一种富硒植物干粉中硒形态测定的方法与流程

本发明涉及一种富硒植物干粉中硒形态测定的方法，属于分析测试领域。

背景技术：

硒是人体的一种必需微量元素，被列为15种营养素之一。硒有抗氧化，抗肿瘤，抗炎症，抗衰老等作用。多个国家和地区都处于饮食缺硒状态，我国有七成地区处于缺硒地带，据报道许多成人硒日摄入量低于中国营养学会推荐剂量。人体中硒缺乏时，会引起许多病变，因此日常补硒非常必要。现在开发安全有效的补硒产品已经成为我国富硒保健产品的重点，许多补硒产品的利用价值不仅与硒含量有关还与硒的化学形态相关。自然界中的硒主要以无机硒、有机硒和单质硒三种形式存在。不同形态的硒的功能性也有差异，其中无机硒的毒性较大，且生物有效低。有机硒由于其低毒性，高生物利用度的特点，被认为是优质硒。

植物是硒生态链不可缺少的关键环节，它们可以吸收无机硒，将其转化为有机硒化合物，因此植物被认为是天然有机硒合成的生化工厂。植物中的有机硒占硒总量80％以上，主要由硒蛋白和以硒代氨基酸及其衍生物形式存在的小分子硒化物组成，植物源含硒化合物已经成为获取有机硒的重要途径。因此利用富硒农作物转化有机硒，建立日常食物摄取的硒营养模式，已成为目前功能性食品的研究热点之一。

由于植物样品基体复杂，含硒化合物形态多样，不稳定，且含量非常低，因此在对植物样品进行硒形态分析时，预处理的方法既要考虑到较高的回收率，也要保持初始的形态不会发生转变。水提取法和弱酸提取法主要适用于小分子含硒化合物的提取，在提取过程中可能会出现硒形态转变或有机硒的降解。而对于结合在蛋白上的含硒化合物，酶解法不但能够有效地将其释放，而且温和的提取条件可以更小程度的减少形态的转化。目前关于植物源有机硒硒形态分析测定方法并不完善，其中对样品进行预处理是主要的技术难点。现有的硒形态分离方法，反应时间长，容易导致硒形态的转化；并且所选用的蛋白酶成本高，在应用中推广受限。所以开发一种成本低，效率高的富硒植物干粉预处理以及硒形态分析方法非常必要。

技术实现要素：

[技术问题]

目前关于植物源有机硒硒形态分析测定方法并不完善，其中对样品进行预处理是主要的技术难点。现有的硒形态分离的方法，反应时间长，容易导致硒形态的转化；并且所选用的蛋白酶成本高，在应用推广中受限。

[技术方案]

针对上述问题，本发明提供了一种测定富硒植物干粉中硒形态的方法，在对富硒植物干粉预处理的过程中，本发明采用了双酶先后酶解的方法，双酶为风味蛋白酶和蛋白酶e，通过二次酶解进一步对沉淀中残余的含硒物质进行提取，保证含硒化合物的提取效果和稳定性。本发明的预处理方法具有提取效率高，时间短，操作简单等优点。

本发明提供了一种测定富硒植物干粉中硒形态的方法，技术方案如下：

(1)样品中游离态的硒物质的提取：取富硒植物干粉样品，加水溶解进行提取并取上清，得到上清液1；

(2)样品中结合态的硒物质的酶解提取：取步骤(1)离心后的沉淀物，将其溶于含十二烷基硫酸钠(sds)的提取溶液中，分步依次加入风味蛋白酶、蛋白酶e，进行酶解，酶解后离心取上清，得到上清液2；

(3)样品二次酶解：取步骤(2)离心后的沉淀物重复步骤(2)中的操作进行酶解，酶解后离心取上清，得到上清液3。

(4)样品检测：收集各步得到的上清液过膜，浓缩后的溶液注入凝胶渗透色谱柱(gpc)系统进行分离，收集小分子馏分，浓缩后测定各硒形态。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中称取富硒植物干粉样品，加水溶解后利用超声辅助提取，超声结束后离心取上清，得到上清液1。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)富硒植物干粉与水的质量体积比为1：(50-70)，超声时温度控制在35-50℃，在30～50khz超声15-25min。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述的提取溶液为去离子水或ph值为7.5的20mmtris-hcl溶液。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中sds的加入量为提取溶液的0.05-0.15wt％。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述经超声后的富硒植物干粉沉淀物与含sds的提取溶液的质量体积比1：(50-70)。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中风味蛋白酶和蛋白酶e与所述经超声后的富硒植物干粉沉淀物质量比例均为1：(10-40)，酶解温度为40-50℃，酶解时间4-5小时。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中风味蛋白酶和蛋白酶e添加顺序为先加风味蛋白酶酶解4-5小时，再加蛋白酶e继续酶解4-5小时。

在本发明的一种方式中，步骤(4)中收集各步得到的上清液过膜，浓缩后的溶液注入凝胶渗透色谱柱(gpc)系统进行分离，收集小分子馏分，浓缩后测定各硒形态。

在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中所述gpc分离的具体参数为：色谱柱填料：superdex75凝胶过滤填料；洗脱剂：去离子水或ph值为7.5的20mmtris-hcl溶液；流速：1.0ml/min。

在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中浓缩后采用高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱仪(hplc-hg-afs)或高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱仪(hplc-icpms)测定各硒形态。

在本发明的一种实施方式中，步骤(4)所述hplc-hg-afs测定各硒形态含量的方法为：色谱柱：hamiltonprp-x100阴离子交换柱(250mm×4mm，10μm)；流动相：流动相a：40mmol/l(nh4)2hpo4，ph＝6.0；流动相b：60mmol/l(nh4)2hpo4；进样体积：100μl；流速：1.0ml/min。

在本发明的一种实施方式中，步骤(4)所述hplc-icpms测定各硒形态含量的方法为：thermoscientifichypersilgoldc8(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：20mmol/l磷酸二氢钾(含0.05wt.％七氟丁酸，3wt.％甲醇)；进样体积15μl；流速：1.2ml/min。

[有益效果]：

(1)本发明在进行游离硒的超声法提取时，对富硒植物干粉紧密的纤维组织结构进行了破坏，为酶解提供了较好的条件。sds的加入破坏了富硒植物干粉中的蛋白结构，蛋白结合态含硒物质更有利于被提取。

(2)本发明选择的蛋白酶为风味蛋白酶和蛋白酶e，这两种酶与文献报道经常使用的蛋白酶k和蛋白酶xiv便宜，降低了样品的预处理成本。

(3)本发明中的酶解手段采用双酶先后酶解的方法，二次酶解进一步对沉淀中残余的含硒物质进行提取，保证含硒化合物的提取效果和稳定性。本发明具有提取效率高，时间短，操作简单等优点。

附图说明

图1为实施例1中不同形态硒标准溶液色谱图。

图2为对比例1中不同酶种类在不同酶解时间条件下硒提取率。

图3为对比例2中不同加酶方式下硒提取率。

图4为对比例3中不同酶解次数下硒提取率。

具体实施方式

【实施例1】

(1)取0.1g碎米荠干粉溶于5ml去离子水中，控制温度为40℃，40khz超声15min，超声结束后将得到的混合物4000rpm离心15min后取上清，得到上清液1；

(2)取1mg十二烷基硫酸钠(sds)溶于7mlph7.5的tris-hcl中，取全部步骤(1)离心后的沉淀物溶解在其中，先向其中加10mg风味蛋白酶(flavourzyme500mg，诺维信生物技术有限公司)搅拌酶解4h，后再加10mg蛋白酶e(pronasee，typexiv，≥3.5units/mg，sigma-aldrich公司)搅拌酶解4h，酶解温度为40℃，酶解后4000rpm离心15min取上清，得到上清液2；

(3)取步骤(2)离心后的沉淀物重复步骤(2)中的操作进行酶解，酶解后4000rpm离心15min取上清，得到上清液3；

(4)收集各步得到的上清液经0.45μm尼龙滤头过滤，旋蒸浓缩后的溶液注入gpc系统进行分离，收集小分子馏分。gpc分离的具体参数为：色谱柱填料：superdex75凝胶过滤填料；洗脱剂：去离子水或ph值为7.5的20mmtris-hcl溶液；流速：1.0ml/min。真空浓缩后采用hplc-hg-afs测定各硒形态含量。不同形态硒标准溶液色谱图见图1，图1为五种硒标样(secys2、mesecys、se(iv)、semet、se(vi))的色谱图。通过外标法计算碎米荠中五种硒形态含量，计算公式为：

计算得到本实施例中碎米荠中硒提取率为83.8％。

其中，hplc-hg-afs的测试条件为：

高效液相色谱条件

【实施例2】

(1)取0.1g甘蓝干粉溶于5ml去离子水中，控制温度为40℃，40khz超声25min，超声结束后将得到的混合物4000rpm离心15min后取上清，得到上清液1；

(2)取1mgsds溶于7mlph7.5的tris-hcl中，取步骤(1)离心后的沉淀物溶解在其中，先向其中加10mg风味蛋白酶搅拌酶解4h，后再加10mg蛋白酶e搅拌酶解4h，酶解温度为40℃，酶解后4000rpm离心15min取上清，得到上清液2；

(3)取步骤(2)离心后的沉淀物重复步骤(2)中的操作进行酶解，酶解后4000rpm离心15min取上清，得到上清液3；

(4)收集各步得到的上清液经0.45μm尼龙滤头过滤，旋蒸浓缩后的溶液注入gpc系统进行分离，收集小分子馏分，浓缩后采用hplc-afs测定各硒形态含量，通过外标法计算各硒形态含量，测定和计算的方法均同实施例1，得到甘蓝干粉中硒提取率为85.1％。

【实施例3】

(1)取0.1g西兰花干粉溶于7ml去离子水，控制温度为40℃，40khz超声15min，超声结束后将得到的混合物4000rpm离心15min后取上清，得到上清液1；

(2)取1mgsds溶于7mlph7.5的tris-hcl中，取步骤(1)离心后的沉淀物溶解在其中，先向其中加10mg风味蛋白酶搅拌酶解5h，后再加10mg蛋白酶e搅拌酶解5h，酶解温度为40℃，酶解后4000rpm离心15min取上清，得到上清液2；

(3)取步骤(2)离心后的沉淀物重复步骤(2)中的操作进行酶解，酶解后4000rpm离心15min取上清，得到上清液3；

(4)收集各步得到的上清液经0.45μm尼龙滤头过滤，旋蒸浓缩后的溶液注入gpc系统进行分离，收集小分子馏分，浓缩后采用hplc-afs测定各硒形态含量，通过外标法计算各硒形态含量，测定和计算的方法均同实施例1，得到西兰花干粉中硒提取率为84.9％。

【对比例1】

为了分离出碎米荠中全部的硒，将超声提取后的游离硒的沉淀物进一步酶解以获得其中的结合态硒。植物中的有机硒一般以结合态的形式存在，常用的提取方法有酸提法，水提法，酶提法等。文献中证实酶提法有着更好的效果，所以对比例采用酶提法对碎米荠中的结合态硒进行分离，选择了五种酶探究其在不同时间对植物中硒的分离效率。

(1)取0.1g碎米荠干粉溶于5ml去离子水中，控制温度为40℃，40khz超声25min，超声结束后将得到的混合物4000rpm离心15min后取上清，得到上清液1；

(2)取步骤(1)离心后全部沉淀物加入5ml去离子水搅拌，温度40℃下分别加入10mg蛋白酶e，蛋白酶k,中性蛋白酶，风味蛋白酶，复合蛋白酶各搅拌2h,4h,8h,10h,12h,16h,24h。将得到的混合物4000rpm离心15min后取上清，收集各步得到的上清液经0.45μm尼龙滤头过滤后使用hplc-hg-afs测定，探究不同酶在不同时间对提取效率的影响。

图2为对比例1中不同酶种类在不同酶解时间条件下硒提取率。从图2中可以看出蛋白酶e的提取效率最高，蛋白酶k的提取效率次高，其余三种酶的提取效率一般。在8h时几种酶的提取效率都有明显的提高，在随后的时间段变化比较平稳。另外随着时间超过12h，四价硒的峰消失，可能随着时间的增加，四价硒向六价硒进行了转化，无法有效分别分离出的硒的种类。蛋白酶e和蛋白酶k对硒的提取效率高但对于硒代蛋氨酸的分离效果不佳，并且两种酶的价格都比较高。风味蛋白酶对硒代蛋氨酸有着明显的提取效果，并且价格较低廉可以弥补蛋白酶e的不足之处。出于以上的考虑，采用蛋白酶e和风味蛋白酶的复合作用搅拌8h来对硒形态分离效率进行探究。

【对比例2】

加酶方式对硒提取效率的影响：

(1)取0.1g碎米荠干粉溶于5ml去离子水中，控制温度为40℃，40khz超声25min，超声结束后将得到的混合物4000rpm离心15min后取上清，得到上清液1；

(2)取步骤(1)得到的离心后全部沉淀物，加入5ml去离子水，在温度40℃条件下采用以下三种加酶方式提取：

1)先加5mg蛋白酶e搅拌4h后再加5mg风味蛋白酶搅拌4h；

2)一同加入5mg蛋白酶e，5mg风味蛋白酶搅拌8h；

3)先加入5mg风味蛋白酶搅拌4h，后再加入5mg蛋白酶e搅拌4h。

经三种方式提取后，将得到的混合物4000rpm离心15min取上清，收集各步得到的上清液经0.45μm一次性尼龙滤头过滤后使用hplc-hg-afs测定。

图3为对比例2中不同加酶方式下硒提取率。由图3可知，双酶法比单酶作用有更好的提取效率，其中先加风味蛋白酶后加蛋白酶e的方法提取效率最高，可能由于随着时间的增加，酶的活性有所下降，及时添加酶提高了提取效率，两种酶的加入先后次序不同也会对提取效率造成影响，这可能是由于两种蛋白酶酶切位点不同先后的复合作用达到了更好的效果。

【对比例3】

酶解次数对硒提取效率的影响为：

(1)取0.1g碎米荠干粉溶于5ml去离子水中，控制温度为40℃，40khz超声15min,超声结束后将得到的混合物4000rpm离心15min后取上清，得到上清液1；

(2)取1mgsds溶于7mlph7.5的tris-hcl中，取步骤(1)离心后的全部沉淀物溶解在其中，先向其中加10mg风味蛋白酶搅拌酶解4h，后再加10mg蛋白酶e搅拌酶解4h，酶解温度为40℃，酶解后4000rpm离心15min取上清，得到上清液2；

(3)取步骤(2)离心后的沉淀物重复步骤(2)中的操作进行酶解，酶解后4000rpm离心15min取上清，得到上清液3；

(4)将沉淀重复上述的酶解过程，再离心取上清，将上清液合并测定一次，二次，三次酶解硒提取效率。

(5)收集各步得到的上清液经0.45μm一次性尼龙滤头过膜，浓缩后的溶液注入gpc系统进行分离，收集小分子馏分，浓缩后采用hplc-hg-afs测定各硒形态含量。

在一次酶解后硒提取效率依然不是很高，但延长时间又会导致四价硒的转化，所以采取多次酶解法，即将第一次酶解的沉淀物再次进行之前的酶解，图4为对比例3中不同酶解次数下硒提取率。从图4中可以看出第二次酶解后提取率升高，将沉淀物再次酶解可以提取其中其中残余的硒。但在第三次时就没有了明显的变化，为了节约实验时间，所以最后选择两次酶解法来对碎米荠中的形态提取。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。