2019-nCoV双靶点抗体检测微球复合体组合、制备方法、试剂盒及试剂盒使用方法与流程

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及一种2019-ncov双靶点抗体检测微球复合体组合、制备方法、试剂盒及试剂盒使用方法。

背景技术：

核酸序列分析证明covid-19由新型冠状病毒(2019novelcoronavirus,2019-ncov)引起。2019-ncov为正链单链rna病毒，基因组长约30kb，两端为非编码区,中间为非结构蛋白编码区和结构蛋白编码区。非结构蛋白编码区主要包括开放读码框架(openreadingframe,orf)1a和orf1b基因，编码16个非结构蛋白(non-structuralproteins,nsp)，即nsp1～16。结构蛋白编码区主要编码刺突(spike,s)蛋白、包膜(envelope,e)蛋白、膜(membrane,m)蛋白和核衣壳(nucleocapsid,n)蛋白。深入了解2019-ncov基因组的结构和蛋白功能，将为2019-ncov相关的病毒溯源、复制增殖、致病免疫、药物与疫苗研发以及当前疫情的防控提供有力的支撑。

其中，s蛋白和n蛋白相对保守，在病毒的结构蛋白中所占比例最大，感染早期机体就能产生抗s蛋白和n蛋白的高水平抗体。其中，s蛋白介导病毒识别宿主细胞受体，促进膜融合，并诱导免疫反应产生中和抗体。n蛋白含有n1和n2表位，表位n1能刺激机体产生高亲和例的抗体，但没有中和活性。

技术实现要素：

在常规的抗体检测方法中，一般只使用一种抗原检测血液样本中的抗体，结果会导致一定程度的漏检。本发明提供一种分别偶联s蛋白和n蛋白的微球复合体组合，能够同时对s蛋白的抗体和n蛋白的抗体进行特异性结合，从而提高检出率，减少漏检发生。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种新型冠状病毒2019-ncov双靶点抗体检测的微球复合体组合，包括s微球复合体和n微球复合体，所述s微球复合体为偶联有新型冠状病毒2019-ncov的s蛋白的荧光微球，所述n微球复合体为偶联有新型冠状病毒2019-ncov的n蛋白的荧光微球，所述s蛋白的氨基酸序列如seqno:1所示，所述n蛋白的氨基酸序列如seqno:2所示。

一种新型冠状病毒2019-ncov双靶点i抗体检测的微球复合体组合的制备方法，包括以下步骤：

s1：利用基因工程手段克隆得到2019-ncov的s蛋白和2019-ncov的n蛋白；

s2：采用两步酰胺反应法分别将s蛋白和n蛋白与各自对应的荧光微球进行偶联。

一种新型冠状病毒2019-ncov双靶点抗体检测的试剂盒，包括所述的微球复合体组合、微球稀释液、pbst、生物素标记抗igg抗体、链霉素-藻红蛋白、鞘液。

一种新型冠状病毒2019-ncov双靶点抗体检测的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

s30：用所述微球稀释溶液分别稀释所述s微球复合体和所述n微球复合体，得到s荧光微球悬浮液和n荧光微球悬浮液，室温孵育后，分别加入待检测样品稀释液，室温下振荡，避光孵育，用pbst溶液洗涤；

s31：加入生物素标记抗igg抗体溶液，室温震荡，避光孵育，用pbst溶液洗涤；

s32：加入链霉素-藻红蛋白溶液，室温震荡，避光孵育，用pbst溶液洗涤；

s33：加入鞘液，重悬微球，采用流式点阵仪进行读数分析，得到每个待检测样品的sigg抗体的mesf值和nigg抗体的mesf值。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：

1、本发明制备的荧光微球能够对s抗体和n抗体进行双靶点检测，充分反映新型冠状病毒(2019-ncov)两种主要抗原刺激机体产生特异性抗体的效果。

2、应用制备的荧光微球进行流式荧光免疫检测，样本用量少，可以采用指尖采血，并且一次采血的样本量可以满足多次检测使用。灵敏度度高，检测样本血清稀释度超过1:50，结合mesf值能有效地检测出s抗体和n抗体。

3、本发明建立的流式荧光法检测2019-ncovs-igg或2019-ncovn-igg抗体的特异性良好。双靶点微球检测同时s-igg抗体n-igg抗体不会相互影响，无交叉反应。

4、本发明使用的双靶点抗体检测方法的批间变异系数更小，说明双靶点抗体检测更精确、更稳定，相对应单靶点抗体检测检出率更高。

附图说明

图1是本发明实施例提供的s基因扩增电泳图；

图2是本发明实施例提供的s蛋白纯化电泳图；

图3是本发明实施例提供的n基因扩增电泳图；

图4是本发明实施例提供的n蛋白纯化电泳图；

图5是本发明实施例提供的s蛋白的抗原性验证；

图6是本发明实施例提供的n蛋白的抗原性验证；

图7是本发明实施例提供的s-igg和n-igg检测方法特异性分析。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂盒材料。

主要试剂

2019-ncov样本及其s基因质粒和n基因质粒均来源于国家病毒资源库；

羧基化荧光编码微球、校正准试剂、鞘液、1.5ml磁力架均为湖北新纵科病毒疾病工程技术有限公司产品；乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)、琥珀酰亚氨基磺酸基生物素(sulfo-nhs-biotin)、2-[n-吗啉代]乙磺酸(mes)、叠氮钠购自美国thermofisher公司；链霉素-藻红蛋白(sa-pe)购自invitrogen公司；microplates96孔板购自洁特公司。

主要仪器

流式点阵仪novaht为湖北新纵科病毒疾病工程技术有限公司产品；酶标仪为teacon公司产品。

s蛋白的制备

s110：s基因克隆及扩增

根据公开的如seqno:3所示的s基因核苷酸序列，设计其上下游引物sf(如seqno:5)和sr(如seqno:6)，具体如下：

sf：5’-cgcggatcccgcgtgcagcccaccgagag-3’；

sr：5’-cccaagctttcagaagttcacgcacttgttct-3’；

应用上述sf/sr引物对s基因质粒进行pcr扩增，产物筛选、纯化、鉴定得到扩增后的s基因序列，扩增后条带如图1所示；

s111：载体构建：将s基因序列连接入pet32a(+)的bamhi位点和hindiii位点之间，n端加入atg标签，c端加6×his-tag标签和tag标签，连接后转入大肠杆菌dh5a中扩增，提取后得到重组质粒pet32a(+)s；

s112：将重组质粒pet32a(+)s转化至bl21(de3)大肠杆菌中表达，具体步骤如下：

s1220：将重组质粒转化bl21感受态菌体，得到bl21-pet32-sp菌株；

s1221：将bl21-pet32-sp菌株挑斑到10mllb培养基中，37℃220rpm培养16小时制备种子；

s1222：将种子液以千分之一的接种量接种到lb培养基中，37℃220rpm培养到od600为0.6-0.8之间时加入终浓度为0.8mm/l的iptg进行诱导表达14h；

s1223：离心收集菌体。

s113：s蛋白纯化，具体步骤如下：

s1130：在收集的菌体悬液中加入20倍体积的pbs溶液，并调ph值到8.0。冰浴于超声破碎仪上破碎10min，破碎条件400w超声1秒停4秒。菌体破碎液12000g离心10min(两次)得到上清；

s1131：用1倍体积的pbsph8.0溶液平衡镍柱后，用上述步骤s1130得到的上清过柱子两遍；

s1132：用10mm咪唑、1倍体积pbs、ph8.0的溶液除杂；

s1133：用300mm咪唑、1倍体积pbs、ph8.0洗脱，得到目的蛋白s蛋白(其氨基酸序列如seqno:1所示)，其纯化结果如图2所示。

n蛋白的制备

s120：n基因克隆及扩增

根据公开的如seqno:4所示的n基因核苷酸序列，设计其上下游引物nf(如seqno:7)和nr(如seqno:8)，具体如下：

nf：5’-cgcggatccatgtctgacaacggtccgcag-3’；

nr：5’-cccaagctttcaagcctgggtagagtcagcagaag-3’；

应用上述nf/nr引物对n基因质粒进行pcr扩增，产物筛选、纯化、鉴定得到扩增后的n基因序列，其扩增条带如图3所示；

s121：载体构建：将n基因序列连接入pet32a(+)的bamhi位点和hindiii位点之间，hindiii位点前加tga标签，连接后转入大肠杆菌dh5a中扩增，提取后得到重组质粒pet32a(+)n；

s122：将重组质粒pet32a(+)n转化大肠杆菌bl21感受态菌体中表达，具体步骤如下：

s1220：将重组质粒转化bl21感受态菌体，得到bl21-pet32-np菌株；

s1221：将bl21-pet32-np菌株挑斑到10mllb培养基中，37℃220rpm培养16小时制备种子；

s1222：将种子液以千分之一的接种量接种到lb培养基中，37℃220rpm培养到od600为0.6-0.8之间时加入终浓度为0.8mm/l的iptg进行诱导表达14h；

s1223：离心收集菌体。

s123：n蛋白纯化，具体步骤如下：

s1230：在收集的菌体悬液中加入20倍体积的pbs溶液，并调ph值到8.0。冰浴于超声破碎仪上破碎10min，破碎条件400w超声1秒停4秒。菌体破碎液12000g离心10min(两次)得到上清；

s1231：用1倍体积pbsph8.0溶液平衡镍柱后，再用步骤s1230得到的上清过柱子两遍；

s1232：用10mm咪唑、1倍体积pbs、ph8.0的溶液除杂；

s1233：用300mm咪唑、1倍体积pbs、ph8.0洗脱，得到目的蛋白n蛋白(其氨基酸序列如seqno:2所示)。其纯化结果如图4所示。

s蛋白和n蛋白的western-blot分析

1、实验操作

纯化的目的蛋白s蛋白或n蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)后，转印至偏二氟乙烯(pvdf)膜上；5％脱脂奶粉37℃封闭2h；1:10稀释的2019-ncov的阴、阳性血清，2019-ncov阴、阳性血清分别作为一抗，4℃孵育过夜；加入1:500稀释hrp的标记羊抗猪抗体，室温孵育1h；应用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(tmb)进行显色分析。

2、实验结果

s蛋白、n蛋白分别与对应的阳性血清发生特异性结合(如图5、6)，均出现与目的条带大小相符合的条带；s蛋白、n蛋白与对应的阴性血清不发生反应，无条带出现。说明本发明实施例通过克隆得到的s蛋白、n蛋白均具有抗原性，可用于荧光微球免疫学检测方法的建立。

偶联抗原的荧光微球的制备

取两种不同荧光色编码的磁性微球，针对不同s蛋白抗原、n蛋白抗原，采用羧基活化技术修饰荧光微球(可选用聚苯乙烯微球、乳胶微球或磁性微球)后，再采用两步酰胺反应法分别将s蛋白、n蛋白与修饰后荧光微球偶联，以分别获得s微球复合体(记为微球1)和n微球复合体(记为微球2)。其流程具体为：

s20：取两种不同荧光编码的磁性微球，s蛋白和n蛋白分别对应一种磁性微球；每种磁性微球用100mm，ph6.0，mes缓冲液洗涤后，过滤；

s21：配制mes+edc溶液：称取水溶性edc溶于100mmph6.0mes缓冲液，使得edc浓度为10mg/ml；

s22：微球活化：将步骤s20洗涤后的微球用步骤s21中配制的200ulmes+edc溶液重悬，37℃，1200rpm搅拌30min后，过滤，用100mmph6.0mes缓冲液洗涤；

s23：抗原溶液配制：100mmph6.0mes缓冲液稀释s蛋白溶液和n蛋白溶液，得到0.25mg/ml的s-mes溶液和0.5mg/ml的n-mes溶液，即为抗原溶液；

s24：将活化的微球与抗原溶液中偶联，以得到s微球复合体和n微球复合体；偶联条件为37℃1200rpm30min；其中，加入的活化微球至少为1×10⁷个；

s25：微球复合体用100mmph8.0tris-hcl缓冲液洗涤3遍，每次洗涤体积为400ul，最后一次洗涤37℃，1200rpm搅拌，封闭处理30min；最终重悬于1ml的磁珠保存液(1％bsa、0.1％p300、0.05％tw20、10mmph7.4pbs)中4℃保存。

荧光微球免疫学检测方法的建立

将上述微球复合体(微球1、微球2)恢复室温后，于96孔板上每孔加入50ul(2500个)微球和50ul待检测样品稀释液(取0.5ul血清稀释100倍)，室温避光震荡(500r/min)孵育30min；用200μlpbst(ph＝7.4)洗涤2次；每孔加入50ul以生物素标记的鼠抗人igg(h+l链)抗体(1:2000)；200ulpbst洗涤2次；每孔加入50ul1:1000稀释的链霉素-藻红蛋白(sa-pe)，在避光条件下，室温震荡(500r/min)孵育10min；200ulpbst洗涤2次；每孔加入100μl鞘液重悬，于novaht流式荧光微球检测仪进行读取等效可溶性荧光分子数(moleculesofequivalentsolublefluorochrome，mesf)。

应用灭活的2019-ncov的阳性血清、2019-ncov的阴性血清、pbs分别作为阳性对照、阴性对照、空白对照样品，进行上机检测读数分析偶联是否成功。

结果显示，阳性血清mesf值大于4000，且大于4倍阴性对照的mesf值，空白对照的mesf值小于200，说明该偶联方法和检测方法可行。

2019-ncov病毒igg抗体的荧光微球免疫学检测方法的条件优化一、正交试验

将生物素标记抗体(二抗)中生物素与二抗的质量比，sa-pe浓度，微球与血清反应的时间，微球与二抗孵育时间，四个因素各自设置三个位级(如表1)，进行l9(3⁴)正交试验确定试验条件。评价指标为：阳性血清mesf值(记为p)与阴性血清mesf值(记为n)的比值(记为η)达到最大，及阳性血清p值，且p值大于4000；优先考察η值。

如表2，s-igg抗体检测的最优条件为：生物素与二抗的质量比20:1，二抗稀释度为1:10000，sa-pe浓度为1μg/ml，微球、血清与二抗反应时间为45min。

如表3，n-igg抗体检测的最优条件为：生物素与二抗的质量比20:1，二抗稀释度为1:10000，sa-pe浓度为1μg/ml，微球、血清与二抗反应时间为45min。

因此，对应微球1和微球2的组合，能够使用相同的最佳的荧光免疫学检测条件对s-igg和n-igg进行检测。

表1

表2

表3

二、最佳血清稀释度选择

采用上述优化后的两组条件分别使用两种微球(微球1和微球2)，将灭活2019-ncov的阳性血清、2019-ncov的阴性血清分别进行1:100、1:200、1:400、1:800稀释。每组3个重复进行荧光微球免疫学检测，根据各组的mesf值确定血清最低稀释倍数。其中微球1能检测s-igg抗体，微球2能检测n-igg抗体，通过微球1和微球2的组合能够同时检测s-igg抗体和n-igg抗体。

2、实验结果：将阳性血清、阴性血清分别进行1:100、1:200、1:400、1:800梯度稀释。如表4显示：最佳稀释倍数为1:100，此时阳性血清mesf值大于2000，且大于阴性血清mesf值的4倍。

表4

三、最佳检测方法

1、检测方法步骤

s30：用涡旋震荡器振荡微球1或微球2，用pbs-tbn将微球稀释为工作浓度50个/ul后，50ul/孔(即2500个微球)加至microplates96孔板上，室温孵育30min后，加入待检测样品50ul/孔，室温下振荡避光孵育30min，每孔用pbst洗涤2次，每次洗涤200ul；

s31：加入生物素标记的鼠抗人igg抗体(生物素与二抗的质量比20:1，二抗稀释度为1:10000)50ul/孔，室温震荡(500r/min)避光孵育30min，用pbst洗涤2次，200ul/孔；

s32：加入60mg/ml的链霉素-藻红蛋白(sa-pe)50ul/孔，室温震荡(500r/min)避光孵育10min，用pbst洗涤2次，200ul/孔；

s33：加入鞘液100μl/孔，重悬微球，采用novaht流式点阵仪进行读数分析，得到每个孔对应的mesf。

2019-ncov病毒s-igg抗体及n-igg抗体的荧光微球免疫学检测方法的评价一、特异性验证

1、实验操作

为验证优化后荧光微球免疫学检测方法的特异性，应用该方法对2019-ncov病毒的血清阳性样本进行检测。待测样品有：64份2019-ncovs-igg阳性血清、1份2019-ncovs-igg阴性血清、44份2019-ncovn-igg的阳性血清、1份2019-ncovn-igg阴性血清。其中，2019-ncovs-igg阳性血清和阴性血清使用微球1检测，2019-ncovn-igg阳性血清和阴性血清使用微球2检测。根据各种样品血清分别分组，每组3个重复，根据不同血清的mesf值差异判断其特异性。

2、实验结果

如图7所示，建立的2019-ncov病毒s-igg抗体及n-igg抗体的检测方法，2019-ncov病毒s抗原或n抗原阳性样本的mesf值相对于其阴性样本的mesf值之比大于4。这表明所建立流式荧光法检测2019-ncovs-igg或n-igg抗体的特异性良好。且双靶点微球(微球1和微球2的组合)检测108份阳性血清中s-igg抗体和n-igg抗体时，mesf值的相关系数分别0.9682和0.9782，说明双靶点微球检测同时s-igg抗体n-igg抗体不会相互影响，无交叉反应。

二、重复性验证

1、实验操作

各取2019-ncovs的4份阳性血清(采用微球1检测)、2019-ncovn的4份阳性血清(采用微球2检测)，以及2份阴性血清分用于2种微球的阴性对照，每份血清做16个重复，计算其变异系数(cv)评价该方法的批内精密度。

上述同样的方法，其中每份血清16个重复，在不同时间做3次，计算cv评价该方法的批间精密度。

2、实验结果

2019-ncovs-igg、2019-ncovn-igg、及2019-ncovsn-igg的抗体荧光微球免疫学检测方法的批内变异系数(cv)分别为2.7％～10.9％、3.9％～9.7％，3.2％～9.5％，批间cv分别为:2.1％～9.5％、3.6％～14.6％、1.5％～2.4％。符合指导原则批内cv小于10％、批间cv小于15％的要求，则表明本研究建立的检测方法重复性较好。且双靶点抗体(2019-ncovsn-igg)检测的批间变异系数更小，说明双靶点抗体检测更精确、更稳定。

三、检出率

1、实验操作

各取98份阳性血清(其中2019-ncovs-igg阳性血清75份，2019-ncovn-igg阳性血清68份，2019-ncovs-igg和2019-ncovn-igg均阳性的血清35份)、1份阴性血清，分别采用微球1、微球2及微球1和2的组合进行荧光微球免疫学检测，其中每份血清做3个重复，计算检出率，检出率＝100％×检出例/总检例。

2、实验结果

采用微球1、微球2、及微球1和2的组合进行荧光微球免疫学检测的检出例依次69例、63例和90例，检出率依次为69.4％、64.3％和92.2％。这说明本发明提供的微球组合能够显著提供血清中2019-ncovs-igg和/或2019-ncovn-igg的检出率，双靶点的检测方法更加灵敏。

以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110>湖北新纵科病毒疾病工程技术有限公司

<120>2019-ncov双靶点抗体检测微球复合体组合、制备方法、试剂盒及试剂盒使用方法

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>223

<212>prt

<213>s蛋白(artificialsequence)

<400>1

argvalglnprothrgluserilevalargpheproasnilethrasn

151015

leucyspropheglygluvalpheasnalathrargphealaserval

202530

tyralatrpasnarglysargileserasncysvalalaasptyrser

354045

valleutyrasnseralaserpheserthrphelyscystyrglyval

505560

serprothrlysleuasnaspleucysphethrasnvaltyralaasp

65707580

serphevalileargglyaspgluvalargglnilealaproglygln

859095

thrglylysilealaasptyrasntyrlysleuproaspaspphethr

100105110

glycysvalilealatrpasnserasnasnleuaspserlysvalgly

115120125

glyasntyrasntyrleutyrargleuphearglysserasnleulys

130135140

prophegluargaspileserthrgluiletyrglnalaglyserthr

145150155160

procysasnglyvalgluglypheasncystyrpheproleuglnser

165170175

tyrglypheglnprothrasnglyvalglytyrglnprotyrargval

180185190

valvalleuserphegluleuleuhisalaproalathrvalcysgly

195200205

prolyslysserthrasnleuvallysasnlyscysvalasnphe

210215220

<210>2

<211>419

<212>prt

<213>n蛋白(artificialsequence)

<400>2

metseraspasnglyproglnasnglnargasnalaproargilethr

151015

pheglyglyproseraspserthrglyserasnglnasnglygluarg

202530

serglyalaargserlysglnargargproglnglyleuproasnasn

354045

thralasertrpphethralaleuthrglnhisglylysgluaspleu

505560

lyspheproargglyglnglyvalproileasnthrasnserserpro

65707580

aspaspglnileglytyrtyrargargalathrargargilearggly

859095

glyaspglylysmetlysaspleuserproargtrptyrphetyrtyr

100105110

leuglythrglyproglualaglyleuprotyrglyalaasnlysasp

115120125

glyileiletrpvalalathrgluglyalaleuasnthrprolysasp

130135140

hisileglythrargasnproalaasnasnalaalailevalleugln

145150155160

leuproglnglythrthrleuprolysglyphetyralagluglyser

165170175

argglyglyserglnalaserserargserserserargserargasn

180185190

serserargasnserthrproglyserserargglythrserproala

195200205

argmetalaglyasnglyglyaspalaalaleualaleuleuleuleu

210215220

aspargleuasnglnleugluserlysmetserglylysglyglngln

225230235240

glnglnglyglnthrvalthrlyslysseralaalaglualaserlys

245250255

lysproargglnlysargthralathrlysalatyrasnvalthrgln

260265270

alapheglyargargglyprogluglnthrglnglyasnpheglyasp

275280285

glngluleuileargglnglythrasptyrlyshistrpproglnile

290295300

alaglnphealaproseralaseralaphepheglymetserargile

305310315320

glymetgluvalthrproserglythrtrpleuthrtyrthrglyala

325330335

ilelysleuaspasplysaspproasnphelysaspglnvalileleu

340345350

leuasnlyshisileaspalatyrlysthrpheproprothrglupro

355360365

lyslysasplyslyslyslysalaaspgluthrglnalaleuprogln

370375380

argglnlyslysglnglnthrvalthrleuleuproalaalaaspleu

385390395400

aspasppheserlysglnleuglnglnsermetserseralaaspser

405410415

thrglnala

<210>3

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<212>dna

<213>s基因(artificialsequence)

<400>3

cccaagcttatgcgcgtgcagcccaccgagagcatcgtgcgcttccccaacatcaccaac60

ctgtgccccttcggcgaggtgttcaacgccacccgcttcgccagcgtgtacgcctggaac120

cgcaagcgcatcagcaactgcgtggccgactacagcgtgctgtacaacagcgccagcttc180

agcaccttcaagtgctacggcgtgagccccaccaagctgaacgacctgtgcttcaccaac240

gtgtacgccgacagcttcgtgatccgcggcgacgaggtgcgccagatcgcccccggccag300

accggcaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgcgtgatc360

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