检测大环内酯类化合物的代谢物的方法和试剂盒与流程

本发明涉及分析化学领域，具体地，涉及检测大环内酯类化合物的代谢物的方法和试剂盒。

背景技术：

大环内酯类是链霉菌产生的广谱抗生素，主要用于临床和动物的细菌感染。但是，滥用或不合理添加会产生多种毒副作用，例如：消化道症状，肝毒性，过敏，心脏毒性，心律不齐和尖锐湿疣。这些化合物很容易在动物体内积累。而且，容易通过食物链传播到人体内，会对消费者构成威胁。如今，食品中的大环内酯类抗生素已成为食品安全研究的主要关注点。

目前，有报道首次在生活和工业废水中发现3种代谢物，其浓度高达20.1μg/l，可能间接污染农作物和食品。包括了n-去甲基罗霉素，n-去甲基克拉霉素，红霉素a肟。这3种代谢物因与母体药物结构相似，因此也有一些毒性和生态毒理作用。到目前为止，尚未开发出研究食品中这3种代谢物的残留测定方法。

虽然这3种新兴的代谢产物在农产品和食品中的药物浓度较低，但毒性显着。同时，再加上基质的复杂性，样品纯化方法和高灵敏度仪器分析方法具有极大的挑战性。因此，有必要开发一种方法来研究这3种化合物的可能的迁移残留，以有效控制食品中抗生素的迁移。

技术实现要素：

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种检测大环内酯类化合物的代谢物的方法，操作简单、灵敏度和回收率及重现性高，该方法尤其适用于3种新兴的大环内酯类化合物(红霉素、克拉霉素和罗红霉素)的代谢产物。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种检测大环内酯类化合物的代谢物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将待测样品进行提取处理和净化处理，以便得到待测液；利用超高效液相色谱与四极杆静电场轨道阱傅里叶转换联用质谱联用系统(uhplc-q-exactive-orbitrap质谱联用系统)进行检测，以便对所述大环内酯类代谢物进行定性分析和/或定量分析。

其中，本文所用术语“大环内酯类化合物的代谢物”是指大环内酯类抗生素化合物在在体内多种药物代谢酶(尤其肝药酶)的作用下，化学结构发生改变，继而在体内生物转化成为有药理活性的代谢物或产生有毒的代谢物，例如，红霉素a肟、n-去甲基克拉霉素和n-去甲基罗红霉素这三种代谢物是红霉素、克拉霉素和罗红霉素三种大环内酯类化合物的代谢物。

根据本发明实施例的检测大环内酯类化合物的代谢物的方法，采用超高效液相色谱与四极杆静电场轨道阱傅里叶转换联用质谱联用系统进行检测，对大环内酯类化合物的代谢物均有良好的检测效果，灵敏度和回收率及重现性高，分析速度快，溶剂使用量少，成本低，操作简便，样品制备过程中使用的装置简单，尤其适用于食品等物质中大环内酯类化合物代谢物残留含量的准确测定。

根据本发明的实施例，该待测样品为食品，例如牛奶等复杂基质样品。对于复杂基质的样品，发明人发现，通过提取处理和净化处理，利用吸附剂与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化，能快速简单的去除复杂基质对于待测化合物检测的干扰，简化样品处理程序，提高检测的灵敏度和准确性。

根据本发明的实施例，所述提取处理包括：将所述待测样品与提取剂混合，以便得到第一混合物；将所述第一混合物进行超声处理，以便得到第二混合物；将所述第二混合物进行离心处理，以便得到第一上清液。由此，有利于提高检测的灵敏性和回收率。

根据本发明的实施例，所述净化处理包括：将所述第一上清液与净化剂混合，以便得到第三混合物；将所述第三混合物进行超声处理，以便得到第四混合物；将所述第四混合物进行静置分离，以便得到第二上清液；将所述第二上清液进行干燥过滤，以便得到所述待测液。由此，有利于提高检测的灵敏性和回收率。

根据本发明的实施例，所述提取剂为0.05％-0.1％甲酸-乙腈、无水硫酸镁和氯化钠的混合物。其中，0.05％-0.1％甲酸-乙腈可以快速沉淀牛奶样品中的蛋白质，硫酸镁可除去牛奶中的大部分水分，氯化钠可将牛奶中残留的水分与乙腈溶液分层。三者共同作为提取剂时，可对样品中目标物进行快速提取，减少提取的时间。同时试剂价格均比较低廉。根据本发明的实施例，基于10ml0.05％-0.1％(v/v)甲酸-乙腈，含有300-500mg无水硫酸镁和1-3g氯化钠。由此，利用该比例的提取剂进行提取，提取效果好，速度快。

根据本发明的实施例，所述净化剂为乙酸钠、n-丙基乙二胺和c18的混合物。发明人对多种净化剂进行筛选，研究发现，对于大环内酯类代谢物，乙酸钠、n-丙基乙二胺和c18的纯化效果和回收率更佳，有利于提高检测的灵敏度、准确性和回收率。

根据本发明的实施例，乙酸钠、n-丙基乙二胺和c18的质量比为10-20∶1∶1-4。三种吸附剂材料的用量如上时，样品基质效应可明显降低，能有效去除杂质且不对目标物有吸附，同时三种吸附剂的用量相对最少，对目标物的回收率较高。

根据本发明的实施例，所述超高效液相色谱的色谱条件包括：色谱柱：c18色谱柱，规格为2.1×100mm，3.5μm；进样温度：30℃；样品温度：10℃；进样量：5.0μl；流量：0.2ml/min。由此，色谱的分离效果好，检测的精确度和灵敏度高。

根据本发明的实施例，所述质谱的质谱条件包括：离子源：hesi源；毛细管温度：350℃；雾电压：3.6kv；鞘气：40psi；辅助气体：10arb；加热器温度：350℃；质谱检测方式：full-ms和dd-ms2。其中，一级质谱分辨率为70000，二级质谱扫描分辨率为35000。同时，full-ms可对样品中的目标物进行全扫描，找出hesi源电离条件下目标物的离子化模式，确定母离子的扫描质量数，而dd-ms²对目标物的质荷比进行进一步的电离，选出其中5个质谱响应最高的子离子，同时质谱分辨率较高，可减少相近质量数的离子的相互干扰，本发明一些实施例的检测结果可见表1

根据本发明的实施例，所述色谱的洗脱剂为a：0.05％～0.15％甲酸-水(10mmol/l乙酸铵)，b：乙腈。由此，分析时间短，色谱峰形好，分辨率高。待测物的电离效率，显著提高检测的灵敏度。由此，大环内酯类抗生素的代谢物，在10-15min之内可得到分离，峰形相对较好，有利于目标物的定性和定量分析。结果见图2.

根据本发明的实施例，所述色谱的洗脱条件为：10％b，0-1分钟；10％-98％b，1-15分钟；98％b，15-20分钟；98％-10％b，20-21分钟；10％b，21-25分钟。由此，大环内酯类代谢物分离效果好，检测时间适宜。

根据本发明的实施例，所述代谢物包括：红霉素a肟、n-去甲基克拉霉素、n-去甲基罗红霉素，这三种代谢物是红霉素、克拉霉素和罗红霉素三种大环内酯类化合物的代谢物。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种用于前述检测大环内酯类化合物的代谢物的方法的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：第一提取剂：0.05％-0.1％甲酸-乙腈；第二提取剂：无水硫酸镁；第三提取剂：氯化钠；第一净化剂：乙酸钠；第二净化剂：n-丙基乙二胺；第三净化剂：c18；色谱柱：c18色谱柱，规格为2.1×100mm，3.5μm。

根据本发明实施例的试剂盒，采用上述提取剂和净化剂对样本进行提取净化处理，处理简单，速度快，能有效去除复杂基质对检测的干扰，并结合前述的超高效液相色谱与四极杆静电场轨道阱傅里叶转换联用质谱联用系统进行检测，对大环内酯类代谢物均有良好的检测效果，灵敏度和回收率及重现性高，可用于食品等物质中大环内酯类代谢物残留含量的准确测定。根据本发明的一些实施例，利用本发明实施例的试剂盒对3种大环内酯类抗生素代谢物进行检测，在1-200μg/l范围内线性良好，相关系数大于0.99，目标物的回收率可达到83.4％-117.7％，检出限和定量限分别为0.10～0.5μg/kg和0.5～2.0μg/kg，方法精密度为2.6％-14.6％。结果见表2.

根据本发明的实施例，该试剂盒进一步包括：复溶试剂：甲醇；标准溶液：所述标准溶液选自红霉素a肟、n-去甲基罗红霉素、n-去甲基克拉霉素的至少一种。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的大环内酯类代谢物(100μg/l)的单通道色谱示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例的不同提取溶剂对大环内酯类代谢物成分提取效果比较示意图；

图3显示了根据本发明一个实施例的为提取溶剂在不同体积下目标物回收率的对比示意图；

图4显示了根据本发明一个实施例的3种吸附剂对目标物吸附效果对比示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

为了便于理解前述检测大环内酯类代谢物的方法，在此提供该方法的一般步骤，具体如下：

(1)样品提取及净化：

(a)提取方法：准确称取牛奶样品5.00±0.05g置于离心管中，然后加入提取试剂a、提取试剂b和提取试剂c，涡旋，超声，离心(4℃，10000r/min)，得到上清液。

(b)净化方法：将上清液转移至第二个离心管中，然后加入净化试剂a、净化试剂b和净化试剂c，涡旋1min，超声1min，得到的上清液40℃氮吹，采用滤膜过滤。

(2)配制具有浓度梯度的大环内酯类代谢物混合标准溶液：

(a)分别精密移取0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，20，50，100，200μl的10μg/ml混合标准a至10ml容量瓶中。

(b)用甲醇稀释并定容至10ml，混匀，可得0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，20，50，100，200ng/ml标准曲线溶液。

(3)混合标准溶液和净化后的样品进行uhplc-q-orbitrap质谱测定。

(a)色谱条件为：色谱柱：xbridge-c18(2.1×100mm，3.5μm，waters)；进样温度为30℃；样品温度保持在10℃。进样量：5.0μl；流速：0.2ml/min。液相梯度洗脱程序为：10％b(0-1min)，10％-98％b(1-15min)，98％b(15-20min)，98％-10％b(20-21min))，10％b(21-25分钟)。

(b)质谱条件为：离子源为hesi源；毛细管温度为350℃；喷雾电压设定为3.6kv；鞘气为40psi；辅助气体为10arb；加热器温度为350℃。质谱检测方式：full-ms和dd-ms2。

(4)利用标准曲线对样品中的大环内酯类代谢物化合物进行定量分析。

(a)标准品混合溶液的提取离子色谱峰的峰面积(y)作为纵坐标，质量浓度(x)为横坐标建立线性方程。

(b)采用外标法对实际样品进行定量测定，即通过配制的标准曲线来对样品中的大环内酯类代谢物化合物进行定量分析。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自sigma公司。

实施例1

本实施例中，利用本发明实施例的检测3种大环内酯类代谢物对牛奶样品的检测，3种大环内酯类化合物分别是红霉素a肟、n-去甲基克拉霉素、n-去甲基罗红霉素，方法具体如下：

1、实验方法

(1)样品的提取净化：

(a)准确称取牛奶样品5g置于50ml离心管中，加入提取试剂(0.1％甲酸-乙腈，10ml、无水硫酸镁，400mg、氯化钠，2.0g)，涡旋1min，混匀，超声一分钟，离心(4℃，10000r/min)10min。

(b)提取上清液10ml至第二个50ml离心管中，然后将乙酸钠(1.0g)、n-丙基乙二胺(10mg)和c18(120mg)加入第二个离心管中，涡旋1min混匀。

(c)40℃氮吹，用1ml甲醇复溶。

(2)上机测定：用0.22μm尼龙滤膜过滤后上机检测。

(3)仪器条件

色谱条件：色谱柱：色谱柱：xbridge-c18(2.1×100mm，3.5μm，waters)；进样温度为30℃；样品温度保持在10℃。进样量：5.0μl；流速：0.2ml/min。液相梯度的洗脱剂为a：0.1％甲酸，b：乙腈，洗脱程序为：10％b(0-1min)，10％-98％b(1-15min)，98％b(15-20min)，98％-10％b(20-21min)，10％b(21-25分钟)。

质谱条件：质谱条件：离子源为hesi源；毛细管温度为350℃；喷雾电压设定为3.6kv；鞘气为40psi；辅助气体为10arb；加热器温度为350℃；质谱检测方式：full-ms和dd-ms2。

(4)标准溶液的配制与标准曲线、检测限与定量限的测定。

准确称取单个大环内酯代谢物标准品10.0±0.1mg分别置于10ml容量瓶中，加入少许甲醇混匀，待标准品溶解，再加入甲醇定容至10ml，可得1mg/ml的单个大环内酯类代谢物标准品储备液。分别精密移取上述单个大环内酯类代谢物标准品储备液10μl至10ml容量瓶中，用甲醇稀释并定容至10ml，可得1μg/ml的大环内酯类代谢物混合标准溶液a，并放置于4℃冰箱中保存待用。

分别精密移取0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，20，50，100，200μl的10μg/ml混合标准a至10ml容量瓶中，用甲醇稀释并定容至10ml，混匀，可得0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，20，50，100，200ng/ml标准曲线溶液。分别注入uhplc-q-exactive-orbitrap质谱分析，得到标准曲线。通过注入最低浓度(在加标空白牛奶中)确定lod，并产生等于3的信噪比(s/n)，同时在s/n等于10的情况下计算loq。

在空白牛奶中添加混合质量浓度标准工作液，使添加量为loq，2loq，4loq三个质量浓度的添加水平。每个添加浓度做6个平行样品，按上述方法进行处理分析，计算回收率和日内日间精密度。

2、结果与分析：

(1)色谱条件的选择

在建立定量方法的过程中，流动相是不可忽视的最重要因素之一。合适的流动相不仅缩短了分析时间，改善了色谱峰形，而且还获得了良好的分辨率。同时，流动相在电喷雾电离下与分析物一起被电离，因此，流动相的选择影响分析物的电离效率，这影响质谱法的灵敏度。为了提高分析物的检测灵敏度，甲醇-水溶液和乙腈-水溶液，甲醇-0.1％(v/v)甲酸-水溶液和乙腈-0.1％(v/v)甲酸-水，乙腈-0.1％(v/v)甲酸-水溶液(2、5、10、20mmol/l乙酸铵)用于实验。

当甲醇-水和乙腈-水作为流动相时，由于乙腈-水的强大洗脱能力可以目标物的保留时间显著提前，并且峰宽缩小。但是，3种代谢物的响应不是很高。因此，本实施例进一步添加甲酸以增强质谱响应，则0.1％(v/v)的甲酸-甲醇溶液和0.1％(v/v)的甲酸-乙腈溶液用于优化液相条件，结果表明质谱响应增加了一个数量级。由于0.1％(v/v)甲酸-乙腈溶液的质谱响应高于0.1％(v/v)甲酸-甲醇溶液，因此选择0.1％(v/v)甲酸-乙腈溶液作为流动相。在这种条件下，n-去甲基克拉霉素有轻微峰前沿现象，因此为了改善峰形，将一系列浓度的乙酸铵(2、5、10、20mmol/l)添加到流动相中。随着乙酸铵浓度的增加，峰前沿现象得到显着改善，峰形更好。在乙酸铵浓度为10mmol/l时各目标物色谱峰相对较好，因此0.1％(v/v)甲酸-乙腈(含10mmol/l乙酸铵)选择)作为此实验中优选的实验条件，牛奶样品中3种化合物的提取离子流的优化色谱图如图1所示。

表13种大环内酯类代谢物化合物质谱参数

(3)样品提取溶剂的优化

在分析方法的开发中，选择合适的提取溶剂对于提高回收率非常重要。在本实施例的分析程序中，测试了含有0.1％甲酸的乙腈(acn)，甲醇，乙腈，含有10mm乙酸铵的乙腈。提取的回收率结果如图2所示。可以观察到3种大环内酯类代谢物在甲醇中回收率低于50％，加入0.1％甲酸或10mmol/l乙酸铵后，发现这三种化合物的回收率提高，因0.05％-0.15％甲酸-乙腈为提取溶剂时，三个化合物回收率最高，均在85.3％以上。因此，选择含有0.1％甲酸-乙腈为优选提取溶剂。

(4)样品提取溶剂体积的优化

提取溶剂的体积是影响化合物提取效率的重要因素。研究了5、10、15和20ml0.1％甲酸与乙腈溶液的提取效率，结果如图3所示，10-15ml乙腈的提取效率合理，为了节省溶剂，选择10ml。

(5)样品净化条件的优化

rsm已被用于评估多种因素和水平对反应变量的影响。rsm的ccd用于设计和优化大环内酯类的一些提取和纯化方法。为了减少基质效应对回收率的干扰，根据大环内酯类的结构选择了各种纯化材料，如c18，psa和naac。为了确定大环内酯类样品纯化的最佳条件以及回收率与这两个变量之间的关系，通过两个参数的联合测试进行方差分析。选择红霉素a肟作为实例来计算回归系数值。在线性，双因子相互作用(2fi)，响应的二次和三次多项式中，系数常数x1，x2，x3x1²，x2²，x3²在p＜0.05的水平上是显着的。因此，在确定13组条件下的响应恢复后，通过rsreg分析计算回收率的回归系数，并且如下拟合多项式回归模型方程：y＝+92.311+9.20724*x1+0.029725*x2+5.33897e-003*x3-1.9955*x1*x2+3.4159*x1*x3+1.8300*x2*x3-18.122*x12-1.9776*x22-3.0315*x32。基于回归系数和p值，我们得出结论，c18(x1)，psa(x2)，naac(x3)的量的线性和二次项，最大回收率对应于具有不同变量的c18，psa和naac，结果如图4示。

(6)基质效应

在通过液相色谱-质谱法检测复杂基质样品中，基质共提取物对目标物质的电离具有基质增强或基质抑制作用，从而影响目标物质的定量测定。根据公式：me(％)＝(1-ss/sm)×100计算基质效应(me)。当me＝-20％～20％时为弱基质效应；当me＝-50％～-20％或20％～50％时为中等基质效应；当me＝＜-50％或＞50％时为强基质效应。式中，ss和sm在纯溶剂中目标物的响应值和样品基质中添加的相同含量目标物的响应值。在结果中，3种大环内酯类代谢物具有相对较明显的基质效应。因此，基质匹配的方法用于大环内酯类代谢物的定量，具体见表2。

(7)检测方法的线性范围、检出限和定量限

方法线性使用基质匹配的校准标准品，在11个浓度水平范围内，在1-200ng/ml曲线范围内(0.1，0.2，0.5，1，2，5，10,20,50,100,200ng/ml))。所有基质匹配的校准曲线的线性回归系数(r)在每种情况下都大于0.9995，见表2。

(8)检测方法精密度和回收率

通过在三个不同的日子处理三个水平(20,50,100μg/kg)的独立加标样品来评估回收率和精确度。如表2所示，所有分析物的回收率为85.3％-117.7％精密度低于4.5％，表明重复性和再现性良好。具体见表2。

表2.所开发的牛奶样品方法的验证参数

(9)实际样品的测定

在研究的最后阶段，将开发的方法应用于从中国零售市场获得的20种牛奶的检验。所得结果列于表3中。在三个样品中观察到痕量的大环内酯类(＜loq)。

表3.在实际样品中发现的大环内酯抗生素及代谢物残留的浓度(μg/kg)

表3.样本中发现的大环内酯代谢物的浓度(μg/kg)

本发明实施例采用uhplc-q-exactive-orbitrap质谱联用技术开发了一种分析方法，用于正离子和负离子模式同时提取牛奶中3种大环内酯类代谢物，并扩大了quechers检测牛奶样品中大环内酯类药物的应用范围。通过rsm建立优化的样品处理条件，并用于优化quechers提取和去除牛奶中的3种大环内酯类代谢物。对于这些大环内酯类代谢物，改进的quechers方法获得了可接受的结果，观察到的回收率＞85.3％。该方法检测成本低，周期短，稳定性好，准确度高，适用于市场上食品，例如牛奶等的快速批量筛选。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。