一种凝集素探针组合在基于尿蛋白糖型鉴定黑叶猴妊娠方面的应用的制作方法

本发明涉及一种鉴别黑叶猴是否处于妊娠期的方法。
背景技术：
：在珍稀野生动物保护方面，由于栖息地的破坏和碎片化，人们通过圈养与散养等人为参与的方式扩大种群数量，将濒危物种就地保护或者迁移到合适的环境中，为濒危物种野外放归提供可能。很多濒危野生动物自身繁殖能力较差，比如云豹，在不熟悉彼此的情况下，雄豹会伤害甚至杀掉雌性。因此，人们也同样尝试利用人工授精、胚胎转移等辅助生殖技术提高物种的繁殖率。这些方法还提供了在野生动物和圈养动物之间交换遗传物质(精子或胚胎)的可能性，帮助维持了遗传多样性，对物种的管理有很大的帮助。但濒危物种繁殖成功率仍然较低，人们亟需了解动物生理特性，掌握有效的妊娠诊断手段。传统用于动物的妊娠诊断的技术包括直肠检查法、阴道检查法、影像诊断法、试情法、免疫学诊断法、激素水平测定法等。但因抓捕动物过程会让动物产生强烈应激，伤害较大，或激素水平波动较大，需要较长的监测周期。需要一种更加快速、有效的方法打破传统思路进行妊娠诊断。黑叶猴(trachypithecusfrancoisi)为灵长目猴科动物,是我国叶猴中最为常见的一种,全身包括手脚的体毛均为黑色,背部较腹面长而浓密,所以又被叫做乌猿。分布于越南和我国贵州、广西,主要生活在石灰岩丘陵地区的峭壁、溶洞、峡谷等复杂地形,由于分布区狭窄,生境严酷,种群数量稀少,现已被国际自然和自然资源保护联盟(iucn)列为严重受危种,在我国被列为国家一级重点保护野生动物。由于发情期外形上无明显变化，性皮红肿现象不明显，腹部肥大,即使妊娠后期,也很难从体态上观察到明显变化，加上生性胆小，栖息地地势复杂等原因，导致人类难以接近，研究困难。现阶段也没有能尽早确诊珍稀怀孕的简单易行的方法，不能及时对妊娠母猴进行保护，导致人工饲养繁殖过程中流产死产现象严重,极大的影响了繁殖率,不利于人工种群的发展和移地保护。多年来的研究进展表明，由于基因的数量有限，蛋白质的修饰是调节其功能的重要因素。糖基化是翻译后修饰最丰富和复杂的形式，对蛋白质的折叠、分配、稳定性和活性有显著的影响，是在细胞表面存在的蛋白质和脂质性质的一个重要调节剂。随着糖组学的迅速发展，寻找个体妊娠与否甚至是异常妊娠与否的生物标志物，以及分析两性之间糖链的差异，是随着新技术诞生，应运而生的新的探索方向。糖组学可以被定义为对所有糖类(单糖、低聚糖、多聚糖及其修饰)的全面阐释。单糖是糖链的基本构件，哺乳动物糖链仅由十种核心单糖构成。在糖苷酶和糖基转移酶参与的几种酶促反应条件下，基本构件组成多样的糖链结构。真核蛋白质糖基化通常是以糖苷键与丝氨酸/苏氨酸残基连接形成的o-糖链，与天冬胺酸残基相连形成的n-糖链。哺乳动物大于50％的蛋白质有糖链修饰，糖蛋白出现在所有哺乳动物的体液当中在不同的物种和系统发育之间进化的糖链存在差异，这是免疫系统在区分自我和非自我之间的重要标志。尿液由于蛋白质成分相对简单，采集方便无创且具有非常重要的临床意义等特点而受到越来越多的关注。凝集素芯片技术具有覆盖率高、操作简便、实验性能快速的特点，可根据凝集素鉴定具体多糖结构的特点进行设计，提取尿液中的蛋白质，在不释放蛋白质的情况下，对生物样本中的n-糖链和o-糖链同时定量分析。如利用凝集素芯片对患有绒毛膜癌的妊娠个体进行糖链分析寻找新的癌症指标，检测包括人、公猪、公牛、山羊和兔子物种哺乳动物精子表面糖链的差异，这些努力都为基础和临床的诊断提供了更多支持。技术实现要素：本发明的目的在于于获得一种简便、准确鉴别黑叶猴妊娠的方法。申请人通过对黑叶猴的尿液糖蛋白糖链进行大量的分析、实验，筛选出一种特定凝集素，可用于快速鉴别尿液中特定糖蛋白糖链，以此有效鉴别黑叶猴的妊娠状况。该特定凝集素探针组合是pha-e、stl、ptl-i、pna和sna；鉴别依据为：当样本检测结果为pha-e、stl表达上调，且ptl-i、pna和sna表达下调，则表明相应黑叶猴在取样时处于妊娠期。这里，相关测试产品给出“鉴别依据”的具体形式不限，例如：随附的产品说明书中记载上述条件；涉及到软件的，则还可由相应的算法体现该依据。该凝集素探针组合可用于制备基于尿蛋白糖链鉴别黑叶猴妊娠的试剂盒，试剂盒中的凝集素芯片上点制所述凝集素探针组合。进一步的，凝集素芯片上可以增加凝集素rca120和mpl作为内参。利用该凝集素探针组合，基于尿蛋白糖型鉴别黑叶猴妊娠的方法，包括以下步骤：1)取待检黑叶猴尿液样本，进行蛋白质富集、荧光标记；2)取凝集素芯片，并利用封闭缓冲液对其完成封闭；所述凝集素芯片至少点制有以下五种凝集素:pha-e、stl、ptl-i、pna和sna；3)将荧光标记的尿液蛋白与孵育缓冲液混匀，然后与凝集素芯片完成孵育；4)扫描凝集素芯片，分析得出对应于所述三种凝集素的糖链表达是否发生显著变化:若样本检测结果为pha-e、stl表达上调，且ptl-i、pna和sna表达下调，则表明相应黑叶猴在取样时处于妊娠期。本发明的优点：对于黑叶猴妊娠状况的鉴别，快速、简便、准确，实现成本较低。附图说明图1最初设计的凝集素芯片上凝集素探针布局图；图2妊娠成年雌性(p)，非妊娠成年雌性(np)尿液蛋白凝集素芯片荧光检测结果；其中(a)对应于妊娠黑叶猴，(b)对应于非妊娠黑叶猴；图3从图2中选取的两个样本(以一个妊娠雌性f-3，一个非妊娠雌性f-7为例)，标示出上述5种凝集素所在芯片上的位置，以及亮度比较。具体实施方式以下详细介绍本申请的相关实验及分析，发明人具体的研发过程不限于此。1.实验部分1.1试剂与材料甘氨酸，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，吐温-20和蛋白酶抑制剂均购自美国sigma-aldrich公司。牛血清白蛋白(bsa)购自德国merck公司。cy3荧光均购自美amerhsma公司。其他化学试剂均为分析纯级别，在使用前没有经过进步纯化。所有实验用水都为经milli-q50纯水系统(美国millipore公司)处理的超纯水。sephadexg-25柱脱盐购自美国gehealthcare公司。芯片杂交盒购自美国bio-rad伯乐公司。其它常见玻璃器皿均为国产。37种凝集素1.2实验仪器电热鼓风干燥箱:天津泰斯特公司；高压灭菌锅:日本tomy公司；超速冷冻离心机5804r:德国eppendorf公司；微量核酸蛋白测定仪:德国implen公司；生物芯片扫描仪4000b:美国axon公司；芯片点样仪:博奥晶芯smartarrayer48点样仪；芯片杂交箱hl-2000:美国uvp公司。1.3研究对象和尿液采集黑叶猴尿液样本取自广西省梧州市黑叶猴保护研究中心。成年雌性黑叶猴共15只，其中妊娠雌性5只，非妊娠雌性10只，地点相同，取食相似的性成熟的黑叶猴。表2：黑叶猴尿液样本信息编号雌性(f)/雄(m)妊娠(p)/未妊娠(np)样本量/ml蛋白浓度mg/mlf-1fp504.83f-2fp3210.18f-3fp306.41f-4fp4326.61f-5fp599.00f-6fnp3717.59f-7fnp2812.17f-8fnp307.46f-9fnp3012.21f-10fnp353.89f-11fnp265.99f-12fnp584.92f-13fnp319.66f-14fnp306.92f-15fnp258.921.4尿液混合及荧光标记为了消除采集时间上的差异，取相同个体不同时间收集的样品进行混样，进行混合，用3kd超滤膜滤过样本进行蛋白质富集，然后用brandford法蛋白定量。混合样本经cy3荧光染料标记后用sephadexg-25除盐柱去掉游离荧光。标记好的蛋白准备用于凝集素芯片孵育。1.5凝集素芯片和数据分析1.51凝集素芯片的制备将玻片用无水乙醇清洗三次，每次10min。离心机中甩干玻片。浸泡入250ml10％naoh溶液中，避光，摇床上反应12h后超声15min。然后用超纯水清洗四次，每次2min,无水乙醇清洗两次，每次2min。甩干。再将玻片浸泡到200ml10％gpts溶液中，避光，摇床上孵育反应3h,对玻片进行环氧化修饰。超声清洗15min,无水乙醇清洗三次，每次10min。甩干后将玻片置于37℃真空干燥箱中，干燥3h。最后将环氧化玻片放置于室温干燥器中保存备用。设计凝集素芯片矩阵(图1)，选用1mg/mlbsa作阴性质控，cy3荧光染料标记的bsa作位置标记，与37种凝集素共同构成12×10矩阵，每种凝集素重复点样3次，每张芯片上重复4个矩阵。在384孔板中按矩阵设计顺序依次加入配制好的点样液，使用博奥晶芯48点样仪的针点系统，在环氧修饰片基上点制芯片。在室温且湿度为55％-65％的环境中孵育6h后，37℃真空干燥芯片，使凝集索固定于芯片上。将制备好的凝集素芯片放置于4℃干燥器，避光保存，备用。1.52凝集素芯片的孵育及数据分析(1)凝集素芯片的封闭将点制好的凝集素芯片从4℃干燥器中取出，回温，首先用pbst、pbs各清洗玻片一次，每次5min,离心甩干。将凝集素芯片与700μl封闭缓冲液在芯片杂交盒中孵育，25℃旋转反应1h。封闭结束后用pbst、pbs各清洗玻片两次，每次5min,甩干。用genepix4000b芯片扫描仪扫描封闭后芯片，检查封闭效果。(2)尿液样本的凝集素芯片检测将荧光标记的尿液蛋白6μg与孵育缓冲液混匀(比例约1:9)，每个样品混匀后在盖玻片均匀加入120μl,盖上封闭后的凝集素芯片，于芯片杂交仪中25℃避光旋转孵育3h。孵育结束后用pbst、pbs各清洗玻片两次，每次5min,离心甩干。(3)数据的扫描与分析使用genepix4000b芯片扫描仪扫描芯片，结果如图2所示。genepix7.0软件从芯片扫描结果图圈点分析后，导出gpr文件，根据其中的数据信息进行分析。原始数据中小于一倍背景标准偏差的值去掉，每张芯片上每个样本三个重复点的有效值再取平均值(as)，每组平均值表示为组内每个样本平均值(as)的均值(ag)标准偏差(sdg)。2.结果部分利用凝集素芯片分别对妊娠成年雌性、非妊娠成年雌性尿液进行检测，通过专业软件获取芯片数据并归一化处理后，将两组结果进行比较，即每个凝集素对应的归一化后荧光强度(nfi)在妊娠组比非妊娠组得到fold-change值。我们认为fold-change>1.5和fold-change<0.67为成年妊娠雌性相较于非妊娠雌性在尿液中上调和下调表达的糖蛋白糖链。并将妊娠组与非妊娠组上调和下调的凝集素应用spss20进行非参数kruskal-wallis检验，挑选出显著上调和下调凝集素(p<0.05)(1)37种不同的凝集素对各组尿液糖蛋白糖链均有不同程度的识别，说明在成年妊娠雌性和非成年妊娠雌性尿液中，糖蛋白糖链表达有差异。(2)相对于未妊娠黑叶猴，2种凝集素pha-e和stl识别的糖链在妊娠黑叶猴尿液中表现为上调且均为显著上调；4种凝集ptl-i、pna、sna和ltl表现下调，其中ptl-i、pna、sna表现为显著下调。表3:妊娠及非妊娠成年雌性黑叶猴尿液糖蛋白糖链谱的表达表中数据表示凝集素芯片结果中凝集素对应妊娠nfi相对非妊娠nfi的fold-change值。p为所有黑叶猴成年妊娠雌性，np为所有黑叶猴成年非妊娠雌性。基于以上分析结果，申请人后期还进行了多次个体采集、检测，通过一定时间的观察验证，均与表3结果相符。经过对表中数据的筛选，选定nfi的foldchange大于1.5,小于0.67且p<0.05的凝集素作为探针，rca120和mpl为内参(在任意两组的样本比较中，ratio值介于1.00-1.11之间，认为该凝集素所识别的糖链在两组样本中无差异)设计了一套用于鉴定黑叶猴妊娠的凝集素探针组合。表4：鉴定妊娠的凝集素探针组合lectinp/nppha-e↑stl↑ptl-i↓pna↓sna↓rca120-mpl-p:妊娠黑叶猴；np:未妊娠黑叶猴；↑：表达上调；↓：表达下调；-：无显著差异。nfi:荧光参考值利用本发明给出的凝集素探针组合，在实际对个体进行检测时，可预先给出以上五种凝集素表达水平的参考阈值，或者选取已知未妊娠的黑叶猴样本作为对照样本，来判定表达上调、下调情况。每次测定建议收集相同环境下的非妊娠黑叶猴的样本作为对照样本，尽可能排除环境因素，将测定的样本重复三次，取均值，来判定表达上调、下调情况。未妊娠黑叶猴的样本参考荧光信号值如下:妊娠上调:pha-e：0.025362；stl：0.045465妊娠下调:ptl-i：0.008139；pna：0.012927；sna：0.012345。当前第1页12