DAAM1蛋白在制备肾透明细胞癌诊断及预后评估试剂盒中的应用的制作方法

daam1蛋白在制备肾透明细胞癌诊断及预后评估试剂盒中的应用
技术领域
[0001]
本发明涉及生物技术领域，具体地说，是daam1蛋白在制备肾透明细胞癌诊断和预后评估试剂盒中的应用。


背景技术：

[0002]
肾细胞癌是起源于肾上皮细胞的恶性肿瘤，简称为肾癌，约占成人恶性肿瘤的2％～3％。2018年肾癌占全球新发肿瘤的2.2％，死亡率约为1.8％。在泌尿系统肿瘤中，肾癌的发病率仅次于膀胱癌；肾透明细胞癌是肾癌最常见的病理类型，约占80％左右。我国是世界上肾癌发病最多的国家，男性发病率大约是女性的两倍。近年来，肾癌的发病率逐年上升，并且逐渐低龄化。对于早期肾癌，手术切除是主要的治疗手段，且大部分早期肾癌的患者可通过手术治疗得到根治。然而，由于肾癌早期症状不明显，在确诊时通常就有20～30％的患者存在转移性病变，错过了手术最佳时间。
[0003]
目前临床上尚无早期筛查肾透明细胞癌的特异性工具。随着影像学的发展，尤其是超声的广泛应用和ct检测的普及，越来越多的肾癌被早期诊断。但是依然有相当多的患者发现时已经是晚期或者局部晚期，单纯手术预后差。肾透明细胞癌具有较高的恶性倾向，25％-30％的患者确诊时已是晚期。肾癌恶性程度和分期通常决定其手术方式，术前影像学检查只能判别其临床分期，尚不能提示肿瘤恶性程度。所以对肾透明细胞癌患者的早期诊断对于该病的恶性程度辨别及预后复发判断的十分重要，但是目前对于肾透明细胞癌乃至多数实体瘤来说尚未找到合适的早期诊断和预后随访生物标志物。
[0004]
因此，寻找新的诊断和预后评估生物标志物是目前该领域急需解决的问题。
[0005]
形态发生紊乱关联激活因子1(disheveled-associated activator of morphogenesis 1，daam1)是形成素蛋白家族的成员，此蛋白含有1068个氨基酸并在人类各组织中广泛表达。目前，尚无daam1在肾透明细胞癌中相关的研究报道，并且目前还未见daam1蛋白在制备肾透明细胞癌诊断或预测肾透明细胞癌患者预后的应用的研究报道。


技术实现要素：

[0006]
技术问题：本发明的目的在于提供daam1蛋白的新应用，特别是在制备肾透明细胞癌诊断和预后评估试剂盒中的应用。
[0007]
技术方案：本发明提供daam1蛋白在制备肾透明细胞癌诊断和/或预后评估试剂盒中的应用。
[0008]
本发明还提供了肾透明细胞癌诊断和/或预后评估试剂盒，包括daam1单克隆抗体或多克隆抗体，以及免疫组化试剂。
[0009]
本发明还提供了一种肾透明细胞癌诊断和/或预后评估试剂盒，包括daam1单克隆抗体或多克隆抗体，3％h2o2溶液，1％bsa封闭液，dab显色试剂，苏木素，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg，二甲苯，乙醇。
[0010]
本发明还提供了检测daam1蛋白在肾透明细胞癌患者肿瘤组织中的表达量的方法，包括以下步骤：利用免疫组化试剂将肾透明细胞癌组织切片进行免疫组化染色；利用显微镜和成像装置拍摄为数码照片；根据半定量评分原则，给出免疫反应性得分irs(immunoreactivity score)。
[0011]
优选地，所述免疫组化试剂包括二甲苯、乙醇、3％h2o2溶液、1％bsa封闭液、dab显色试剂、苏木素和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg。
[0012]
本发明还提供了一种检测daam1蛋白在肾透明细胞癌患者肿瘤组织中的表达量的方法，包括以下步骤：
[0013]
(1)利用免疫组化试剂将肾透明细胞癌组织切片进行免疫组化染色：
[0014]
(1.1)制备肾透明细胞癌组织石蜡切片，60℃烤箱过夜；
[0015]
(1.2)肾透明细胞癌组织石蜡切片脱腊，方法为：二甲苯
ⅰ①
10min
→
二甲苯
ⅱ②
10min
→
二甲苯
ⅲ③
10min
→
100％乙醇5min
→
95％乙醇5min
→
85％乙醇5min
→
75％乙醇5min
→
双蒸水5min；
[0016]
(1.3)灭活酶：在脱蜡后的肾透明细胞癌组织石蜡切片上滴加3％h2o2溶液，室温放置20min；双蒸水洗5min，重复三次；
[0017]
(1.4)抗原修复：将肾透明细胞癌组织石蜡切片放入1
×
edta抗原修复液(ph9.0)中煮沸30min；自然冷却至室温，双蒸水洗5min，重复三次；
[0018]
(1.5)将肾透明细胞癌组织石蜡切片在37℃下用1％bsa封闭30min；
[0019]
(1.6)甩去封闭液，不洗，直接加一抗(兔daam1单克隆抗体，购自proteintech公司，稀释比例1：500)；置入湿盒中4℃冰箱过夜16小时；
[0020]
(1.7)4℃取出，室温复温15min，然后0.01m pbs洗5min，重复4次；
[0021]
(1.8)滴加二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗鼠igg，购自江苏凯基生物技术有限公司，稀释比例1：200)，37℃下处理45min；
[0022]
(1.9)0.01m pbs洗5min，重复4次；dab显色2-10min，镜下观察；
[0023]
(1.10)双蒸水终止显色，苏木素复染10s；分化后自来水返蓝，蒸馏水浸泡；脱水透明，盖玻片覆盖；
[0024]
(2)利用显微镜和成像装置拍摄为数码照片：显微镜下观察阳性染色，于肾透明细胞癌组织随机选取3个视野并拍照；
[0025]
(3)根据半定量评分原则，给出免疫反应性得分irs：
[0026]
(3.1)采用高倍镜下综合染色强度和阳性细胞所占比例进行半定量测定；
[0027]
(3.2)评分方法如下：染色强度评分标准：阴性0分，弱阳性1分，中等阳性2分，强阳性3分；阳性细胞所占比例评分标准：0分：<1％，1分：1％-25％，2分：26％-50％，3分：51％-75％，4分：>76％；染色强度评分与阳性细胞所占比例评分相乘，得出irs评分，范围0-12分。
[0028]
作为改进，根据irs评分判定daam1蛋白在肾透明细胞癌患者肿瘤组织中的表达量标准：irs低于及等于3分为低表达，irs高于4分为高表达。
[0029]
有益效果：本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测daam1蛋白在肾透明细胞癌患者肿瘤组织中的表达量，基于daam1蛋白的表达量与肾透明细胞癌的这种相关性，以该蛋白作为分子标志物，对其表达量进行检测可以作为用于诊断穿刺或外科手术所获取的组织是否为肾透明细胞癌。此外，daam1蛋白表达与病理分级有关，
daam1蛋白高表达的肾透明细胞癌患者预后较差，而daam1蛋白低表达的肾透明细胞癌患者预后较好。
[0030]
正是基于以上发现本发明提供了daam1蛋白在制备肾透明细胞癌诊断和预后评估试剂盒中的应用，将daam1蛋白作为分子标记，利用daam1单克隆抗体或多克隆抗体，以及免疫组化试剂，分析daam1蛋白在肾透明细胞癌患者肿瘤组织中的表达量，评估肾透明细胞癌患者的预后。
[0031]
本发明daam1蛋白与肾透明细胞癌相关性的发现为肾透明细胞癌诊断和预后评估提供了全新的生物标志物。肾透明细胞癌患者的肿瘤组织中daam1蛋白的表达显著下调，通过检测daam1蛋白表达，可以作为辅助诊断肾透明细胞癌的依据。此外，高表达daam1蛋白肾透明细胞癌的患者，其预后相较于低表达的患者显著较差。因此，检测daam1表达对于肾透明细胞癌患者诊断和预后评估具有重要的指导意义。
附图说明
[0032]
图1为肾透明细胞癌芯片(hkidcrc060cs01，32例肿瘤组织，28例癌旁组织)癌组织及癌旁正常组织中daam1蛋白的免疫组化染色的代表性图(左)、统计图(中)及roc曲线图(右)。可见肿瘤组织中daam1蛋白表达显著下调，以irs7分(<7vs.≥7)为诊断分界点，敏感性81.25％，特异性96.43％。
[0033]
图2为肾透明细胞癌芯片(hkidcrcc150cs01，75例肿瘤组织，75例癌旁组织)癌组织及癌旁正常组织中daam1蛋白的免疫组化染色的代表性图(左)、统计图(中)及roc曲线图(右)。可见肿瘤组织中daam1蛋白表达显著下调，以irs7分(<7vs.≥7)为诊断分界点，敏感性85.33％，特异性98.67％。
[0034]
图3为两张肾透明细胞癌芯片(107例肿瘤组织，103例癌旁组织)癌组织及癌旁正常组织中daam1蛋白的免疫组化染色的统计图(左)及roc曲线图(右)。可见肿瘤组织中daam1蛋白表达显著下调，以irs7分(<7vs.≥7)为诊断分界点，敏感性84.11％，特异性98.06％。
[0035]
图4为肾透明细胞癌芯片(hkidcrcc150cs01)不同病理分级的肿瘤组织中daam1蛋白的免疫组化染色的代表性图(左)及统计图(右)。高分化组：39例，低分化组：36例。
[0036]
图5为肾透明细胞癌患者daam1蛋白低表达组和高表达组的生存分析图，可见daam1蛋白高表达组中的患者预后较差。低表达组：20例，高表达组：23例。
具体实施方式
[0037]
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
[0038]
采用本发明方法制得试剂盒，配方为：包括daam1单克隆抗体或多克隆抗体，3％h2o2溶液，1％bsa封闭液，dab显色试剂，苏木素，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg，二甲苯，乙醇。
[0039]
利用上述试剂盒开展实施例相关实验。
[0040]
实施例1
[0041]
从上海芯超生物科技有限公司购买肾透明细胞癌芯片hkidcrc060cs01(32例肿瘤组织，28例癌旁组织)。采用免疫组化方法检测daam1蛋白在肾透明细胞癌患者癌组织及癌
旁正常组织中的表达量并计算免疫组化评分，具体步骤如下：
[0042]
(1)切片脱腊：二甲苯
ⅰ①
10min
→
二甲苯
ⅱ②
10min
→
二甲苯
ⅲ③
10min
→
100％乙醇5min
→
95％乙醇5min
→
85％乙醇5min
→
75％乙醇5min
→
双蒸水5min
[0043]
(2)灭活酶：在预处理后的切片上滴加3％h 2o 2溶液，室温放置20min；
[0044]
(3)双蒸水洗5min
×
3；
[0045]
(4)抗原修复：切片放入1
×
edta抗原修复液(ph9.0)中煮沸30min；
[0046]
(5)自然冷却至室温，双蒸水洗5min
×
3；
[0047]
(6)1％bsa封闭30min，37℃；
[0048]
(7)甩去封闭液，不洗，直接加一抗(兔daam1单克隆抗体，购自proteintech公司，稀释比例1：500)。置入湿盒中4℃冰箱过夜16小时；
[0049]
(8)4℃取出，室温复温15min，然后0.01m pbs洗5min
×
4；
[0050]
(9)滴加二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗鼠igg，购自江苏凯基生物技术有限公司，稀释比例1：200)45min，37℃；
[0051]
(10)0.01m pbs洗5min
×
4，dab显色2-10min，镜下观察；
[0052]
(11)双蒸水终止显色，苏木素复染10秒；
[0053]
(12)分化后自来水返蓝，蒸馏水浸泡；
[0054]
(13)脱水透明，盖玻片覆盖；
[0055]
(14)显微镜下观察阳性染色，于肾透明细胞癌组织随机选取3个视野并拍照；
[0056]
(15)采用高倍镜下综合染色强度和阳性细胞所占比例进行半定量测定。具体评分如下：
[0057]
1.染色强度评分标准：阴性0分，弱阳性1分，中等阳性2分，强阳性3分。
[0058]
2.阳性细胞所占比例评分标准：0分：<1％，1分：1％-25％，2分：26％-50％，3分：51％-75％，4分：>76％。
[0059]
3.染色强度评分与阳性细胞所占比例评分相乘，得出irs评分，范围0-12分。
[0060]
采用以上免疫组化方法的试验步骤检测daam1蛋白在肾透明细胞癌组织及癌旁正常组织中表达情况，并依据评分标准进行评分。结果表明可见肿瘤组织中daam1蛋白表达显著下调，以irs7分(<7vs.≥7)为诊断分界点，敏感性81.25％，特异性96.43％(见图1)。
[0061]
实施例2
[0062]
从上海芯超生物科技有限公司购买肾透明细胞癌hkidcrcc150cs01(75例肿瘤组织，75例癌旁组织，其中43例附带总生存期随访信息)。采用免疫组化方法检测daam1蛋白在肾透明细胞癌患者癌组织及癌旁正常组织中的表达量并计算免疫组化评分，具体步骤如下：
[0063]
(1)切片脱腊：二甲苯
ⅰ①
10min
→
二甲苯
ⅱ②
10min
→
二甲苯
ⅲ③
10min
→
100％乙醇5min
→
95％乙醇5min
→
85％乙醇5min
→
75％乙醇5min
→
双蒸水5min
[0064]
(2)灭活酶：在预处理后的切片上滴加3％h 2o 2溶液，室温放置20min；
[0065]
(3)双蒸水洗5min
×
3；
[0066]
(4)抗原修复：切片放入1
×
edta抗原修复液(ph9.0)中煮沸30min；
[0067]
(5)自然冷却至室温，双蒸水洗5min
×
3；
[0068]
(6)1％bsa封闭30min，37℃；
[0069]
(7)甩去封闭液，不洗，直接加一抗(兔daam1单克隆抗体，购自proteintech公司，稀释比例1：500)。置入湿盒中4℃冰箱过夜16小时；
[0070]
(8)4℃取出，室温复温15min，然后0.01m pbs洗5min
×
4；
[0071]
(9)滴加二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗鼠igg，购自江苏凯基生物技术有限公司，稀释比例1：200)45min，37℃；
[0072]
(10)0.01m pbs洗5min
×
4，dab显色2-10min，镜下观察；
[0073]
(11)双蒸水终止显色，苏木素复染10秒；
[0074]
(12)分化后自来水返蓝，蒸馏水浸泡；
[0075]
(13)脱水透明，盖玻片覆盖；
[0076]
(14)显微镜下观察阳性染色，于肾透明细胞癌组织随机选取3个视野并拍照；
[0077]
(15)采用高倍镜下综合染色强度和阳性细胞所占比例进行半定量测定。具体评分如下：
[0078]
1.染色强度评分标准：阴性0分，弱阳性1分，中等阳性2分，强阳性3分。
[0079]
2.阳性细胞所占比例评分标准：0分：<1％，1分：1％-25％，2分：26％-50％，3分：51％-75％，4分：>76％。
[0080]
3.染色强度评分与阳性细胞所占比例评分相乘，得出irs评分，范围0-12分。
[0081]
采用以上免疫组化方法的试验步骤检测daam1蛋白在肾透明细胞癌组织及癌旁正常组织中表达情况，并依据评分标准进行评分。结果表明可见肿瘤组织中daam1蛋白表达显著下调，以irs7分(<7vs.≥7)为诊断分界点，敏感性85.33％，特异性98.67％(见图2)。两款芯片合并分析结果：以irs7分(<7vs.≥7)为诊断分界点，敏感性84.11％，特异性98.06％(见图3)。irs低于及等于3分为低表达，irs高于4分为高表达，肾透明细胞癌组织中daam1高表达与病理分级和生存状态密切相关(见表1)，低分化肿瘤组织中daam1蛋白表达较高(见图4)。此外，daam1高表达的肾透明细胞癌患者预后较差(见图5)。
[0082]
表1.hkidcrcc150cs01芯片中肾透明细胞癌患者daam1表达与临床病理特征的相关性研究
[0083][0084]
由以上试验结果可知，通过采用免疫组化的方法检测daam1蛋白分子表达量，结果表明daam1蛋白的表达量与肾透明细胞癌患者的预后具有相关性，因此，以daam1蛋白作为分子标志物，对其表达量进行检测能指导肾透明细胞癌诊断或预后评估。相应的，特异性抗daam1蛋白的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，能用于制备判定肾透明细胞诊断或预后评估的试剂盒，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。
[0085]
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。