的苏木素因氧化过度易产生金属氧化膜，过度氧化的苏木素失去染色能力，染色质量下降，染片量也明显下降，且od为4.63对应的苏木素染色液放置时间不易过长，这将导致配制出的染色液必须在短时间内快速用完，稍有延迟就会导致染片质量下降，只能舍弃未使用完的染色液，造成浪费，提高了成本。当前第1页12