一种基于Fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器的制备方法及其应用与流程

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器的制备方法及其应用。

背景技术：

随着生活条件的改善和科学技术的发展，食品安全和环境保护日益受到世界各个国家的重视。霉菌毒素是真菌产生的有毒的次生代谢产物，可以感染多种食物并在其中繁殖。在霉菌毒素中，黄曲霉毒素(af)是剧毒的天然化合物，引起了广泛关注，污染了包括坚果和玉米在内的多种重要农产品。af有不同类型：afb1，afb2，afm1，afm2，afg1和afg2。其中，黄曲霉毒素b1(afb1)是最具毒性的，也是最强的天然致癌物之一。

到目前为止，已经开发了几种afb1的分析方法，例如液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)，荧光(fl)，电致发光(ecl)，光电化学(pec)和电化学传感。这些用于定量测定的方法在很大程度上依赖于单输出模式，受到背景信号高，假阳性信号，外部抗干扰能力差或不同实验环境的局限，从而影响检测结果的准确性。为了提高实验结果的准确性，基于多信号输出的双模式分析方法已成为研究热点。例如，linetal.提出利用ru(phen)3²⁺-dna与mb-dna分别作为电化学发光与电化学信号，构建适配体传感器并成功应用于对ota的分析，准确度有提升，但是稳定性不高；因此，亟需研究一种集高稳定性、高选择性、高灵敏度、低干扰等优点为一体检测afb1的传感器。

技术实现要素：

本文旨在发明一种集高稳定性、高选择性、高灵敏度、低干扰等优点为一体的双模式电化学-电化学发光生物传感器直接检测afb1；提出了一种新型双模式电化学-电化学发光生物传感器的构建方法，实现对afb1的检测。

本发明介绍了一种自增强电化学发光材料sio2@ru-ngqds，利用nafion膜将球形sio2@ru-ngqds材料固定在干净的玻碳电极表面。然后将aunps组装在修饰的玻碳电极表面，并通过au-s共价作用，适配体互补链被固定。进一步引入被二茂铁标记的适配体，通过碱基互补配对组装，获得二茂铁电化学信号的同时也获得增强的电化学发光信号。最终，获得新型双模式电化学-电化学发光生物传感器，用于对实际样品灵敏、快速的分析。

通过如下技术方案实现本发明的目的：

本发明首先提供一种基于fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器的制备方法，步骤如下：

(1)自增强电化学发光材料sio2@ru-ngqds的制备：

首先，将一定量的三联吡啶钌水溶液(ru(bpy)3²⁺)与石墨烯量子点水溶液(ngqds)混合后，在黑暗环境中进行第一次搅拌，加入环己烷、曲拉通和己醇，进行第二次搅拌，在搅拌条件下加入硅酸四乙酯、氨水，然后再进行密封搅拌，所得混合溶液加入丙酮后进行离心，所得固体分别用超纯水、乙醇清洗，得到材料记为sio2@ru-ngqds，将所得材料烘干称量，分散在超纯水中，得到sio2@ru-ngqds水溶液，备用；

(2)将玻碳电极依次用不同粒径的三氧化二铝粉末打磨，分别在乙醇和水中超声30s后于空气中干燥，得到处理后的玻碳电极；

(3)将步骤(1)制备的自增强电化学发光材料sio2@ru-ngqds水溶液修饰到步骤(2)处理后的玻碳电极表面，用nafion膜固定，修饰后的玻碳电极记为sio2@ru-ngqd/gce；

(4)将金纳米粒子(aunps)修饰在步骤(3)所制得的sio2@ru-ngqd/gce材料的电极表面，在室温下自然晾干，修饰后的材料记为aunps/sio2@ru-ngqd/gce；

(5)取被巯基修饰的适配体互补链，记为cdna；将cdna固定在步骤(4)得到的aunps/sio2@ru-ngqd/gce材料的电极表面，并进行孵育，孵育后的材料记为cdna/aunps/sio2@ru-ngqd/gce；

(6)二茂铁(fc)标记的afb1适配体，记为fc-apt；将fc-apt修饰在步骤(5)中cdna/aunps/sio2@ru-ngqd/gce材料的电极表面，孵育后即得到基于fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器，记为fc-apt/cdna/aunps/sio2@ru-ngqd/gce。

优选的，步骤(1)中，所述三联吡啶钌水溶液的浓度为10mm，石墨烯量子点水溶液的浓度为10mg·ml^-1；所述三联吡啶钌水溶液与石墨烯量子点水溶液的体积比为1:5；所述三联吡啶钌水溶液、环己烷、曲拉通、己醇、硅酸四乙酯和氨水的用量比为170μl:7.5ml:1.77ml:1.8ml:100μl:60μl；所述离心的转速为8000rpm，时间为10～15min。

优选的，步骤(1)中，所述第一次搅拌的时间为12～14h；所述第二次搅拌的时间为30～40min；所述密封搅拌的时间为22～24h。

优选的，步骤(1)中，所述混合溶液与丙酮的体积比为1:2；所述sio2@ru-ngqds水溶液的浓度为8mg/ml-14mg/ml。

优选的，步骤(2)中，所述玻碳电极的直径d＝3mm；所用的三氧化二铝粉末的粒径依次为0.3μm、0.05μm。

优选的，步骤(3)中，所述sio2@ru-ngqds水溶液的用量为4～6μl。

优选的，步骤(4)中，aunps用量为5～7μl。

优选的，步骤(5)中，所述cdna用量为6～8μl，浓度为5μm；所述孵育的温度为4℃，孵育时间为12～14h。

优选的，步骤(6)中，所述fc-apt用量为6μl，浓度为5μm；所述孵育的温度为4℃，孵育的时间为80～100min。

本发明还涉及一种基于fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器检测afb1的用途，步骤如下：

(1)在上述制得的fc-apt/cdna/aunps/sio2@ru-ngqd/gce传感器表面依次修饰v1体积不同浓度的afb1溶液；室温下孵育时后用tris-hcl(ph＝7.4)溶液对电极进行清洗，一个浓度的afb1溶液对应修饰一个电化学生物传感器，浓度和电化学生物传感器呈一一对应关系；

(2)标准曲线的构建：以步骤(1)修饰后传感器为工作电极，饱和ag/agcl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，由型号为chi750e的电化学工作站记录与检测电化学信号；在0.1mpbs(ph＝7.0)缓冲溶液中进行测试；扫描电压范围-0.8-0.8v，振幅为0.025v，频率为25hz；每一个浓度的afb1会对应一个电流值，根据电流值和afb1浓度的对数构建得到标准曲线；

(3)样品中afb1的检测：首先获取样品液，修饰v1体积的样品液于传感器表面，通过电化学测试得到相应的电流值；将电流值代入步骤(2)构建的标准曲线，即可获知样品中afb1的浓度；实现未知样品中afb1检测的用途。

进一步地，步骤(1)中，所述afb1溶液的浓度为3×10^-5ng/ml-3×10³ng/ml；所述孵育时间为40-150min。

进一步地，步骤(1)和(3)中v1修饰的体积均为6μl。

本发明的有益效果：

(1)本发明的双模式电化学-电化学发光生物传感器可获得两个检测信号，信息量大，精准度、可信度高。

(2)本发明将fc-apt作为放大电化学发光信号的材料，提高了传感器的灵敏度。

(3)本发明引入特异性识别元件afb1的适配体，提高了双模式电化学-电化学发光生物传感器的选择性，降低了与afb1同时存在毒素的干扰，实现对afb1的特异性分析。

(4)本发明构建的双模式电化学-电化学发光生物传感器用于afb1的检测，灵敏度高、选择性好、稳定性好，线性范围宽，为0.00003-3000ng·ml^-1。

附图说明

图1中(a)为自增强材料sio2@ru-ngqds的sem图；(b)为不同材料的的荧光光谱图；其中a为ru(bpy)3²⁺、b为sio2@ru、c为sio2@ru-ngqds、d为ngqds。

图2为传感器构建过程的ecl信号变化图，其中a为sio2@ru-ngqds/gce、

b为aunps/sio2@ru-ngqds/gce、

c为cdna/aunps/sio2@ru-ngqds/gce、

d为mch/cdna/aunps/sio2@ru-ngqds/gce、

e为fc-apt/mch/cdna/aunps/sio2@ru-ngqds/gce、

f为afb1/fc-apt/mch/cdna/aunps/sio2@ru-ngqds/gce。

图3为双模式电化学-电化学发光生物传感器对浓度为0ng·ml^-1(a)、0.1ng·ml^-1(b)、10ng·ml^-1(c)afb1的(a)dpv与(b)ecl响应的可行性图谱。

图4中(a)为电化学发光生物传感器对不同浓度afb1的响应图；(b)为电化学生物传感器对不同浓度afb1的响应图；(c)为afb1浓度取对数分别与电化学发光信号变量关系图(a)电化学变量关系图(b)。

具体实施方式：

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：实施例在本发明的技术方案为前提下进行，给出了详细实施步骤和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：

(1)自增强电化学发光材料sio2@ru-ngqds的制备：

首先，将10mm的170μl的三联吡啶钌(ru(bpy)3²⁺)与10mg·ml^-1850μl石墨烯量子点(ngqds)在黑暗环境中搅拌一夜(12h)，之后迅速加入7.5ml环己烷、1.77ml曲拉通和1.8ml己醇，并不断搅拌30min；然后快速加入100μl硅酸四乙酯、60μl氨水，密封搅拌24h，得到混合液；最后加入2倍混合液体积的丙酮进行分离，分别用超纯水水、乙醇洗3次，将所得材料分散在600μl超纯水中，冰箱4℃储存备用；

(2)将玻碳电极(d＝3mm，gce)依次用0.3μm和0.05μm的三氧化二铝粉末打磨，分别在在乙醇和水中超声30s后于空气中干燥；

(3)将步骤(1)制备的自增强电化学发光材料4μlsio2@ru-ngqds水溶液修饰到步骤(2)所制得的玻碳电极表面，用nafion膜固定，在室温下自然晾干，此时传感器表示为sio2@ru-ngqd/gce；

(4)将7μlaunps修饰在步骤(3)所制得的传感器表面，在室温下自然晾干，此时传感器表示为aunps/sio2@ru-ngqd/gce；

(5)被巯基修饰的适配体互补链浓度为5μm，用量为6μl，通过au-s共价作用固定在步骤(4)电极表面，并在冰箱4℃孵育一夜，此时传感器表示为cdna/aunps/sio2@ru-ngqd/gce。

(6)二茂铁(fc)标记的afb1适配体浓度为5μm，用量为6μl，通过碱基互补配对组装在步骤(5)传感界面，获得ecl信号增强的双模式电化学-电化学发光生物传感器，即基于fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器，记为fc-apt/cdna/aunps/sio2@ru-ngqd/gce。

制得的基于fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器作为工作电极，饱和ag/agcl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，由型号为chi750e的电化学工作站记录与检测电化学信号，型号为mpi-eii的电化学发光仪器记录与检测电化学发光信号。在0.1mpbs(ph＝7.0)缓冲溶液中进行测试。

图1(a)为自增强材料sio2@ru-ngqd的tem图，表明材料sio2@ru-ngqd是球形结构。图1(b)曲线a为ru(bpy)3²⁺荧光发射峰，曲线b为sio2@ru的荧光发射峰，曲线c为sio2@ru-ngqd荧光发射峰，曲线d为ngqd荧光发射峰；证明自增强材料sio2@ru-ngqd制备成功。

图2为传感器构建过程的ecl信号变化图，fc-apt组装在被修饰的电极表面后，ecl信号迅速增强，证明fc-apt对材料sio2@ru-ngqd的ecl信号有增强作用。

基于fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器的后续研究；

(1)对制备的双模式电化学-电化学发光生物传感器的可行性进行研究：

将浓度为0.1ng·ml^-1、10ng·ml^-1的afb1自组装在实施例1制备生物传感器表面，并在室温下进行孵育，并观察afb1对ec、ecl信号的影响；如图3所示：其中(a)为不同浓度afb1对电化学信号的影响；(b)为不同浓度afb1对电化学发光信号的影响；通过图3可知，随着afb1浓度的增大，ec、ecl信号呈现逐渐降低的变化，证明传感器可行。

(2)双模式电化学-电化学发光生物传感器的性能研究：

分别用3×10^-5、1×10^-4、1×10^-3、1×10^-2、1×10^-1、1、10、1×10²、1×10³、3×10³ng·ml^-1的afb1修饰实施例1所获得的双输出模式传感器，在最佳实验条件下，由型号为mpi-eii的电化学发光仪器记录与检测电化学发光信号的变化(图4a)，型号为chi750e的电化学工作站记录与检测电化学峰电流的变化(图4b)，并得到两种信号(峰强度、峰电流)对不同浓度afb1的响应。随着afb1浓度的增加，电化学发光信号降低，并且在afb1浓度为3×10^-5-1×10²ng·ml^-1范围内与获得的电化学发光信号呈线性关系(图4a)；afb1浓度为1×10^-3-3×10³ng·ml^-1范围内与获得的电化学信号呈线性关系。具体的线性关系图如4c所示。证明双模式电化学-电化学发光生物传感器具有较宽的线性范围，可实现对afb1的精准分析。

基于此线性关系，对实际样品花生中afb1进行了分析：首先获取花生样品液，修饰样品液于传感器表面，通过电化学测试得到相应的电流值；将电流值代入构建的标准曲线，即可获知样品中afb1的浓度；实现未知样品中afb1检测的用途。

分析结果如表1所示。

利用两种传感方法对实际样品花生中不同浓度的afb1进行了分析，回收率分别在93.0-99.3％与85.0-99.1％之间。与国标方法hplc-fl相比(75.8-99.0％)，提出的双模式电化学-电化学发光生物传感器对于实际样品花生中afb1的分析可靠性较高。

说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。