一种快速检测血浆中头孢克肟浓度的方法与流程

本发明涉及药物分析
技术领域：
，具体涉及一种快速检测血浆中头孢克肟浓度的方法。
背景技术：
：头孢克肟（cefixime）是可口服的第三代头孢菌素类抗生素,临床上应用于敏感菌引起的肺炎、支气管炎、泌尿道感染、淋病、胆囊炎、胆管炎、猩红热、中耳炎、副鼻窦炎等。目前，测定头孢克肟的常用方法主要有hplc法、化学发光法、紫外光谱法等；但这些方法均存在灵敏度低、专属性差以及操作繁琐费时等缺点。技术实现要素：针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种快速检测血浆中头孢克肟浓度的方法。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种快速检测血浆中头孢克肟浓度的方法，包括如下步骤：（1）血浆样品前处理：向血浆样品中加入内标溶液和乙腈，涡流振荡，离心，取出上清转移至96孔板中，进行lc-ms/ms分析；（2）色谱分离：以含0.1%甲酸和5mm醋酸铵的水溶液作为流动相a，以含0.5%甲酸的乙腈作为流动相b，流动相a:流动相b=50：50；等度洗脱，洗脱时间2.4min；（3）质谱检测：电喷雾电离源；检测方式为正离子；喷射电压5500v；gas1和gas2压力分别为65和65psi；扫描模式为+mrm；用于定量分析离子对：cfxm/z454.2®285.2，ce20ev，dp60v，cfx-13c,15n2m/z457.2®288.2，ce22ev，dp60v；扫描时间为200ms。优选的，步骤（1）中，所述内标溶液为200ng/ml的cfx-13c,15n2溶液。优选的，步骤（1）中，所述血浆样品、内标溶液和乙腈加入的体积比为1：1：4。优选的，步骤（1）中，涡流振荡时间2min，离心转速3900rpm，离心时间10min。优选的，步骤（1）中，取出上清100µl转移至96孔板中，取3.0µl进行lc-ms/ms分析。优选的，步骤（2）中，所述色谱分离还包括：色谱柱：zobaxsb-c8，5μm，4.6*150mm；进样量：3.0μl；柱温：40℃；自动进样器温度为4℃，流动相的流速为：0.8ml/min。本发明的有益效果：（1）本发明采用蛋白沉淀法处理血浆样品，相比与液-液提取法和固相萃取法，蛋白沉淀法具有操作简便、回收率高等特点，可最大程度提高处理通量和灵敏度。（2）本发明检测方法灵敏度较高，能够定量的最低浓度可达到10.00ng/ml。本发明适合头孢克肟胶囊生物等效性或人体药动学研究中使用。附图说明图1：头孢克肟子离子扫描图。图2：cefixime-13c,15n2子离子扫描图。图3：空白基质样品图谱；图中，a：头孢克肟；b：cefixime-13c,15n2。图4：零浓度样品图谱；图中，a：头孢克肟；b：cefixime-13c,15n2。图5：定量下限图谱；图中，a：头孢克肟；b：cefixime-13c,15n2。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
技术领域：
的普通技术人员通常理解的相同含义。术语说明：缩写全文中文说明lloqlowerlimitofquantification定量下限lqclowqualitycontrol低质控mqcmediumqualitycontrol中质控hqchighqualitycontrol高质控rsdrelativestandarddeviation相对标准偏差rerelativeerror相对偏差正如
背景技术：
部分介绍的，现有技术中测定头孢克肟的方法存在灵敏度低、专属性差以及操作繁琐费时等缺点。基于此，在本发明的一种实施方案中，给出了一种快速检测人血浆中头孢克肟浓度的方法，包括以下步骤：步骤1：血浆样品前处理；在离心管中加入50.0μl血浆样品、50.0μl内标溶液（浓度为200ng/ml的cfx-13c,15n2溶液），加入200.0μl乙腈，涡流振荡，离心10min，取出100µl上清转移至已有100µl超纯水的96孔板中，涡流混匀，进行lc-ms/ms分析；步骤2：色谱分离；色谱条件，色谱柱：zobaxsb-c8，5μm，4.6*150mm，安捷伦；进样量：3.0μl；柱温：40℃；流动相a：含0.1%甲酸和5mm醋酸铵的水溶液，流动相b：含0.5%甲酸的乙腈，等度洗脱，流动相a：流动相b=50：50；自动进样器温度为4℃，流动相的流速为：0.8ml/min。步骤3：质谱检测；质谱条件：电喷雾电离源；检测方式为正离子；喷射电压5500v；gas1和gas2压力分别为65和65psi；扫描模式为+mrm；用于定量分析离子对：cfxm/z454.2®285.2，ce20ev，dp60v，cfx-13c,15n2m/z457.2®288.2，ce22ev，dp60v；扫描时间为200ms。由于头孢克肟水溶性强，在一些常用有机萃取剂中的溶解度很小，萃取率低。在样品前处理方法上，本发明采用血浆沉淀法并对提取溶剂进行了考察，发现用乙腈沉淀蛋白质的效果比其他溶剂好，其蛋白沉淀较完全，基质干扰小，稳定性好，其提取回收率也相对较高,因此采用乙腈沉淀蛋白质的方法处理血浆样品。本发明还对乙腈的用量进行了优化考察，发现采用4倍于样品体积的乙腈沉淀蛋白后取上清液直接进样，过程简单快速，既可以沉淀绝大多数蛋白,又能够保证血浆中头孢克肟的灵敏度。本发明的样品前处理条件中，共加样、涡旋、离心、转移上清4个步骤。与现有固相萃取或液-液提取技术相比，操作大大简化，1小时内可完成96个样本的前处理。上述色谱条件中选择的色谱柱为zobaxsb-c8，5μm，4.6*150mm，待测物在具备较好的色谱保留及色谱峰形，可以使色谱峰形更尖锐进而提升灵敏度，针对头孢克肟的极性特点，本发明选择以含0.1%甲酸和5mm醋酸铵的水溶液作为流动相a，选择含0.5%甲酸的乙腈作为流动相b，能够减少拖尾，改善峰形，在上述色谱条件下，能有效的将头孢克肟与血浆中的内源性物质有效的分离开来。等度色谱洗脱模式适合快速检测，色谱分析时间仅为2.4min。经本发明优化后的色谱条件具有优异的分离能力，在质谱检测时可有效减少样品基质的干扰，以及对待测组分离子化的抑制作用，有效提高了检测的灵敏度。为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。实施例1：1材料1.1仪器质谱仪（型号：absciextriplequadtm5500，加拿大sciex公司）。液相色谱仪（日本岛津公司）1.2标准品1.2.1待测物对照品名称：头孢克肟（cefixime）批号：130503-201706分子式：c16h15n5o7s2·3h2o分子量：507.50含量：89.2%（按c16h15n5o7s2计）折算系数：89.2%（按c16h15n5o7s2计）供应商：中国食品药品检定研究院储存条件：2~8℃遮光保存有效期：国家药品标准物质不设具体有效期，按照规定条件保存的标准物质，在中国食品药品检定研究院发布停用通知前有效1.2.2内标对照品名称：cefixime-13c,15n2批号：24-tht-178-1分子式：c1513ch15n315n2o7s2分子量：456.43纯度：97%同位素纯度：98.8%水分：2.7%折算系数：93.2%供应商：trc储存条件：storeat2~8℃有效期：2023-03-31(复标日期)1.3空白基质基质抗凝剂来源血浆edta-k2健康受试者2方法2.1溶液的配制标准曲线样品配制称头孢克肟非对照品，用dmso溶解并用乙腈定容后储存于棕色玻璃瓶，获得浓度约为0.945mg/ml的头孢克肟储备液。吸取上述头孢克肟储备液适量，以乙腈-水（50/50，v/v）逐级稀释得到系列浓度标准溶液，头孢克肟浓度分别200、400、1000、3000、10000、30000、72000和80000ng/ml。以空白血浆稀释上述工作溶液获得头孢克肟浓度分别10.00、20.00、50.0、150.0、500、1500、3600、4000ng/ml的标准曲线样品。内标工作液定量转移cfx-13c,15n2对照品0.25mg，用dmso溶解并用乙腈稀释定容后储存于棕色玻璃瓶，获得浓度为0.0466mg/ml的储备液。取储备液适量，用乙腈:水（50:50，v/v）稀释，获得浓度为200ng/ml的内标溶液。2.2血浆样品处理96孔板中加入50.0µl血浆样品，50.0µl内标溶液（浓度为200ng/ml），200µl乙腈；涡流混匀，离心10min（4°c，3900rpm）；取100µl超纯水加入干净96孔板中；移取100µl上清液到已有100µl超纯水的96孔板中，涡流混匀；取3.00µl进行lc-ms/ms分析。2.3色谱及质谱条件色谱条件质谱条件2.4方法学验证选择性分别取空白人血浆和lloq样品处理分析，得相应色谱图。头孢克肟和内标cefixime-13c,15n2的保留时间均为1.8min，空白血浆谱图中该保留时间处无干扰峰。标准曲线以头孢克肟理论浓度为横坐标（x），头孢克肟与内标cefixime-13c,15n2的面积比为纵坐标（y），进行直线回归计算（权重因子w=1/x2），头孢克肟的典型回归方程为y=0.00511x+0.000681，r2=0.9954，在10.00～4000ng/ml范围内明显线性。准确度、精密度及稳定性以人空白血浆，稀释头孢克肟贮备液，配制成lqc、mqc、hqc（头孢克肟浓度为30.0、250和3200ng/ml）方法验证每一分析批测定各浓度质控样本各六样本。lloq日内、日间精密度以相对标准差（rsd）<20%方可接受，准确度（re）在-20%~20%之间方可接受。其余各浓度水平的qc样品各成分日内、日间精密度（rsd）<15%方可接受，准确度（re）在-15%~15%之间方可接受。结果表明本方法测定头孢克肟的精密度和准确度均可接受，头孢克肟的lloq为10.00ng/ml。取lqc和hqc样品，考察其室温放置12h、处理后提取液4°c放置48h、反复冻融4次以及-80°c放置30天的稳定性。结果表明，在上述条件下头孢克肟均稳定，re在1.2%～5.3%之间。回收率与基质效应分析低、中、高浓度的qc样品个六样本。同时另取空白血浆50.0μl，按血浆样品处理，向上清液中加入头孢克肟对照溶液及内标工作液，涡流混合，进样测定，2种样品中的头孢克肟平均峰面积比即为回收率。结果表明，三浓度水平提取回收率为106.4%。内标回收率为103.6%。取不同来源人空白血浆（n=6），按血浆样品处理（不加入内标），向上清液中加入对照溶液和混合内标工作液，进样测定。另取50.0μl去离子水，按上述方法处理，进样测定。以两种样品头孢克肟峰面积比值计算基质因子。头孢克肟在lqc和hqc浓度下基质因子分别为99.7%和102.1%，表明在本试验条件下，可忽略基质效应对头孢克肟测定的影响。方法验证总结本发明方法经过方法学验证，方法灵敏度高、选择性好、准确、精密、稳定性好、线性良好，分析方法的定量下限为10.00ng/ml。以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。当前第1页12