一种LC-MS/MS测定山银花和/或金银花中多种黄酮苷元含量的方法与流程

本发明涉及山银花和/或金银花中多种黄酮苷元含量同时测定的方法，尤其涉及一种水解黄酮苷，并经过固相萃取净化，lc-ms/ms测定山银花和/或金银花中多种黄酮苷元含量的方法。
背景技术：
：山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬loniceramacranthoideshand.-mazz.，红腺忍冬lonicerahypoglaucamiq,，华南忍冬loniceraconfusadc.或黄褐毛忍冬lonicerafulvotomentosahsuets.c.cheng的干燥花蕾或带初开的花，金银花为忍冬科植物忍冬lonicerajaponicathunb.的干燥花蕾或带初开的花。山银花和金银花均需在夏初花开放前采收获得，具有清热解毒，疏散风热的功效，可用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热。也有研究发现其具有抗菌、抗病毒、抗氧化和抗动脉粥样硬化等作用。原本山银花和金银花并未明确区分，伴随着对药材研究的深入和完善，药材分类越来越严格，在《中国药典》2005年版起，为保护道地药材、规范用药，将山银花和金银花进行了细分。药典中金银花的有效成分为木犀草苷和绿原酸，山银花的有效成分为绿原酸，灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙。然而研究表明除了这些成分外，其他黄酮类化合物、挥发油类化合物、有机酸类和三萜类化合物也陆续被发现和鉴别。由于黄酮类化合物种类较多，在植物体内苷元可与糖类物质形式不同的苷而普遍存在，且标准品较难获取，目前除液相色谱-高分辨质谱法分析，其他分析手段较难获得更全面的信息。本申请筛选出山银花和金银花中5种主要的黄酮苷元和对应的黄酮苷(槲皮素，木犀草素，山萘酚，芹菜素，黄芩素，芦丁，木犀草苷，紫云英苷，野漆树苷和黄芩苷)。表1各类化合物的基本信息编号名称英文名称cas号分子式分子量1槲皮素quercetin117-39-5c15h10o7302.22木犀草素luteolin491-70-3c15h10o6286.23山萘酚kaempferol520-18-3c15h10o6286.24芹菜素apigenin520-36-5c15h10o5270.25黄芩素baicalein491-67-8c15h10o5270.26芦丁rutin153-18-4c27h30o16610.57木犀草苷cynaroside5373-11-5c21h20o11448.48紫云英苷astragalin480-10-4c21h20o11448.49野漆树苷rhoifolin17306-46-6c27h30o14578.510黄芩苷baicalin21967-41-9c21h18o11446.4中国发明专利申请(cn107389814a)公开了一种运用反相高效液相色谱二极管阵列检测快速测定沙棘中儿茶素、芦丁、杨梅素、槲皮素、山奈酚和异鼠李素成分含量的方法。该方法通过酸性水解，将黄酮苷水解后，释放独立的游离苷元，依靠rp-hplc-dad对游离苷元进行准确定量，获得黄酮提取物的精确质控数据。黄酮苷水解方法：采用盐酸作为水解作用剂，甲醇为反应溶剂；反应条件为：以甲醇溶解黄酮提取物，加入盐酸溶液，80-95℃下加热回流0.5-3h。而目前采用盐酸水解法对于黄酮苷元回收率低于30％，无法实现有效的测定。技术实现要素：为了解决盐酸水解法提取黄酮苷元回收率低的技术问题，本申请的目的是提供一种lc-ms/ms测定山银花和/或金银花中多种黄酮苷元含量的方法，该方法采用在提取时在试样中加入t-丁基-1,4-苯酚作为抗氧化剂，研究发现水解过程中各苷元的损失率低于20％。该方法简便快捷，消耗资源小，检测成本低的特点。为了实现上述的目的，本申请采用了以下的技术方案：一种lc-ms/ms测定山银花和/或金银花中多种黄酮苷元含量的方法，该方法包括提取、净化和测定步骤，所述的提取采用盐酸乙醇溶液水解提取法，所述的多种黄酮苷元为槲皮素，木犀草素，山萘酚，芹菜素和黄芩素5种黄酮苷元，在提取时在试样中加入t-丁基-1,4-苯酚作为抗氧化剂。作为优选，所述的t-丁基-1,4-苯酚的加入量为试样的质量的0.8-2倍。作为优选，所述的提取水解条件为：加t-丁基-1,4-苯酚，50vol％的乙醇溶液和浓盐酸，在氮气保护下，水浴加热回流120min。作为一个具体的实施方式，所述的提取如下：称取0.5g试样，精确到0.01g，置于150ml圆底烧瓶中，加0.5gt-丁基-1,4-苯酚，36ml50vol％的乙醇溶液和4.0ml浓盐酸，在氮气保护下，水浴加热回流120min，氮气保护下冷却后，加水定容至50ml。作为优选，所述的净化采用hlb固相萃取柱。作为一个具体的实施方式，所述的净化步骤如下：取上清液1ml，加入9ml水，混匀并转移至hlb固相萃取柱中，hlb固相萃取柱依次用5ml甲醇和5ml5vol％甲醇溶液活化，加入5ml10％甲醇溶液淋洗，抽干，加10ml甲醇进行洗脱，控制流速1ml/min～2ml/min，收集全部洗脱液，定容至10ml，摇匀，过0.22μm有机滤膜，取1.0ml定容溶液，加40％的甲醇溶液稀释定容至25ml。作为一个具体的实施方式，所述的测定采用液相色谱-串联质谱法对黄酮苷元进行定量测定，包括以下步骤：①标准工作液和样品溶液在设定的液相色谱串联质谱条件下进样，以百分比浓度x为横坐标，峰面积的比值y为纵坐标，外标法定量的化合物以峰面积为纵坐标，绘制6点标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中各化合物的响应值应在仪器检测的线性范围内；②在上述色谱条件下，判断样品中是否存在相应的被测物，需要满足如下条件：样品溶液中出现的质量色谱峰保留时间与混合基质标准工作液一致，允许偏差小于±2.5％，该色谱峰所对应的化合物在设定的质谱定性离子的相对丰度与浓度相当的混合基质标准工作液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过设定的规定，则可确定含有该化合物。作为一个具体的实施方式，所述的色谱柱具体参数如下：色谱柱:mightysilrp-18，3μm，4.6×150mm；流动相:a甲醇-b0.15％甲酸溶液；流速:0.4ml/min；进样量:20μl；柱温:25℃；梯度洗脱程序：0min：40％a，60％b；10.0min：75％a，25％b；15.0min：90％a，10％b；22.0min：90％a，10％b；23.0min：40％a，60％b；30.0min：40％a，60％b。作为一个具体的实施方式，所述的质谱具体参数如下：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；监测方式：多反应监测；电喷雾电压is：-4500v；雾化气压力gs1：289kpa，42psi；气帘气压力gs2：310kpa，45psi；辅助气流速cur：172kpa，25psi；离子源温度tem：540℃；定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差：相对离子丰度>50％，允许的相对偏差±20％相对离子丰度>20％～50％，允许的相对偏差±25％相对离子丰度>10％～20％，允许的相对偏差±30％相对离子丰度≤10％，允许的相对偏差±50％。作为一个具体的实施方式，所述的10类化合物的质谱参数如下:*为定量离子对。本申请对其中黄酮类化合物进行提取的同时对黄酮苷进行盐酸水解获得苷元，通过hlb固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱法对苷元进行定量测定，从而建立了山银花和金银花中槲皮素，木犀草素，山萘酚，芹菜素和黄芩素5种黄酮苷元含量的方法。该方法以苷元检测的形式，更为全面的反应出各苷元所代表的黄酮类化合物的总量，有助于更准确测定黄酮类化合物的含量。附图说明图1液相色谱-质谱/质谱法分离的黄酮苷元离子流图(2ng/ml)。图2液相色谱-质谱/质谱法分离的黄酮苷元提取离子流图(2ng/ml)。图3液相色谱-质谱/质谱法分离的黄酮苷离子流图(2ng/ml)。图4液相色谱-质谱/质谱法分离的黄酮苷提取离子流图(2ng/ml)。图5不同固相萃取柱的净化情况对比图。具体实施方式1实验部分1.1仪器、试剂与材料api4000型三重四极杆串联质谱仪(配电喷雾离子源esi，ab公司，美国)，1100型液相色谱仪(agilent公司，美国)，milli-qsynergy185超纯水器(millipore公司，美国)，ikams3basic型涡旋器(ika公司，德国)，24孔固相萃取装置(supelco公司，美国)，heraeusmultifugex1r型台式离心机(thermo公司，美国)，g&gjj500型电子天平(双杰公司产品，中国)，mettlerae260(mettlertoledo公司产品，瑞士)。甲醇(色谱纯，tedia公司)，甲酸(质谱级，scharlau公司)，乙腈(色谱纯，scharlau公司)，乙醇(分析纯，安徽安特食品股份有限公司)，盐酸(优级醇，永华化学科技(江苏)有限公司)，t-丁基-1,4-苯酚(分析纯，aladdin公司)，cnwc18固相萃取柱(6ml，500mg，anpel公司)，c18固相萃取柱(6ml，500mg，waters公司)，hlb固相萃取柱(6ml，200mg，waters公司)，hlb固相萃取柱(6ml，200mg，biocomma公司)。标准物质：槲皮素(纯度96.4％，chromadex公司)、木犀草素(纯度96.9％，chromadex公司)、山萘酚(纯度95.5％，中国食品药品检定研究院)、芹菜素(纯度98.5％，bepure公司)、黄芩素(纯度99.2％，anpel公司)；芦丁(纯度95.0％，trc公司)、木犀草苷(纯度98.9％，anpel公司)、紫云英苷(纯度99.1％，anpel公司)、野漆树苷(纯度98.9％，anpel公司)、黄芩苷(纯度96.8％，chromadex公司)。用甲醇将各化合物固体标准品溶解，稀释并定容获得10mg/ml标准储备液，根据需要用甲醇将其储备液稀释至所需浓度。1.2实验部分1.2.1样品前处理称取0.5g试样(精确到0.01g)置于150ml圆底烧瓶中，加0.5gt-丁基-1,4-苯酚，36ml50％的乙醇溶液和4.0ml浓盐酸，在氮气保护下，水浴加热回流120min，氮气保护下冷却后，加水定容至50ml，取上清液1ml，加入9ml水，混匀并转移至hlb固相萃取柱中(依次用5ml甲醇和5ml5％甲醇溶液活化)，加入5ml10％甲醇溶液淋洗，抽干，加10ml甲醇进行洗脱，控制流速1ml/min～2ml/min，收集全部洗脱液，定容至10ml，摇匀，过0.22μm有机滤膜，取1.0ml定容溶液，加40％的甲醇溶液稀释定容至25ml，混合均匀，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。1.2.2色谱参数色谱柱：mightysilrp-18，3μm，4.6×150mm，流动相：甲醇(a)-0.15％甲酸溶液，流动相梯度洗脱程序：0～10.0min时40％(a)线性增加至75％；10.0～15.0min时75％(a)线性增加至90％；15.0～22.0min时90％(a)保持不变；22.0～23.0min线性下降至40％(a)；23.0～30.0min40％(a)进行系统平衡；流速：0.4ml/min；进样量：20μl；柱温25℃。1.2.3质谱参数离子源：电喷雾离子源(esi)；扫描模式：负离子扫描；监测方式：多反应监测(mrm)；电喷雾电压(is)：-4500v；雾化气压力(gs1)：289kpa(42psi)；气帘气压力(gs2)：310kpa(45psi)；辅助气流速(cur)：172kpa(25psi)；离子源温度(tem)：540℃；其它质谱参数如表2所示。表2各化合物基本信息及质谱测定条件*为定量离子对。2结果与讨论2.1水解和提取条件的选择通常中草药中有效成分的提取采用超声、浸提、回流提取等方式，参考中国药典的方法，试验首先采用了超声的方式，结果表明超声环境下黄酮苷不发生水解反应。对黄酮苷在乙醇溶液乙醇含量为30％，50％和70％，盐酸浓度5％，10％和12.5％时，氮气保护下水浴加热回流30min，60min，90min，120min和180min，进行交叉实验，并对比t-丁基-1,4-苯酚和抗坏血酸两种不同抗氧化剂的保护情况。结果表明，在没有抗氧化剂的情况下，槲皮素、山萘酚和黄岑素的回收率低于50％。抗坏血酸存在的情况下槲皮素、山萘酚和黄岑素的回收率没有得到明显的提高，t-丁基-1,4-苯酚加入后，槲皮素、山萘酚、黄岑素的回收率可以达到70％以上。乙醇溶液的浓度对结果没有明显影响，考虑到黄酮苷和苷元的溶解性差异，实验选择50％的乙醇进行实验，在该条件下盐酸浓度在10％，回流时间在120min时，各黄酮苷可完全水解。因此实验确定的提取水解条件为：10％盐酸，50％乙醇溶液，t-丁基-1,4-苯酚和氮气保护下，水解120min。在上述条件下加入10ng/ml黄酮苷元开展实验，研究发现水解过程中各苷元的损失率低于20％。表3抗氧化剂的保护作用考察结果2.2净化条件的选择液相色谱-质谱/质谱法进行定量测定时，通常采用液-液萃取净化，固相萃取净化，quechers等净化方式来降低背景的干扰，减少基质效应的影响，提高检测结果的准确性。本试验考察了c18和hlb两种类型固相萃取柱的净化情况(如图5)。在50％乙醇溶液(含10％盐酸，和0.5gt-丁基-1,4-苯酚)中加入100ng/ml的黄酮苷元标准溶液，取1ml加入9ml水，混匀并转移至各固相萃取柱中，分别采取10％，20％，30％，40％，50％甲醇溶液淋洗和甲醇洗脱实验，结果显示，在50％甲醇溶液中，各固相萃取柱中槲皮素，木犀草素，山萘酚，芹菜素和黄芩素均可以较好的被保留，10ml甲醇洗脱回收率均大于65％，其中槲皮素和黄芩素使用c18固相萃取净化回收率比hlb柱净化回收率低5％-10％。waters和biocomma的hlb柱比较，watershlb的稳定性略好，综合提取水解液情况，实验采用watershlb固相萃取柱开展方法学考察。2.3色谱条件的考察实验对比了mightysilrp-18，3μm，4.6×150mm和inertsilods-3，3μm，4.6×150mm两种类型的色谱柱，以甲醇或乙腈为有机相，0.15％甲酸溶液或水为水相对目标化合物进行分离。结果表明，相同色谱条件下，黄芩苷在mightysilrp-18为分离柱时谱峰峰形更好，信号提升约4倍。在相同色谱柱和流动相梯度洗脱程序下，甲醇为有机相时大部分化合物的信号响应和峰形好于乙腈有机相(其中野漆树苷、芦丁、木犀草苷在甲醇为流动相时信号响应提升3-5倍)，考虑到与前处理净化的有效衔接，实验采用甲醇为有机相对目标化合物进行分离。实验对比了相同色谱柱下甲醇有机相，水和0.15％甲酸溶液为水相的分离情况，以mightysilrp-18色谱柱为分离柱展开测试，在0.15％甲酸溶液中信号的峰形和响应好于水(其中黄芩素提升5倍)。实验采用0.15％甲酸溶液为流动相。因此实验采用在mightysilrp-18为分离柱，甲醇为有机相，0.15％甲酸溶液为流动相。2.4质谱条件的考察实验对各黄酮苷和苷元的标准溶液分别进行稀释，采用流动注射的方式在负离子模式下进行母离子全扫描，确定分子离子峰，再分别以待测化合物的分子离子为母离子，对其子离子进行全扫描。按照欧盟ec/657指令的要求，进行化合物定量确证时必须满足4个识别点(母离子1点，特征子离子1.5点/个)，选择两个特征子离子，其中以信噪比高、峰形好、干扰小的离子对作为定量离子对。以多反应监测负离子模式优化各种质谱参数，获得的最佳质谱条件参见表2。2.5方法的线性关系和定量限在确定实验条件下的分析结果中测定各苷元的谱峰面积，以标准品峰面积y为纵坐标，以待测物质量浓度x(％)为横坐标，绘制各化合物混合标准溶液工作曲线，各化合物的线性方程相关系数r2大于0.995。方法定量限(以s/n大于10计)0.005％(即0.05mg/g)。2.6方法回收率及精密度实验在确定的实验条件下对样品进行水解和净化分析，测得一个样品中含有0.017％的槲皮素、0.019％的木犀草素、0.006％的山萘酚、0.005％的芹菜素和0.009％的黄芩素，在该样品粉末中加入各黄酮苷(相当于水解后槲皮素和木犀草素含量为0.01％、0.02％和0.04％，山萘酚、芹菜素和黄芩素含量为0.005％、0.01％和0.02％)，进行3个浓度水平的添加回收实验，每个浓度水平取6个平行样。结果如表4所示，采用外标法定量，方法总体回收率70.4％-104％，相对标准偏差：4.0％-11.6％。表4样品中3个水平下的加标回收率和相对标准偏差(n＝6)回收率＝(测定值-空白)/添加浓度×100％.3结论本申请通过盐酸乙醇溶液水解山银花和金银花中的黄酮苷，并对黄酮苷元进行提取，hlb固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱法检测，外标法定量，实现了对山银花和金银花中代表性的黄酮苷(芦丁，木犀草苷，紫云英苷，野漆树苷和黄芩苷)的有效水解，和槲皮素，木犀草素，山萘酚，芹菜素和黄芩素含量的测定。该方法通过水解获得山银花和金银花苷元，并对其含量进行测定，可清晰的获得山银花和金银花中各黄酮类化合物的含量情况，对后续分析各苷元的含量与药物活性关系，品质研究，具有重要的辅助作用。当前第1页12