基于免疫层析技术的检测方法及应用与流程

1.本发明涉及生物免疫检测领域，特别涉及基于免疫层析技术的检测方法及应用。


背景技术：

2.胶体金免疫层析技术主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，出现红色或粉红色斑点，通过肉眼观察膜条上的显色条带实现对待测物的分析。肉眼判读主要是和标准比色卡进行比对，检测速度慢、自动化程度低，且检测人员的主观性大，无法保证检测条件一致性，误差率大。通过光敏电阻测量、反射光纤传感器测量反射光强、图像传感器采集图像等方式进行定量分析，是免疫层析检测设备中近年发展的热点和趋势，其中，利用图像处理获得检测线与质控线的灰度值，计算样品溶液的浓度是目前的主流方法。
3.目前，现有定量检测仪采用的检测方法为：将检测线和质控线信号值之比t/c与样本浓度值关联起来，形成信号值与样本浓度值曲线关系图，以此计算样本实际浓度，如专利cn105785009b。检测线上标记物的量与被测样本浓度成一定比例。质控线信号值保持不变，与被测样本浓度无关，质控线上标记物的有无仅代表样本层析顺利与否。实验证明，检测线信号值随着样本浓度的升高而升高，并在升高到一定程度后趋于不变，当样品浓度超过一定值时，t/c变化开始不明显，仪器不能准确分析信号值所对应的样本浓度。当样品浓度较低或介于临界值时，显色较浅，结果难以判读，定量检测范围受限。
4.另一方面，胶体金免疫层析技术在制备、保存、分析等各个环节都会受到种种因素的影响和制约。例如，胶体金的颗粒均匀性、分散度会影响试验的稳定性和重复性，如果金颗粒的形状不规则或粒径不均一，使得胶体金标记物容易解离和沉淀二产生金标扩散不完全、反应区底色过深；胶体金质量不好，胶体金结合物不能快速而完整的从玻璃纤维上解离。在利用图像法进行分析时，由于测定样品中存在核酸、蛋白质和组织碎片等基质干扰。此外还有生化反应的偶然性的影响，图像质量会受到一些干扰，导致结果存在误差。
5.在某些情况下，胶体金免疫层析法的测量过程可能会出现漏检或检测失败的情况，如假阳性和假阴性，此时，需要结合质谱等其他精准定量的实验室设备才能验证是否存在误报,在毒品筛查、食品安全、通关查验等领域，将极大的影响监管和执法工作。


技术实现要素：

6.为解决上述现有技术方案中的不足，本发明提供了一种误差小、准确性好的基于免疫层析技术的检测方法。
7.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
8.基于免疫层析技术的检测方法，所述基于免疫层析技术的检测方法包括以下步骤：
9.(a1)样品溶液施加到试纸上，样品全部地与标记物偶联抗体或抗原结合，形成复合物；
10.(a2)复合物和剩余的标记物偶联抗体或抗原前移，所述复合物全部地与检测线上的抗原或抗体结合，并固定在所述检测线上，并显色；
11.(a3)所述剩余的标记物偶联抗体或抗原前移，并全部地与对照线上的抗原或抗体结合，形成的复合物固定在所述对照线上，并显色；
12.(a4)获得对应所述检测线的信号值a0和对应所述对照线的信号值b0；
13.(a5)根据所述信号值a0以及信号值a
‑
浓度值α间的映射关系获得所述样品的第一浓度值α1；
14.根据所述信号值b0以及信号值b
‑
浓度值α间的映射关系获得所述样品的第二浓度值α2；
15.获得
16.(a6)获得所处的浓度区间t
i
，并比较h和所处的浓度区间t
i
对应的阈值h
i
，i＝1,2，
···
n；待测物的浓度范围被划分为n个浓度区间t，每一浓度区间对应阈值h，n为大于2的整数；随着浓度区间内浓度的变大，浓度区间对应的阈值变小；
17.若h≤h
i
，所述样品的浓度
18.若h＞h
i
，重新检测。
19.本发明的另一目的还在于提供了根据本发明的基于免疫层析技术的检测方法在检测生物分子中的应用。
20.与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
21.1.误差小；
22.本发明将直接测得的样本浓度和由(未结合样本)剩余的标记物偶联抗体或抗原含量反推获得的样本浓度相结合，计算样品浓度，降低样品基质、标记物均匀度、生化反应等因素对实验结果的影响，显著地降低了测量误差，拓宽定量检测范围；
23.在样品浓度过高或过低时，避免实验结果受检测线显色不稳定的干扰。
24.2.准确性好；
25.本发明仅需比较检测线与对照线获得的样本浓度，无需借助其他设备验证即可判断是否存在假阳性或假阴性，避免漏检和误报。
附图说明
26.参照附图，本发明的公开内容将变得更易理解。本领域技术人员容易理解的是：这些附图仅仅用于举例说明本发明的技术方案，而并非意在对本发明的保护范围构成限制。图中：
27.图1是根据本发明实施例的基于免疫层析技术的检测方法的流程图；
28.图2是根据本发明实施例的映射关系的示意图。
具体实施方式
29.图1
‑
2和以下说明描述了本发明的可选实施方式以教导本领域技术人员如何实施和再现本发明。为了教导本发明技术方案，已简化或省略了一些常规方面。本领域技术人员
应该理解源自这些实施方式的变型或替换将在本发明的范围内。本领域技术人员应该理解下述特征能够以各种方式组合以形成本发明的多个变型。由此，本发明并不局限于下述可选实施方式，而仅由权利要求和它们的等同物限定。
30.实施例1：
31.图1示意性地给出了本发明实施例的基于免疫层析技术的检测方法的流程图，如图1所示，所述基于免疫层析技术的检测方法包括以下步骤：
32.(a1)样品溶液施加到试纸上，样品全部地与标记物偶联抗体或抗原结合，形成复合物；试纸的结构采用现有技术；
33.(a2)复合物和剩余的标记物偶联抗体或抗原(也即，相对于样品来说，标记物偶联抗体或抗原是过量的)前移，所述复合物全部地与检测线上的抗原或抗体结合，并固定在所述检测线上，并显色；
34.(a3)所述剩余的标记物偶联抗体或抗原前移，并全部地与对照线上的抗原或抗体结合(也即，相对于剩余的标记物偶联抗体或抗原来说，对照线上的抗原或抗体是过量的，或刚好完成结合)，形成的复合物固定在所述对照线上，并显色；
35.(a4)获得对应所述检测线的信号值a0和对应所述对照线的信号值b0；
36.(a5)根据所述信号值a0以及信号值a
‑
浓度值α间的映射关系获得所述样品的第一浓度值α1；
37.根据所述信号值b0以及信号值b
‑
浓度值α间的映射关系获得所述样品的第二浓度值α2；
38.获得
39.(a6)获得所处的浓度区间t
i
，并比较h和所处的浓度区间t
i
对应的阈值h
i
，i＝1,2，
···
n；待测物的浓度范围被划分为n个浓度区间t，每一浓度区间对应阈值h，n为大于2的整数；随着浓度区间内浓度的变大，浓度区间对应的阈值变小；
40.若h≤h
i
，所述样品的浓度
41.若h＞h
i
，重新检测。
42.为了降低误差，进一步地，所述剩余的标记物偶联抗体或抗原与所述检测线上的抗原或抗体不结合；
43.所述样品与所述对照线上的抗体或抗原不结合。
44.为了获得准确的映射关系，进一步地，信号值a
‑
浓度值α间的映射关系以及信号值b
‑
浓度值α间的映射关系的获得方式为：
45.配置m种已知浓度α
i
的待测样品，m为大于5的整数，并按照步骤(a1)
‑
(a5)的方式获得与各待测样品对应的所述检测线的信号值a
i
和所述对照线的信号值b
i
，i＝1,2，
···
m；
46.利用待测样品的浓度α
i
与信号值a
i
间的对应，获得信号值a
‑
浓度值α间的映射关系，如，拟合出的关系式或在坐标系中的绘制出的曲线；
47.利用待测样品的浓度α
i
与信号值b
i
间的对应，获得信号值b
‑
浓度值α间的映射关系，如，拟合出的关系式或在坐标系中的绘制出的曲线。
48.为了反映样品的浓度，进一步地，所述检测线的信号值为所有检测线的信号值之
和；所述对照线的信号值为所有对照线的信号值之和。
49.为了划分浓度区间和设定阈值，进一步地，所述待测物的浓度被划分为4个浓度区间(0,0.1]ng/ml、(0.1,1.0]ng/ml、(1,10]ng/ml、(10,50]ng/ml，对应的阈值分别为1、0.5、0.3、0.2。
50.为了获得准确的信号值，进一步地，所述信号值a为显色后检测线的灰度值或颜色值，所述信号值b为显色后对照线的灰度值或颜色值。
51.实施例2：
52.根据本发明实施例1的基于免疫层析技术的检测方法在毛发中海洛因检测中的应用例。
53.在本应用例中，标记垫中，长度为8
‑
15mm，通过喷涂等方式均匀铺有0.15
‑
2.0μg/cm2的胶体金偶联的标记海洛因抗体；具有二个检测线和第二对照线，检测线包被海洛因合成抗原，含量为0.02
‑
1.0μg/cm，对照线包被羊抗鼠igg抗体，含量为0.1
‑
2.0μg/cm；二个检测线和二个对照线中相邻线间的距离为2
‑
5mm；标记垫上的胶体金偶联的标记海洛因抗体含量低于二个对照线上包被的抗体的含量，高于二个检测线上包被的抗原的含量。
54.在本发明实施例的基于免疫层析技术的海洛因检测方法，包括以下步骤：
55.(a1)将毛发样本剪至长度为5mm的碎片，取约5mg毛发样本，加入1.0ml毛发消解液，震荡30s后，静置1min；用滴管吸取毛发裂解液的上清液，滴加2～5滴至试纸上；
56.样品全部地与标记垫上的标记物偶联抗体或抗原结合，形成复合物；
57.(a2)复合物和剩余的标记物偶联抗体或抗原(也即，相对于样品来说，标记物偶联抗体或抗原是过量的)前移，所述复合物全部地与检测线上的抗原或抗体结合，并固定在所述检测线上，并显色；
58.(a3)所述剩余的标记物偶联抗体或抗原前移，并全部地与对照线上的抗原或抗体结合(也即，相对于剩余的标记物偶联抗体或抗原来说，对照线上的抗原或抗体是过量的)，形成的复合物固定在所述对照线上，并显色；
59.(a4)获得对应所述检测线的信号值a0(二个检测线的信号值之和)和对应所述对照线的信号值b0(二个对照线的信号值之和)；
60.(a5)根据所述信号值a0以及信号值a
‑
浓度值α间的映射关系获得所述样品的第一浓度值α1；
61.根据所述信号值b0以及信号值b
‑
浓度值α间的映射关系获得所述样品的第二浓度值α2；
62.获得δα＝α2‑
α1，
63.上述映射关系的获得，具体为；
64.分别配置浓度为0ng/ml、0.025ng/ml、0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/mgl、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml的海洛因标准品溶液；
65.按照步骤(a1)
‑
(a5)的方式，各层析反应10
‑
15min，同一浓度标准品重复检测五次，检测结果取平均值；
66.在单个或多个发光二级管作为光源的照射下，利用图像采集装置获取各检测线和对照线的图像，识别并截取显色区域，计算显色区域图片中检测线和对照线的灰度值或颜
色值作为信号值，获得与各标准品对应的检测线的信号值a
i
和所述对照线的信号值b
i
，i＝1,2，
···
10；信号值a
i
是二个检测线信号值之和，信号值b
i
是二个对照线信号值之和；
67.利用标准品的浓度α
i
与信号值a
i
间的对应关系，以信号值a
i
为纵坐标，以浓度α
i
为横坐标，在坐标系中的绘制出曲线1，也即获得信号值a
‑
浓度值α间的映射关系，如图2所示；
68.利用标准品的浓度α
i
与信号值b
i
间的对应关系，以信号值b
i
为纵坐标，以浓度α
i
为横坐标，在坐标系中的绘制出曲线2，也即获得信号值b
‑
浓度值α间的映射关系，如图2所示；
69.(a6)获得所处的浓度区间t
i
，并比较h和所处的浓度区间t
i
对应的阈值h
i
，i＝1,2，
···
n；待测物的浓度范围被划分为n个浓度区间t，每一浓度区间对应阈值h，n为大于2的整数；随着浓度区间内浓度的变大，浓度区间对应的阈值变小；本实施例为：所述待测物的浓度被划分为4个浓度区间(0,0.1]ng/ml、(0.1,1.0]ng/ml、(1,10]ng/ml、(10,50]ng/ml，对应的阈值分别为1、0.5、0.3、0.2；
70.若h≤h
i
，所述样品的浓度
71.若h＞h
i
，重新检测。
72.实施例3：
73.根据本发明实施例1的基于免疫层析技术的检测方法在毛发中海洛因检测的应用例，与实施例2不同的是：
74.1.试纸宽度为5mm，检测线仅为1条，对照线仅为1条，标记垫长度为10mm；检测线包被的海洛因合成抗原的含量为0.3μg/cm；对照线上包被的羊抗鼠igg抗体的含量为1.0μg/cm；标记垫均匀铺有0.8μg/cm2胶体金标记海洛因抗体；最低检出限为0.05ng/ml。
75.利用本实施例中的试纸，检测50份海洛因浓度为0.10ng/ml的加标样品和50份不含海洛因的空白样品(如遇无效结果，则重新准备样品检测)。检测结果如下：
[0076][0077]
由上可见，本方法可以有效避免样品浓度过低时引起的假阳性或假阴性，并且减少误差，提高检测结果准确性。
[0078]
实施例4：
[0079]
根据本发明实施例1的基于免疫层析技术的检测方法在诊断甲型流感病毒中的应用例，与实施例2不同的是：
[0080]
标记垫中为胶体金标记兔抗甲型流感病毒抗体单克隆抗体，检测线包被甲型流感病毒抗体，对照线包被羊抗兔igg。
[0081]
实施例5：
[0082]
根据本发明实施例1的基于免疫层析技术的检测方法在诊断乙肝表面抗原中的应用例，与实施例2不同的是：
[0083]
1.检测线为4条，对照线为1条；
[0084]
2.标记垫中为荧光胶乳微粒标记鼠抗乙肝表面抗原单克隆抗体，检测线包被鼠抗乙肝表面抗原单克隆抗体，对照线包被羊抗鼠igg。