一种蛋白探针及其在评估抗原抗体特异结合上的应用的制作方法

本发明属于生物分析领域，具体涉及一种蛋白探针及其在评估抗原抗体特异结合上的应用。

背景技术：

生物标志物通常被用以评价生物生理过程、病理过程或对药物干预反应的特异性特征。生物标志物的检测在医学诊断、临床研究、新药开发方面具有重要意义，尤其在肿瘤、病毒感染性疾病或其他疾病的诊断和治疗上具有重要价值。以肿瘤研究为例，肿瘤细胞在发生和增殖过程中，会产生特定的肿瘤标志物，能够直接反映肿瘤的来源、良恶性等信息，检测肿瘤标志物对癌症诊断和治疗有重要意义。

蛋白是生物学功能的执行者，是研究和应用最广泛的标志物。蛋白生物标志物的检测方法，通常是依据抗原与抗体特异性结合这一免疫学基本原理对蛋白标志物进行免疫学检测，经常利用一些具有特殊物理化学性质的标记物对抗体进行标记。

传统的免疫标记物包括放射性同位素、酶、胶体金和有机荧光染料分子等等。

现有的检测技术是利用这些标记物标记已知的抗体，以此作为探针，检测组织细胞上相应的抗原，在抗体与抗原识别后，通过对标记物的定性和定量检测而达到对抗原检测的目的。

例如免疫荧光或免疫酶标检测技术，利用抗体与被检测组织抗原特异性结合，再将这种特异性结合通过荧光染料分子或酶底物反应显色标记出来，用于进一步鉴定组织细胞上蛋白标志物的表达情况。

这种以抗原抗体特异性结合反应原理为依据的检测方法能准确提供组织细胞上某特定蛋白标志物的信息，但是这类检测技术需要酶或荧光染料分子等标记物标记抗体(二抗)，再去标记组织细胞上抗原与抗体(一抗)结合的位置，步骤复杂，操作时间长。因此，研究一种能快速、准确检测这种抗原与抗体结合信息的技术对于肿瘤、感染性疾病或其他疾病相关的蛋白标志物的检测十分有意义。

从物理学的角度，生物蛋白分子之间的相互作用可以利用力学来研究。现有的力学测量技术中，原子力显微镜具有极高的力学分辨率(10^-12n)，且能在近生理环境下利用探针对生物样本进行力学测量，适合用于检测生物分子的弹性和黏附特性等力学性质。但是现有的用于力学测量的探针无法特异性识别组织细胞上特定的蛋白标志物，目前市场上缺乏针对表达了特定的抗原或抗体的组织细胞进行特异性检测的蛋白探针。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于提供一种蛋白探针的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述方法制得的蛋白探针在评估抗原抗体特异结合上的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种蛋白探针的制备方法，包括以下步骤：

将机械探针针尖表面利用化学分子做修饰后，将探针针尖表面的化学基团与连接分子的一端共价键结合，连接分子的另一端则与蛋白共价键结合，从而形成具有特异性的蛋白探针；

所述的化学分子可以是3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)或乙醇胺盐酸盐；

所述的连接分子可以是缩醛聚乙二醇活性脂(acetal-peg-nhs)、戊二醛、乙醛聚乙二醇活性脂(aldehyde-peg-nhs)或苯甲醛聚乙二醇活性脂(benzaldehyde-peg-nhs)中的一种；

所述的蛋白是抗原蛋白或抗体蛋白；

所述的抗原蛋白是肿瘤组织的各种标志物，或是各种病毒；所述的抗体蛋白是各抗原蛋白对应的抗体；

检测胃肠道间质瘤的常用标志物有：cd117、cd34、dog-1(discoveredongist1)、sma(alpha-smoothmuscleactin)、vimentin、desmin、s-100等；

检测甲状腺癌的常用标志物有：tpo(thyroidperoxidase)、glectin-3、ck19、hbme-1(hectorbattiforamesothelialepitope-1)、cd56等；

检测乳腺癌的常用标志物有：her-2(humanepidermalgrowthfactorreceptor2)、muc-1(mucin1)、ck19、e-cadherin等；

检测卵巢癌的常用标志物有：ck7、ck20等。

具体地，所述蛋白探针的制备方法包括以下步骤：

(1)将机械探针表面洗涤干净，然后转移到化学分子溶液中浸泡几个小时，使针尖表面氨基化；

步骤(1)所述的机械探针可以是微米级别或纳米级别；

步骤(1)所述的机械探针是硅或氮化硅材料制成；

步骤(1)所述的洗涤，优选用无水乙醇、超纯水或氯仿中的一种以上洗涤；

当化学分子选用3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)时，步骤(1)所述的化学分子溶液是3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯(无水甲苯)溶液，其中3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积百分比为1％-5％；

当化学分子选用乙醇胺盐酸盐时，步骤(1)所述的化学分子溶液是乙醇胺盐酸盐的dmso溶液，其中乙醇胺盐酸盐的浓度为30％(w/v)；

(2)将氨基化的探针置于连接分子溶液中，盖上盖子反应几个小时，使连接分子的一端连接到探针表面氨基上；

当连接分子选用缩醛聚乙二醇活性脂(acetal-peg-nhs)时，所述的连接分子溶液含有1-3mg/ml的缩醛聚乙二醇活性脂，以及体积百分比0.3-0.8％的三乙胺，溶剂为氯仿；

当连接分子选用戊二醛时，所述的连接分子溶液优选体积百分比1％的戊二醛溶液；

当连接分子选用缩醛聚乙二醇活性脂(acetal-peg-nhs)时，连接分子的一端与探针表面氨基连接后，优选将探针置于柠檬酸溶液中浸泡5-20min，使连接分子的缩醛端转化为醛基，形成活性末端，然后用超纯水将柠檬酸冲洗干净；

所述的柠檬酸溶液，浓度优选0.5-2.0％(w/v)；

(3)将探针置于培养皿中，在探针上滴入蛋白溶液，盖上盖子反应0.5-2h，使蛋白连接在探针上的连接分子末端；再加入乙醇胺溶液混合均匀，盖上盖子反应5-20min，使连接分子末端没有反应的醛基钝化；然后用pbs洗涤若干次，至此蛋白探针制备完成；

步骤(3)所述乙醇胺溶液的浓度优选1m，ph值优选8.0；

当连接分子选用缩醛聚乙二醇活性脂(acetal-peg-nhs)时，步骤(3)中滴入蛋白溶液后，优选加入硼氢化氰钠(nacnbh3)溶液一同反应，使蛋白更稳固地连接在探针上的连接分子末端；

所述硼氢化氰钠溶液的浓度优选1m。

由上述方法制得的蛋白探针可以用于评估抗原抗体是否存在特异结合，具体包括以下步骤：

(1)取小块切除下来的癌症组织或病毒感染的组织，进行包埋、冷冻和切片，然后上细胞力学特性测量平台观察和测量；

(2)在细胞力学特性测量平台上选定待测区域，将蛋白探针针尖定位到待测组织细胞表面，测量时控制探针逼近细胞，使得探针上的抗体(或抗原)分子与组织细胞表面的抗原(或抗体)发生结合反应，然后控制蛋白探针从细胞表面回退，系统记录逼近-回退过程中蛋白探针悬臂弯曲方向和弯曲程度的变化，再将这一变化转化为力值(f＝k·x，k为针尖弹性系数，x为悬臂偏移量)随针尖与细胞表面距离的变化曲线，即力曲线，包括逼近曲线和回退曲线；

当抗原抗体发生特异性结合时，在力曲线中的回退曲线会出现一个或多个突变峰；反之，如果回退曲线上没有突变峰，说明没有发生抗原抗体结合反应。

所述的细胞力学特性测量平台可以采用中国专利申请cn110567859a公开的一种细胞力学特性测量设备，或者选用现有技术，如原子力显微镜；

步骤(2)的具体操作方法步骤还可结合参考中国专利申请cn110567859a中的细胞力学特性测量方法相关段落。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明将特异性识别肿瘤标志物(或病毒)的抗体(或抗原)蛋白与非特异性的机械探针有机结合，制得蛋白探针，因此能特异性识别肿瘤标志物和病毒(抗原)。且可根据待测区域的大小及对分辨率的要求定制不同尺度的蛋白探针，可实现对待测区域的精准定位，提高准确性。另外，细胞力学特性测量平台的力学分辨率可达到pn级别，直接测量抗原抗体结合的力学特性能更加精准地反映抗原抗体结合的状态。

2、本发明采用细胞力学特性测量平台，根据不同的肿瘤或病毒类型研制特定的抗体(或抗原)蛋白探针，在选定的待检组织样本上，使蛋白探针上的抗体(或抗原)蛋白与待测样本上的肿瘤标志物(或病毒)结合，这个过程对样本制备要求简单，且操作简便，用时非常短。

附图说明

图1是实施例获取的肿瘤标志物(抗原)与抗体蛋白探针特异性结合的力曲线。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

一种抗体蛋白探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)将硅或氮化硅材料的机械探针(微米级别)用无水乙醇、超纯水交替浸泡洗涤5min，重复3次，将aptes(3-氨丙基三乙氧基硅烷)溶于无水甲苯(2％(v/v))，然后将探针转移到该溶液中浸泡3h，使针尖表面氨基化；

(2)将双端功能化的连接分子acetal-peg-nhs(1mg/ml)与三乙胺(0.5％v/v)在0.5ml氯仿溶液中混合，并将氨基化的探针置于该溶液中，盖上盖子反应2h，使连接分子的nhs端连接到探针上；

(3)将探针置于1％(w/v)柠檬酸溶液浸泡中10min后，使连接分子的缩醛端转化为醛基，形成活性末端，用超纯水冲洗10min；

(4)将探针置于培养皿中，在探针上滴入100μl抗体(抗cd117抗体)溶液(1-2μm)，再加入2μl硼氢化氰钠(nacnbh3)溶液(1m)混合均匀，盖上盖子反应1h，使抗体更稳固地连接在探针上的连接分子末端。再加入5μl乙醇胺(1m，ph值8.0)混合均匀，盖上盖子反应10min，使连接分子末端没有反应的醛基钝化。然后用pbs洗涤5min，重复3次。至此抗体蛋白探针制备完成，可放在pbs中4℃保存。

实施例2

一种抗体蛋白探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)将硅或氮化硅材料的机械探针(微米级别)用氯仿浸泡洗涤5min，重复3次，然后将探针转移到30％(w/v)乙醇胺盐酸盐dmso溶液(加入分子筛吸收水分)浸泡过夜，使针尖表面氨基化；

(2)将氨基化的探针置于连接分子戊二醛溶液(1％v/v)中，盖上盖子反应1h，使连接分子的一端连接到探针上；

(3)将探针转移到所选择的标志物的相应抗体溶液(100μg/ml)中，盖上盖子反应1h，使抗体连接在探针上连接分子的末端。再加入5μl乙醇胺(1m，ph值8.0)混合均匀，盖上盖子反应10min，使连接分子末端没有反应的醛基钝化。然后用pbs洗涤5min，重复3次。至此抗体蛋白探针制备完成，可放在pbs中4℃保存。

实施例3

实施例1的抗体蛋白探针在测定抗原抗体结合力上的应用，包括以下步骤：

(1)取样准备，在手术切除的胃肠间质瘤组织切面上取1mm³组织块，滴上冰冻切片包埋剂(oct)进行快速冰冻，将冰冻好的组织切片，厚度为5～10μm，并固定于基片上。

(2)在原子力显微镜(优选中国专利申请cn110567859a公开的一种细胞力学特性测量设备)下选定待测区域，将抗体蛋白探针针尖定位到待测组织细胞表面，测量时控制探针逼近细胞，使得探针上的抗体分子与组织细胞表面的肿瘤标志物(抗原)发生结合反应，然后控制抗体蛋白探针从细胞表面回退，系统记录逼近-回退过程中蛋白探针悬臂弯曲方向和弯曲程度的变化，再将这一变化转化为力值(f＝k·x，k为针尖弹性系数，x为悬臂偏移量)随针尖与细胞表面距离的变化曲线，即力曲线，包括逼近曲线和回退曲线(具体的操作方法步骤还可结合参考中国专利申请cn110567859a中的细胞力学特性测量方法相关段落)。

当发生抗原抗体特异性结合反应时，在力曲线中的回退曲线会出现一个或多个突变峰，这个突变峰反映了所测量肿瘤标志物(抗原)与抗体蛋白探针之间的结合力(图1)，反之，如果曲线上没有突变峰，说明没有发生抗原抗体结合反应。

图1是得到的力曲线，可以看到其回退曲线有至少一个突变峰，说明待测的胃肠间质瘤组织中有标志物与抗体发生抗原抗体特异性结合。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。